一种室内模拟水华的稳定培养方法与流程

本发明涉及藻类培养方法技术领域，特别的涉及一种室内模拟水华的稳定培养方法。

背景技术：

水华（algalblooms）指淡水水体中藻类大量繁殖的一种自然生态现象，是水体富营养化的一种特征，主要由于生活及工农业生产中含有大量氮、磷的废污水进入水体后，蓝藻（又叫蓝细菌，包括微囊藻、鱼腥藻、颤藻、念珠藻、蓝球藻、发菜等）、绿藻、硅藻等大量繁殖后使水体呈现蓝色或绿色的一种现象。水华是目前全球许多国家所面临的环境问题，在很多富营养的湖泊或水库中，藻类异常繁殖，在局部湖区或库区堆积，并在高温下分解，形成恶臭；特别是当藻类在水源地取水口附近大量集聚时，就有可能引起水源地的水质恶化，危及供水安全。因此，在研究水华治理方法的同时，发展模拟水华并对水华进行预测、预报技术，可提高环境管理部门的决策能力，并有利于相关部门及时采取应急措施应对水华污染。

目前，从野外分离的群体微藻经过室内培养，常以单细胞形式存在。但野外自然条件下，大多数微藻常以群体形式存在，所以室内培养出的微藻与野外微藻生理性能方面存在一定差距，用其来研究水华形成机理及治理措施时往往存在很大的误差。一方面，野外环境条件变化较大，实验室内难以模拟出与野外类似的培养环境；另一方面，野外微藻都是混合藻，环境介质中有浮游动物和细菌，而室内研究采用的是无菌纯培养，缺少种间或种内之间的互惠、共生、竞争、合作等相互作用。此外，微藻受环境条件影响较大，试验时难以捕捉到藻类细胞生理状态，导致传统培养体系在开展微藻生理特性、代谢物质传递及营养盐利用研究具有局限性。但是传统微藻培养采用的是间歇培养，微藻通常经过迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期，体系内环境条件将随着培养时间的变化而变化，故微藻生理特性也会随着培养时间的变化而变化，主要用于纯藻培养。而野外水华由多种微藻组成，周围存在细菌、浮游动物，若采用传统微藻培养方法对其进行培养，体系内微藻生理特性、种类及数量均会处于不断变化中，获得的微藻具有随机性，对于后续实验的进行无法提供生理状态、种类及数量一致的藻源。因此，本领域需要一种混合微藻培养方法，通过模拟水华的培养实现类似于野外水华的稳定培养，为水华形成机理或治理措施的探究提供稳定藻源具有十分重要的作用。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种室内模拟水华的稳定培养方法，解决现有室内培养方法存在获得的微藻种类单一、生理性能与自然水体微藻存在差异，导致微藻研究结果误差大以及难以捕捉到藻类细胞生理状态的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种室内模拟水华的稳定培养方法，包括以下步骤：

1）从野外水华暴发的水体采集微藻，去除肉眼可见的杂质，密封，备用；

2）采集野外自然（水华暴发）水体并经过0.45μm膜过滤后，通过添加硝酸盐和/或磷酸盐，调节所述自然水体的tn为0.5~2.5mg/l和tp为0.05~0.25mg/l，即得到微藻培养液；再在无菌环境下将步骤1）得到的微藻接种到所述微藻培养液中，置于光照培养箱中扩培3~5d，使其适应室内培养环境，同时增大生物量，然后将扩培后的微藻离心弃上清，并用所述微藻培养液润洗2~5次，去除杂质和本底营养盐；

3）将步骤2）得到的微藻接种到恒化器中培养10-15天，即得到稳定的混合微藻。

进一步，本发明采用的恒化器包括密闭设置的反应釜，所述反应釜内具有与釜壁间隔设置的水华培养室，所述水华培养室和釜壁之间形成密闭的水浴腔，所述釜壁的底部和顶部各设置有一个与所述水浴腔连通的水浴口，两个所述水浴口连接有恒温冷水机。采用上述结构，恒温冷水机将从水浴腔返回的循环水加热或冷却至恒定温度后，再次输送至水浴腔，输送至水浴腔的循环水与水华培养室内的微藻培养液进行热量交换后再次回到恒温冷水机加热或冷却，往复循环，对水华培养室内的微藻培养液起到恒温作用。

所述水华培养室内还设置有用于搅拌培养液的搅拌机构；所述反应釜的底部设置有与所述水华培养室相通的通气口，所述通气口通过管道连接有泵气机构；所述培养装置还包括用于输送营养物的进样单元、光源单元和藻液回流单元。

