一种芸薹链格孢及在制备抑菌剂中的应用的制作方法

本发明涉及一种金黄色葡萄球菌抑菌剂，具体涉及一种内生真菌芸薹链格孢gb.py-f2及在制备抗金黄色葡萄球菌药物的应用。

(二)

背景技术：

银杏是晚古生代的孑遗植物，具有“活化石”的美称，集食用、药用、绿化、观赏为一身。中国银杏种植面积位居世界首位，银杏叶产量约占全球总产量的70％。银杏种子甜而苦，与医药、食品同源，含有多种活性底物，如黄酮类、萜内酯、银杏酸、苯丙酮类、酚类等。因此，它具有促进唾液分泌、止渴祛痘、改善脑功能、增强记忆、治疗阿尔茨海默病、扩张微血管、促进血液循环、平滑血管、治疗脑供血等多种保健功能。银杏果一直被誉为高级滋补品，应用范围从食品领域扩展到医药、保健品、化妆品等领域。内生植物在各种植物中普遍存在。许多内生植物可以产生与宿主植物相同或相似的代谢产物，而且许多代谢产物是尚未发现的新物质。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种芸薹链格孢gb.py-f2及在制备抑菌剂中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种芸薹链格孢(altemariabrassicae)gb.py-f2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccm219126，保藏日期为2019年3月6日，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编：430072。

本发明所述芸薹链格孢gb.py-f2，菌落灰黑色，铺散状，菌落背面为黑色。

本发明还提供一种所述芸薹链格孢gb.py-f2在制备抑菌剂中的应用，所述抑菌剂为金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)抑菌剂，优选金黄色葡萄球菌cmcc(b)26003。

进一步，所述抑菌剂是芸薹链格孢gb.py-f2经发酵培养获得的发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩(优选浓缩至1/4体积)，再用乙酸乙酯萃取(优选萃取至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相)，有机相浓缩至恒重，获得芸薹链格孢gb.py-f2代谢产物，即为抑菌剂。

更进一步，所述抑菌剂按如下方法制备：将芸薹链格孢gb.py-f2接种于发酵培养基中，28℃，180r/min培养7d，获得发酵液；将发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩至原体积的1/4，用1倍体积乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相，浓缩至恒重，获得芸薹链格孢gb.py-f2粗提物，即为抑菌剂；所述发酵培养基组成：硝酸钠3g/l，磷酸氢二钾1g/l，硫酸镁(mgso4·7h2o)0.5g/l，氯化钾0.5g/l，硫酸亚铁0.01g/l，蔗糖30g/l，溶剂为蒸馏水，ph7.0～7.2；利用高压蒸汽灭菌锅对其进行灭菌，条件为121℃，20分钟。

进一步，所述超声破碎条件为：在405w条件下，每工作3s，间歇4s，进行300次循环。

进一步，所述芸薹链格孢gb.py-f2发酵前先活化培养，然后再接入发酵培养基，所述活化培养为：将芸薹链格孢gb.py-f2接种于pda培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养7d；所述pda培养基组成：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂15～20g/l，溶剂为蒸馏水，自然ph。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供一株新菌株--芸薹链格孢gb.py-f2，通过微生物发酵得到具有抑菌活性的成分，芸薹链格孢gb.py-f2代谢产物对金黄色葡萄球菌(cmcc(b)26003)的mic＝1.5625mg/ml。传统抑菌剂为抗生素，国内抗生素滥用情况普遍，现已加大管控，天然的抑菌剂将是未来市场的趋势，该抑菌剂产量大，工艺简单，更加安全，环保。

(四)附图说明

图1为gb.py-f2菌株形态。

图2为gb.py-f2菌株系统发育树。

图3为芸薹链格孢gb.py-f2发酵物乙酸乙酯萃取相的抗真菌活性抑菌圈照片；a为卡那霉素阳性对照；b为空白对照(dmso)；c样品浓度为0.750mg/ml；d样品浓度为1.500mg/ml；e样品浓度为12.500mg/ml；f样品浓度为6.250mg/ml；g样品浓度为3.125mg/ml；h为空白对照(无菌超纯水)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述银杏(学名：ginkgobilobal.)，为银杏科、银杏属落叶乔木。银杏树的种子俗称白果，因此银杏又名白果树。

本发明所述超纯水是指电阻率达到18mω*cm(25℃)的水。水中除了水分子外，几乎没有什么杂质，更没有细菌、病毒、含氯二噁英等有机物，也没有人体所需的矿物质微量元素。

