本发明涉及家禽的分子育种技术领域，更具体地，涉及一种我国土生鸡种伴性连锁芦花鸡基因型的鉴定方法。
背景技术：
羽色作为鸡育种中的一项重要选择指标，不仅拥有一定的观赏价值，还拥有一定的经济效益。家禽的羽色种类繁多，通过生物化学和组织学分析将其分为二种：一种是有色羽，一种是无色(白色)羽，且各种有色羽的差别仅在于所含黑色素的不同，以及受黑色素迁移和分布的影响。进一步研究发现羽色产生的根源是色素源基因cc和氧化酶基因oo相互作用的结果，黑色是色素原氧化反应的最终产物，红、黄、蓝等则为色素原氧化反应的中间产物；而无色羽出现的原因之一是缺乏色素原基因cc或氧化酶基因oo。大量的研究发现，鸡的羽色由众多基因控制，因此对羽色的选择成为了育种工作者的一项难题。
芦花鸡由其全身羽毛呈黑白相间、宽窄一致的斑纹状而得名。鸡的芦花(也叫横斑)表型，主要包括性染色体上的芦花表型和常染色体上的芦花表型。crawford(1990)提出性染色体上的芦花是伴随着色素沉着的完全缺失，由单基因控制；而常染色体上的芦花产生深色和明亮的色素沉着交替的不规则的条纹，它是由两个基因座位db和pg联合作用而导致。spollman于1908年首次报道了性连锁的横斑表型，横斑等位基因标记为b*b，野生型标记为b*n。cock(1964)发现鸡的性连锁横斑表型为不完全显性遗传，具有剂量效应，b基因纯合个体白色横纹宽度大于杂合子个体及半合子个体。bitgood(1988)通过连锁作图把b等位基因定位在z染色体的长臂末端。2009年，dorshorst和ashwell把它定位在染色体长臂末端的355kb的范围内。
国外对于其当地鸡种影响性连锁横斑表型(芦花表型)的分子机制的研究已经比较深入。hellstrom等(2010)把控制性连锁横斑表型的突变定位在cdkn2a/b基因座，并发现四个snp位点：snp1和snp2为非编码突变，snp1位于cdkn2a(arf)基因转录起始位点上游265bp的启动子区域；snp2位于cdkn2a基因转录起始位点下游385bp的第一内含子处；snp3和snp4位于cdkn2a基因的外显子1上，位置是参考序列(genebankgu470992)的7500bp和7502bp处，两个突变均为错义突变：v9d和r10c。thalmann等(2017)发现性连锁芦花鸡等位基因的演变涉及cdkn2a基因上的调控和编码改变，且将芦花表型分为b0：极端稀释的芦花表型，b1：经典芦花表型，b2：有一定稀释度的芦花表型。其中b0型芦花鸡仅含有snp1和snp2，b1型芦花鸡含有snp1、snp2和snp3，b2型芦花鸡含有snp1、snp2和snp4。
目前虽然已经发现cdkn2a基因与性连锁芦花表型相关，但影响其表型的具体突变位点还未确定，且cdkn2a基因上每个snp的作用也不清楚，芦花表型的形成机制也在继续探寻中。对于我国土生鸡种伴性连锁芦花鸡基因型及其鉴定方法的缺失严重的影响了我国种鸡育种。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种我国土生鸡种伴性连锁芦花鸡基因型的鉴定方法。
本发明的第一个目的是提供一个我国土生鸡种伴性芦花表型相关的相互连锁的snp位点组合。
本发明的第二个目的是提供所述的snp1的检测引物。
本发明的第三个目的是提供所述的snp2的检测引物。
本发明的第四个目的是提供所述的snp3的检测引物。
本发明的第五个目的是提供一种检测我国土生鸡种伴性芦花表型的方法。
本发明的第六个目的是提供一种检测我国土生鸡种伴性芦花表型的试剂盒。
本发明的第七个目的是提供所述检测引物中的一对或几对，或所述检测试剂盒在检测我国土生鸡种伴性芦花表型中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一个我国土生鸡种伴性芦花表型相关的相互连锁的snp位点组合，所述snp位点包括snp1、snp2和snp3，其中snp1为cdkn2a基因启动子区域、转录起始位点上游的267bp处，snp2为cdkn2a基因内含子1的380bp处，snp3为cdkn2a基因外显子1的170bp处。
cdkn2a基因的登录号，geneid：395077。
一对检测所述snp1的检测引物，其核苷酸序列如seqidno:1～2所示。
snp1上游引物：5’-gttacccgtttctgctccttgacgc-3’(seqidno:1)；
snp1下游引物：5’-gcccccaccgtaagaaagctctctc-3’(seqidno:2)。
一对检测所述snp2的检测引物，其核苷酸序列如seqidno:3～4所示。
snp2上游引物：5’-ggtcggcaggctatctctat-3’(seqidno:3)；