所述进样单元包括进样瓶，所述进样瓶通过管道连接有进样泵并延伸至所述反应釜内，并位于水华培养室的微藻培养液液面上方。这样，当水华培养室内微藻培养液的磷氮营养不适宜时，通过调节进样瓶中的营养物质来调节微藻的生物量或改变优势藻种。

所述藻液回流单元包括密闭设置的回流瓶和过滤瓶，所述回流瓶和过滤瓶通过水系过滤膜连通设置；所述回流瓶上连接有主动回流管道和被动回流管道，所述主动回流管道的一端伸入所述回流瓶的液面下，另一端连接有回流蠕动泵，所述回流蠕动泵通过主动回流管道连接至所述反应釜内，并位于所述水华培养室的微藻培养液的液面上，所述被动回流管道的一端伸入下水华培养室的微藻培养液的液面处，另一端连接至所述回流瓶的液面上方；所述过滤瓶通过管道连接有出水泵，所述管道伸入所述过滤瓶的液面下方。

采用上述结构，当微藻培养液体积增加没过被动回流管道时，过多的微藻培养液会沿被动回流管道从水华培养室排出并直接进入回流瓶，回流瓶与过滤瓶之间以水系过滤膜连通，水系过滤膜只允许回流瓶中的水通过，进入过滤瓶，过滤瓶中过滤水经出水泵进入出水瓶，使过滤瓶和回流瓶之间存在液位差，促进回流瓶中的水进入过滤瓶，而浓缩后的藻液留在回流瓶，回流瓶中的浓缩的藻液可以经过回流泵回流至水华培养室。

作为优选，所述搅拌机构包括可转动地竖向设置在所述水华培养室内的搅拌轴和沿所述搅拌轴径向设置的搅拌件，所述搅拌轴上端延伸至反应釜外，并与电机的输出轴相连接，使搅拌轴在电机的控制下旋转。进一步，所述搅拌件沿搅拌轴周向均布设置的三组双叶叶片；再进一步，所述叶片为45°斜叶，且每组叶片之间互呈60°。

采用上述结构，叶面与运动方向成一定倾斜角，所以在叶片运动时，除有水平环流外，还有轴向分流，增加了搅拌面积和搅拌效率，保证了气液、藻液均匀混合。

作为优选，所述水系过滤膜的孔径为0.45~2μm。

作为优选，所述反应釜的水华培养室中还包括用于混合水华的塑料珠，所述塑料珠的密度与水的密度相接近，能悬浮于培养液中。这样，塑料珠随搅拌叶的转动，而呈悬浮状均匀转动，增加了搅拌面积和搅拌效率，保证了气液、藻液均匀混合。其中，搅拌件的转动速度、塑料球直径及数量根据恒化器尺寸而定，例如采用有效体积为1l的恒化器时，搅拌速度设置为150~250r/min，塑料珠的数量为100~200颗，塑料珠的粒径为10~50mm。

作为优选，所述培养装置中的管道均采用硅胶管，所述硅胶管与瓶之间以胶套方式连接。这样，既保证了反应釜的密闭性，且避免了反应釜内压力过大，保证了培养装置的安全性。

作为优选，所述被动回流管道的一端伸入所述水华培养室内藻液液面处，并且液面未没过被动回流管的开口。这样，当水华培养室内藻液液面升高并没过被动回流管的开口时，过多的藻液通过压力作用沿被动回流管进入回流瓶，回流瓶中浓缩后的藻液会沿主动回流管回流到水华培养室，避免因藻液流失过快使得微藻生物量过低，同时也避免藻液浓度变化过大，对微藻的生长和繁殖产生较大的影响。

作为优选，所述泵气机构包括空气泵，所述空气泵通过管道与通气口相连，所述空气泵上还设置有气体流量计，所述气体输送管上设置有空气过滤头。这样，经过空气过滤头从通气口向水华培养室通入无菌空气，通过气体流量计对通气流量进行控制。

作为优选，所述光源单元包括沿所述反应釜的顶部及四围均布设置的led灯。这样，通过时控开关对培养过程中的光照、黑暗进行控制，以模拟自然水体的白天黑夜环境。

作为优选，所述硝酸盐为硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵和硝酸钙中的一种或多种；所述磷酸盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸钠、磷酸氢钾和中的一种或多种。