实施例1：芸薹链格孢gb.py-f2的典型分离

1.植物样本采集：新鲜健康的银杏果采于江苏省无锡市惠山大道，银杏果用自来水清洗10分钟，然后用体积浓度75％乙醇水溶液漂洗一次。用质量浓度2％次氯酸钠水溶液浸泡10分钟后，用无菌水反复洗涤种子，再用体积浓度75％乙醇水溶液浸泡10分钟，然后用无菌水漂洗三次，合并漂洗液，用干燥的无菌吸收纸吸去表面水分，获得表面消毒后的银杏果。在超净工作台中，放置pda培养基的无菌平板作为空白对照1，该对照为检查超净工作台的洁净程度；将漂洗液接种于pda培养基的无菌平板作为空白对照2，该对照为漂洗液的检查；将表面消毒后的银杏果，置于pda培养基的无菌平板中滚动后取出，作为空白对照3，该对照为植物组织印迹法筛选无菌的组织块。

2.内生真菌的筛选以及分离纯化：于无菌超净工作台，将步骤1中表面消毒后的银杏果从中间切成薄片，作为无菌组织，然后接种在pda培养基中，在28℃倒置培养，待出现菌丝沿着组织切口向外生长时，与空白对照1、2以及3均进行比较，采用尖端菌丝挑选的方法，将不同形态的菌落划线接种于pda培养基中，待长出单菌落后，将单菌落再次划线接种于无菌pda培养基中，反复多次接种，直到菌落形态一致且只有一种真菌生长时说明纯化完成，得到1株菌株为灰黑色，铺散状，菌落背面为黑色的真菌，见于图1，将该菌株记为菌株gb.py-f2。

pda培养基组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml，自然ph。

3.总dna的提取：将菌株gb.py-f2接种于pda培养基中，于28℃恒温培养箱中倒置培养7d。采用真菌基因组dna快速抽提试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司，产品编号：b518229)以及相关操作说明提取基因组dna：①取50-100mg新鲜真菌或20mg干燥子实体或菌丝，液氮中充分研磨成粉末后放入到1.5ml离心管中，依次加入400μlbufferdigestion和4μlβ-巯基乙醇，震荡混匀。65℃水浴1h至细胞完全裂解。②加入200μlbufferpf，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。③室温10000rpm离心5min，将上清液(500～550μl)转移到新的1.5ml离心管中。④加入等体积的异丙醇，颠倒5～8次使之充分混匀，室温放置2～3min。室温10000rpm离心5min，弃上清。⑤加入1ml75％乙醇，颠倒漂洗1～3min，10,000rpm离心2min，弃上清。⑥重复步骤⑤一次。⑦开盖室温倒置5～10min至残留的乙醇完全挥发。⑧得到的dna用50-100μltebuffer溶解。提取的dna可立即进行下一步实验或-20℃保存。

4.菌株gb.py-f2的its序列扩增：采用真菌扩增通用引物its1(5’-tccgtaggtgaacctgcgc-3’)和its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)扩增内部转录区间序列，反应体系如下：

dna模板1μl、上游引物1μl、下游引物1μl、pcrmix12.5μl、ddh2o9.5μl。

pcr扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃低温保存。

5.pcr反应产物确认：取5μlpcr产物与1μldangreen染料混合后点样于1.2％琼脂糖凝胶，110v条件下电泳15分钟，于凝胶成像系统中观察条带，如出现500bp左右条带，则初步判断扩增成功。

6.pcr反应产物测序：将pcr产物送样生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，菌株gb.py-f2的its序列见seqidno.1所示。

7.数据分析：用blast比对，将菌株gb.py-f2的序列与genbank中的序列进行同源性比对，blast检索表明，菌株gb.py-f2的its序列与芸薹链格孢(altemariabrassicae)(genbank登录号ku204772)的序列相似度为99％，绘制系统发育树，见图2所示。由图2可知支持率为100％，根据基因亲缘性对比，确定菌株gb.py-f2为交链孢酶(altemaria)属，命名为芸薹链格孢(altemariabrassicae)gb.py-f2，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccm219126，保藏日期为2019年3月6日。

实施例2：芸薹链格孢gb.py-f2发酵液抑菌能力筛选

1、菌株复苏活化：将保存在4℃冰箱中的芸薹链格孢gb.py-f2接种于pda培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养7d；

2、芸薹链格孢gb.py-f2代谢产物的制备：在超净工作台中，用无菌打孔器将步骤1的gb.py-f2菌株沿着菌落边缘打直径为5mm的菌饼，接种于含200ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，28℃，180r/min发酵培养7d，以未接种菌饼的发酵培养基为空白对照。取发酵完成的发酵液，采用y92-iidn型超声波细胞粉碎机在405w条件下，每工作3s，间歇4s，进行300次循环对发酵液进超声破壁处理，然后抽滤得滤液，经孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后，微滤液利用旋转蒸发仪将其浓缩至原体积的1/4，获得浓缩液。用1倍体积乙酸乙酯对浓缩液进行多次萃取，直至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相，再次利用旋转蒸发仪将乙酸乙酯萃取相浓缩干燥至恒重，获得芸薹链格孢gb.py-f2代谢产物31.582g，于-20℃保存。