snp2下游引物：5’-aggtccacgtattctcatca-3’(seqidno:4)。
一对检测所述snp3的检测引物，其核苷酸序列如seqidno:5～6所示。
snp3上游引物：5’-ctctcctgttcccatgacctctcg-3’(seqidno:5)；
snp3下游引物：5’-gatagagatagcctgccgaccacc-3’(seqidno:6)，
一种检测我国土生鸡种伴性芦花表型的方法，检测所述的snp位点组合的中的一个或几个snp位点。
优选地，使用所述的检测引物中的一对或几对检测所述的snp位点组合中的一个或几个snp位点。
一种检测我国土生鸡种伴性芦花表型的试剂盒，含有检测所述的snp位点组合中的一个或几个snp位点的试剂。
优选地，所述检测所述的snp位点组合中的一个或几个snp位点的试剂为所述的检测引物中的一对或几对。
所述检测引物中的一对或几对或所述检测试剂盒在检测鸡伴性芦花表型中的应用。
优选地，所述我国土生鸡种为汶上芦花鸡、白芦花文昌鸡、黑芦花文昌鸡、非芦花表型的文昌鸡、广西鸿光芦花鸡和非芦花表型的华农粤黄鸡中的一种或几种。
优选地，所述我国土生鸡种为我国华南地区土生鸡种。
优选地，所述我国华南地区土生鸡种为白芦花文昌鸡、黑芦花文昌鸡、非芦花表型的文昌鸡、广西鸿光芦花鸡和非芦花表型的华农粤黄鸡中的一种或几种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首次发现我国土生鸡种的3个相互连锁的与性连锁芦花鸡表型相关的snp位点，并以此建立了检测性连锁芦花鸡表型及其基因型的方法，方法操作简单、准确性高、重复性好、省时，可进行相互检验，达到100％准确率，该方可用于培育自别雌雄的配套系，利用羽色自别雌雄，准确率高、操作简便，且能节约时间和成本，有很好的应用价值，值得大力推广。
具体实施方式
下面结合说明书和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1一种检测鸡伴性芦花表型的方法
snp1为cdkn2a基因启动子区域、转录起始位点上游的267bp处，根据其在基因组上的位置设计引物，并筛选出扩增特异性高的引物，并优化扩增体系和反应程序。
一、实验方法
采集鸡血样，并提取血样dna，对血样dna进行扩增，扩增引物为：
snp1上游引物：5’-gttacccgtttctgctccttgacgc-3’(seqidno:1)；
snp1下游引物：5’-gcccccaccgtaagaaagctctctc-3’(seqidno:2)。
50μl扩增体系如下：
snp1扩增程序：94℃预变性2分钟；98℃变性10秒，60℃退火20秒，68℃延伸50秒，共40个循环；68℃后延伸5分钟。
扩增产物经过纯化后使用snp1上游引物：5’-gttacccgtttctgctccttgacgc-3’(seqidno:1)，进行sanger测序。
二、结果判读
若snp1的基因型为gg时，则该待测鸡为纯合性连锁芦花鸡(zbzb)；若snp1基因型为ag时，则该待测鸡为杂合性连锁芦花鸡(zbzb)；若snp1基因型为aa时，则该待测鸡为非性连锁芦花鸡(zbzb)。
实施例2一种检测鸡伴性芦花表型的方法
snp2为cdkn2a基因内含子1的380bp处，根据其在基因组上的位置设计引物，并筛选出扩增特异性高的引物，并优化扩增体系和反应程序。
一、实验方法
采集鸡血样，并提取血样dna，对血样dna进行扩增，扩增引物为：
snp2上游引物：5’-ggtcggcaggctatctctat-3’(seqidno:3)；
snp2下游引物：5’-aggtccacgtattctcatca-3’(seqidno:4)。
50μl扩增体系如下：
snp2扩增程序：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共34个循环；72℃后延伸5分钟。
扩增产物经过纯化后使用snp2上游引物：5’-ggtcggcaggctatctctat-3’(seqidno:3)，进行sanger测序。
二、结果判读
若snp2的基因型为aa时，则该待测鸡为纯合性连锁芦花鸡(zbzb)；若snp2基因型为ca时，则该待测鸡为杂合性连锁芦花鸡(zbzb)；若snp2基因型为cc时，则该待测鸡为非性连锁芦花鸡(zbzb)。
实施例3一种检测鸡伴性芦花表型的方法
snp3为cdkn2a基因外显子1的170bp处，根据其在基因组上的位置设计引物，并筛选出扩增特异性高的引物，并优化扩增体系和反应程序。
一、实验方法