作为优选，所述恒化器中的培养条件是温度为20~30℃，光照强度为2000~2500lux，光暗比为12h:12h，通气量为100ml/min。

作为优选，所述恒化器的稀释率为0.1~0.6，所述回流比为0.5~2.0，所述搅拌机构的搅拌速度为150~250r/min，所述稀释率为进水速率（ml·d^-1）与培养体系藻液体积（ml）之比，所述回流比为回流速率（ml·d^-1）与进水速率（ml·d^-1）之比。这样，可以根据培养体系内培养微藻浓度及营养盐的具体需要来自主调控回流比和稀释比，可以获得不同比生长速率的微藻，也可以根据目标微藻的比生长速率范围对其它微藻进行淘汰，从而获得想要的水华微藻。而上述稀释率和回流比的范围适合现在藻类的比生长速率，过大或过小均会影响藻类的生长，甚至死亡。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、采用本发明方法获得的微藻的细胞浓度在6.68×10⁴~512.17×10⁴cells/ml范围，chla达11.24~197.39μg/l，均达到水华界定标准。其微藻为混合微藻，且光合活性高，其生理性能与自然水体微藻无明显差异，在一定程度上模拟了野外水华，实现了在室内稳定培养混合微藻的新方法，也提高了结果的正确性，同时也为后续水华形成机理及控制措施研究提供稳定藻源。

2、本发明是以野外自然水体为进水原水，以野外未分离的水华微藻为藻源，营养盐成本低，且培养周期短，再结合恒化器培养装置，实现了室内微藻的连续稳定培养。不仅可用于混合微藻的稳定培养，还可用于不同微藻间竞争关系的研究，具有良好的应用前景。

3、本发明通过设计新型的恒化器结构，对微藻进行培养，通过搅拌机构、塑料球和底部通气的方式，保证了气液、藻液均匀混合；同时，通过藻液回流系统将藻液浓缩回流，避免因流失率过大导致的微藻生物量过低的问题。另外，通过多个蠕动泵分别实现了对进样系统、通气系统、藻液回流系统和出样系统中流量的调控，且互不干扰，根据反应釜内微藻生长情况进行调节，适用于不同营养盐浓度、不同水华的培养，解决了室内培养存在的获得的微藻种类单一、生理性能与自然水体微藻存在差异以及难以捕捉到藻类细胞生理状态，导致微藻研究结果误差大的问题。

附图说明

图1为本发明中恒化器的结构示意图；

图2为图1中搅拌件的结构示意图；

图3为实施例3中稳定时不同光照时间下微藻最大光能转换效率fv/fm曲线图；

图4为实施例3中稳定时微藻密度及其占比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

一种室内模拟水华的稳定培养方法，包括以下步骤：

1）从微囊藻水华湖泊中采集距表层0.5m深处的水体1000ml，去除肉眼可见的杂质，密封后，备用。

2）采集自然水体并经过0.45μm膜过滤后，测定其中tn、tp浓度，然后向其中添加0.5mg/mlnano3（以n计）、0.05mg/mlkh2po4（以p计）和纯水，调节tn为0.5mg/l，tp为0.05mg/l，最后高温灭菌，冷却后即得到微藻培养液；

在无菌环境下将步骤1）得到的微藻接种到2l所述微藻培养液中，置于光照培养箱中扩培4d，培养条件为温度25℃、光照2000~2500lux、光暗比12h:12h、通气100ml/min；然后将扩培后的微藻以5000rpm转速离心5min弃上清，并用所述微藻培养液润洗2~3次。

3）将步骤2）得到的微藻在无菌环境中接种到恒化器中于温度25℃、光照2000~2500lux、光暗比12h:12h、通气100ml/min条件下进行培养。其中恒化器稀释率为0.2，搅拌速度为150r/min，回流比为1:1，出水为0.7q（q为进水流量）、出液为0.3q。培养11d后达到稳定。即得到稳定的混合微藻。

稳定水华特征：经鉴定本实施例得到的混合微藻主要包括7属微藻，其中蓝藻门3属，绿藻门4属。藻细胞密度为24.08×10⁴cells/ml，其中蓝藻占了92%以上，形成的以蓝藻为主的水华，达到水华界定标准，即采用本发明方法在室内模拟了野外水华。