发酵培养基组成：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(mgso4·7h2o)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，蒸馏水1000ml，ph7.0～7.2。

3、抑菌实验：在超净工作台中将金黄色葡萄球菌(cmcc(b)26003，南京茂捷微生物科技有限公司)接种于液体lb培养基中，180r/min，37℃培养1d，作为供试菌；称取步骤2获得的25mg芸薹链格孢gb.py-f2代谢产物，溶于1mldmso中，配置25mg/ml的样品储备液。采用双层平板牛津杯法对抑菌活性进行测定：在超净工作台中，样品储备液经微孔滤膜(0.22μm)过滤后，用无菌超纯水稀释得到浓度为0.750mg/ml、1.500mg/ml、12.500mg/ml、6.250mg/ml、3.125mg/ml的样品。在无菌条件下，将牛津杯放置在无菌平皿中后倒入无菌lb培养基；取另一瓶无菌lb培养基，待其温度冷却至45℃左右，以体积浓度1％(例：100ml培养基，接种量为1ml)的接种量将供试菌接种于其中，摇匀后，倒入已放置牛津杯且底层无菌lb培养基已经凝固的培养皿中，待其冷却凝固用镊子将牛津杯取出后，在孔中加入150μl不同浓度的样品，分别以dmso和无菌超纯水为空白对照，以1.500mg/ml卡那霉素水溶液为阳性对照，将平皿置于37℃恒温培养箱中培养1d，观察芸薹链格孢gb.py-f2代谢产物对供试菌金黄色葡萄球菌cmcc(b)26003的抑制效果，各浓度样品及对照的透明抑菌圈的直径见表1和图3所示，当透明圈直径大于8mm则说明该菌株发酵液中含有抑菌活性成分。

lb培养基组成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，琼脂15g，1000ml去离子水，ph7.0。

lb液体培养基组成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，1000ml离子水，ph7.0。

4、实验结果：芸薹链格孢gb.py-f2的抗真菌活性见图3和表1所示。

表1

实施例3：芸薹链格孢gb.py-f2发酵液对金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度测定供试菌株的活化：将金黄色葡萄球菌cmcc(b)26003接种于无菌的牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3.0g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠5.0g/l、琼脂20g/l，溶剂为蒸馏水，ph7.4～7.6)中，置于37℃倒置培养1d；将活化后的供试菌接种于lb液体培养基中，置于37℃，180r/min的恒温摇床中发酵培养1d，取发酵液用无菌水稀释使得菌悬液浓度为10⁶cfu/ml，作为供试菌液。

称取实施例2方法制备的芸薹链格孢gb.py-f2代谢产物50mg，溶于2mldmso中，配置25mg/ml的储备液，在超净工作台中，储备液经微孔滤膜(0.22μm)过滤后，用无菌水半倍稀释得到不同浓度的样品(12.500，6.250，3.125，1.562，0.781mg/ml)。在无菌条件下，将牛津杯放置在无菌平皿中后将无菌lb培养基倒入平皿；取另一瓶无菌lb培养基，待其温度冷却至45℃左右，以体积浓度1％的接种量将供试菌液接种于其中，摇匀后，倒入已放置牛津杯且底层无菌lb培养基已经凝固的培养皿中，待其冷却凝固用镊子将牛津杯取出后，在孔中加入150μl不同浓度的样品，分别以dmso和无菌超纯水为空白对照，以1.500mg/ml卡那霉素水溶液为阳性对照，将平皿置于37℃恒温培养箱中培养1d，观察各浓度代谢产物对供试菌的抑制效果，记录各浓度样品的透明抑菌圈直径，见表2，当透明圈直径大于8mm则说明该浓度样品有抑菌效果，小于等于8mm则说明该浓度样品中没有抑菌效果，每组实验重复操作3次。

表2

实验结果：

芸薹链格孢gb.py-f2代谢产物对金黄色葡萄球菌(cmcc(b)26003)的mic＝1.5625mg/ml。

序列表

<110>浙江工业大学

<120>一种芸薹链格孢及在制备抑菌剂中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>552

<212>dna

<213>芸薹链格孢(altemariabrassicae)

<400>1

gtaacctgcggagggatcattacacaaatatgaaggcgggctggaacctctcggggttac60

agccttgctgaattattcacccttgtcttttgcgtacttcttgtttccttggtgggttcg120

cccaccactaggacaaacataaaccttttgtaattgcaatcagcgtcagtaacaaattaa180

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aagcatatcaat552