采集鸡血样，并提取血样dna，对血样dna进行扩增，扩增引物为：
snp3上游引物：5’-ctctcctgttcccatgacctctcg-3’(seqidno:5)；
snp3下游引物：5’-gatagagatagcctgccgaccacc-3’(seqidno:6)，
40μl扩增体系如下：
模板dna1.5μl
10pmol引物各1.8μl
1.1×t3superpcrmix35μl
snp3扩增程序：98℃预变性3分钟；98℃变性10秒，65℃退火10秒，72℃延伸10秒，共36个循环；72℃后延伸5分钟。
扩增产物经过纯化后使用测序引物：5’-ccttctcagaacccggcgcagaat-3’(seqidno:7)，进行sanger测序。
二、结果判读
若snp3的基因型为aa时，则该待测鸡为纯合性连锁芦花鸡(zbzb)；若snp3基因型为ta时，则该待测鸡为杂合性连锁芦花鸡(zbzb)；若snp3基因型为tt时，则该待测鸡为非性连锁芦花鸡(zbzb)。
实施例4汶上芦花鸡和华农粤黄鸡的检测
一、实验方法
使用实施例1到3的检测方法检测汶上芦花鸡、非芦花表型的华农粤黄鸡的公母鸡的基因型，并同时检测snp4(snp4为cdkn2a基因外显子1的172bp处。)。
其中，snp4的检测方法为：由于snp4与snp3位置相隔1个碱基，所以snp4的检测引物及扩增程序、测序引物同snp3一样。若snp4的基因型为tt时，则该待测鸡为纯合性连锁芦花鸡(zbzb)；若snp4基因型为ct时，则该待测鸡为杂合性连锁芦花鸡(zbzb)；若snp4基因型为cc时，则该待测鸡为非性连锁芦花鸡(zbzb)。
二、实验结果
汶上芦花鸡为经典的芦花表型，华农粤黄鸡为非芦花表型鸡，三个snp位点的测序结果如表1所示。由表1可知，汶上芦花鸡的三个snp位点均发生了突变，且为纯合突变。而华农粤黄鸡的三个snp位点均未发生突变。所有品种snp4位点均未发生突变。
表1
实施例5白芦花文昌鸡、黑芦花文昌鸡和非芦花表型的文昌鸡的检测
一、实验方法
使用实施例1到3的检测方法检测白芦花文昌鸡、黑芦花文昌鸡和非芦花表型的文昌鸡的公母鸡的基因型，并同时检测snp4。
其中，snp4的检测方法同实施例4。
二、实验结果
在对两种不同表型的芦花文昌鸡，和非芦花表型的文昌鸡，共160只鸡的三个snp位点的测序结果进行分析。发现所检测的个体中，纯合性连锁芦花鸡(zbzb)有85只，杂合性连锁芦花鸡(zbzb)有35只，非性连锁芦花鸡(zbzb)有40只。所有品种snp4位点均未发生突变。结果如表2所示。
表2：
实施例6广西鸿光芦花鸡表型的检测
一、实验方法
使用实施例1到3的检测方法检测广西鸿光芦花鸡表型的公母鸡的基因型，并同时检测snp4。
其中，snp4的检测方法同实施例4。
二、实验结果
对50只广西鸿光芦花鸡的三个snp位点的测序结果进行分析。发现所检测的个体中，纯合性连锁芦花鸡(zbzb)有45只，杂合性连锁芦花鸡(zbzb)有5只，非性连锁芦花鸡(zbzb)有0只。同样地，snp4位点均未发生突变。结果如表3所示。
表3：
综上所述，对于我国本地土生鸡种来说仅有3个连锁的snp影响伴性芦花表型，并可用于伴性芦花表型的检测。
序列表
<110>华南农业大学
<120>一种我国土生鸡种伴性连锁芦花鸡基因型的鉴定方法
<160>7
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gttacccgtttctgctccttgacgc25
<210>2
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gcccccaccgtaagaaagctctctc25
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
ggtcggcaggctatctctat20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
aggtccacgtattctcatca20
<210>5
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
ctctcctgttcccatgacctctcg24
<210>6
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
gatagagatagcctgccgaccacc24
<210>7
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
ccttctcagaacccggcgcagaat24