参见图1和图2，为本发明采用的恒化器结构，包括密闭设置的反应釜1，所述反应釜1内具有与釜壁间隔设置的水华培养室11，所述水华培养室11和釜壁之间形成密闭的水浴腔12，所述釜壁的底部和顶部各设置有一个与所述水浴腔12连通的水浴口，两个所述水浴口连接有恒温冷水机7。采用上述结构，恒温冷水机7将从水浴腔12返回的循环水加热或冷却至恒定温度后，再次输送至水浴腔，输送至水浴腔的循环水与水华培养室内的藻液进行热量交换后再次回到恒温冷水机加热或冷却，往复循环，对水华培养室内的藻液起到恒温作用。

所述水华培养室11内还设置有用于搅拌培养液的搅拌机构4；所述反应釜的底部设置有与所述水华培养室11相通的通气口5，所述通气口5通过管道连接有泵气机构；所述培养装置还包括用于输送营养物的进样单元、光源单元和藻液回流单元。

所述进样单元包括进样瓶21，所述进样瓶21通过管道连接有进样泵22并延伸至所述反应釜1内，并位于水华培养室11的藻液液面上方。这样，当水华培养室内藻液磷氮营养不适宜时，通过调节进样瓶中的营养物质来调节微藻的生物量或改变优势藻种。

所述藻液回流单元包括密闭设置的回流瓶62和过滤瓶64，所述回流瓶62和过滤瓶64通过水系过滤膜63连通设置；所述回流瓶62上连接有主动回流管道和被动回流管道，所述主动回流管道的一端伸入所述回流瓶62的液面下，另一端连接有回流蠕动泵61，所述回流蠕动泵61通过主动回流管道连接至所述反应釜内，所述被动回流管道的一端伸入所述水华培养室11的液面下，另一端连接至所述回流瓶62的液面上方；所述过滤瓶64通过管道连接有出水泵65，所述出水管伸入所述过滤瓶64的液面下方。

采用上述结构，当藻液体积增加时，过多的藻液从水华培养室沿被动回流管排出并直接进入回流瓶，回流瓶与过滤瓶之间以水系过滤膜连通，水系过滤膜只允许回流瓶中的水通过，进入过滤瓶，过滤瓶中过滤水经出水泵进入出水瓶，使过滤瓶和回流瓶之间存在液位差，促进回流瓶中的水进入过滤瓶，而浓缩后的藻液留在回流瓶，回流瓶中浓缩的藻液可以经过回流泵回流至水华培养室。

实施时，所述回流瓶上端设置有排水口，所述排水口通过管道与排样瓶31相连，用于收集回流瓶中过多的藻液，避免回流瓶中的藻液过多，压力过大；所述排水泵65通过管道与排水瓶32相连，用于收集经出水泵65排出的过滤水。其中，排样瓶31和排水瓶32与管道未密闭设置。

实施时，所述搅拌机构包括可转动地竖向设置在所述水华培养室的搅拌轴41和沿所述搅拌轴径向设置的搅拌件42，所述搅拌轴上端延伸至反应釜外，并与电机的输出轴相连接，使搅拌轴在电机的控制下旋转。进一步，所述搅拌件42沿搅拌轴41周向均布设置的三组双叶叶片；再进一步，所述叶片为45°斜叶，且每组叶片之间互呈60°。

采用上述结构，叶面与运动方向成一定倾斜角，所以在叶片运动时，除有水平环流外，还有轴向分流，增加了搅拌面积和搅拌效率，保证了气液、藻液均匀混合。

实施时，所述水系过滤膜63的孔径为0.45~2μm。

实施时，所述反应釜的水华培养室中还包括用于混合水华的塑料珠8，所述塑料珠能悬浮于培养液中。这样，塑料珠随搅拌叶的转动，而呈悬浮状均匀转动，增加了搅拌面积和搅拌效率，保证了气液、藻液均匀混合。

实施时，所述培养装置中的管道均采用硅胶管，所述硅胶管与所述瓶之间以胶套方式连接。这样，既保证了反应釜的密闭性，且避免了反应釜内压力过大，保证了培养装置的安全性。

实施时，所述主动回流管道连接反应釜的一端位于水华培养室11的液面上方。这样，当水华培养室内藻液液面升高时，过多的藻液通过被动回流管进入回流瓶，然后回流瓶中浓缩后的藻液会沿主动回流管回流到水华培养室，避免因藻液流失过快使得微藻生物量过低，同时也避免藻液浓度变化过大，对微藻的生长和繁殖产生较大的影响。

实施时，所述泵气机构包括空气泵53，所述空气泵通过管道与通气口5相连，所述空气泵上还设置有气体流量计52，所述气体输送管上设置有空气过滤头51。这样，经过空气过滤头从通气口向水华培养室通入无菌空气，通过气体流量计对通气流量进行控制。

实施时，所述光源单元包括沿所述反应釜的顶部及四围均布设置的led灯。这样，通过时控开关对培养过程中的光照、黑暗进行控制，模拟自然水体的白天黑夜环境。

实施例2

一种室内模拟水华的稳定培养方法，包括以下步骤：

1）从微囊藻水华湖泊中采集距表层0.5m深处的水体1000ml，去除肉眼可见的杂质，密封后，备用。

2）采集自然水体并经过0.45μm膜过滤后，测定其中tn、tp浓度，然后向其中添加0.5mg/mlnano3（以n计）、0.05mg/mlkh2po4（以p计）和纯水，调节tn为0.5mg/l，tp为0.05mg/l，最后高温灭菌，冷却后即得到微藻培养液，再在无菌环境下将步骤1）得到的微藻接种到2l所述微藻培养液中，置于光照培养箱中扩培4d，培养条件为温度25℃、光照2000~2500lux、光暗比12h:12h、通气100ml/min。然后将扩培后的微藻以5000rpm转速离心5min弃上清，并用所述微藻培养液润洗2~3次。

3）将步骤2）得到的微藻在无菌环境中接种到如实施例1中所述结构的恒化器中，于温度25℃、光照2000~2500lux、光暗比12h:12h、通气100ml/min条件下进行培养。其中恒化器稀释率为0.4，搅拌速度为150r/min，回流比为1:1，出水为0.7q（q为进水流量）、出液为0.3q，培养14d后达到稳定，即得到稳定的混合微藻。

稳定水华特征：经鉴定本实施例得到的混合微藻主要包括9属微藻，其中蓝藻门2属，绿藻门5属，硅藻门2属。藻细胞密度为6.68×10⁴cells/ml，其中蓝藻占44.67%、绿藻占54.48%，硅藻占0.85%，形成的是蓝绿藻水华，达到水华界定标准，即本发明在室内模拟了野外水华。

实施例3

一种室内模拟水华的稳定培养方法，包括以下步骤：

1）从微囊藻水华湖泊中采集距表层0.5m深处的水体1000ml，去除肉眼可见的杂质，密封后，备用。

2）采集自然水体并经过0.45μm膜过滤后，测定其中tn、tp浓度，然后向其中添加0.5mg/mlnano3（以n计）、0.05mg/mlkh2po4（以p计）和纯水，调节tn为0.5mg/l，tp为0.05mg/l，最后高温灭菌，冷却后即得到微藻培养液，再在无菌环境下将步骤1）得到的微藻接种到2l所述微藻培养液中，置于光照培养箱中扩培4d，培养条件为温度25℃、光照2000~2500lux、光暗比12h:12h、通气100ml/min。然后将扩培后的微藻以5000rpm转速离心5min弃上清，并用所述微藻培养液润洗2~3次。

3）将步骤2）得到的微藻在无菌环境中接种到如实施例1中所述结构的恒化器于温度25℃、光照2000~2500lux、光暗比12h:12h、通气100ml/min条件下进行培养。其中恒化器稀释率为0.2，搅拌速度为150r/min，回流比为1:1，出水为0.7q（q为进水流量）、出液为0.3q。培养11d后达到稳定。

4）待步骤3）微藻达稳定后，将进水tn调节至2.5mg/l，tp调节至0.25mg/l，培养3d后，发现微藻生物量明显增加，为了简化反应器装置，撤出回流部分装置后继续培养，培养10d后达稳定。

稳定时水华特征：经鉴定本实施例得到的混合微藻主要包括5属微藻，颤藻属、小球藻属、衣藻属、舟形藻属和脆杆藻属，其中蓝藻门1属、绿藻门2属、硅藻门2属。藻细胞密度为512.17×10⁴cells/ml，其中蓝藻占了98.44%（图3），形成以颤藻为优势藻的蓝藻水华，达到水华界定标准，即本发明在室内模拟了野外水华。并且说明以培养出来的微藻进行二次培养，得到的微藻仍然具有稳定生长的特性。

将本实施例形成水华进行光合活性测定，结果如图4所示。

从图4可以看出，本发明形成的水华在光照期间蓝藻潜在最大光能转换效率fv/fm在0.58~0.62之间范围，绿藻在0.63~0.67范围，均高于野外蓝藻和绿藻的fv/fm。说明形成的水华光合活性较高，该培养方法对微藻未形成光胁迫，能更好的模拟野外水华现象。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。