一种用于检测具核梭杆菌的试剂盒及其方法与流程

本发明属于及生物检测技术领域，尤其涉及一种用于检测具核梭杆菌的试剂盒及其方法，其采用荧光原位杂交检测方法。

背景技术：

现有对大肠癌组织或者粪便中的具核梭杆菌进行定性和定位分析主要包括：(1)传统的微生物鉴定及群落分析，其多采用菌种分离培养的方法，传统微生物鉴定及群落分析鉴定方法耗时长、效率低，厌氧菌的分离培养又对培养环境有着苛刻的要求，极易出现假阴性的出现；

(2)细菌染色并进行普通光学显微镜或电镜分析等，普通光学显微镜通过细菌的结构以及形态学特征仅仅了解细菌的一些信息，但由于细菌的形态学差异较小，因为简单的光学显微镜鉴定是不准确的；而与电镜相比，虽然电镜的分辨率很高，但其使用的维护成本和时间成本均较高，且操作难度大；

(3)qpcr(real-timequantitativepcr实时荧光定量核酸扩增检测)等。pcr技术可定量检测组织中细菌dna的量进而对微生物群落的状态进行分析，但pcr对样本保存要求较高，影响检测的便捷性，且无法立体直观的观察微生态的形态、数量、空间分布。因而，需要进一步改进具核梭杆菌的检测方法。

荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybrididaization，fish)技术是一种重要的非放射性分子标记技术，其基本原理是：如果被检测的染色体或dna纤维切片上的靶dna与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶dna与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测dna进行定性、定量或相对定位分析。

该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。但该荧光原位杂交技术并未应用于微生物(例如具核梭杆菌等)的检测。

技术实现要素：

为了于克服现有技术中的缺陷，本发明解决了之前无法在组织切片原位直接观察具核梭杆菌的分布以及数量的问题，同时采用组织作为对照，可以精确定位菌体的位置，实现了对具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum)的定性和定位分析。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种用于检测具核梭杆菌的试剂盒，其包括：探针-杂交缓冲液混合体系；其中，所述探针-杂交缓冲液混合体系包括荧光标记的具核梭杆菌特异探针。

进一步地，所述探针-杂交缓冲液混合体系还包括荧光标记的肠道菌群通用探针。

进一步地，所述荧光标记的具核梭杆菌特异探针序列如seqidno：3所示，所述荧光标记的肠道菌群通用探针的序列如seqidno：4所示。

进一步地，所述荧光标记选自fitc、tritc、cy3、cy5、thiol、deac；更进一步地，所述具核梭杆菌特异探针标记fitc或cy3，所述肠道菌群通用探针标记fitc或deac(diethylaminocoumarin-5-dutp二乙胺基香豆素)。荧光标记也可采用本领域任一合适的荧光素。

本发明的第二方面是提供一种用于检测具核梭杆菌的试剂盒，其包括：探针-杂交缓冲液混合体系；其中，所述探针-杂交缓冲液混合体系包括报告分子标记的具核梭杆菌特异探针；所述试剂盒还包括与报告分子发生免疫化学反应的荧光标记的特异亲和素。

进一步地，所述报告分子选自生物素、地高辛，所述特异亲和素选自抗生物素抗体、抗地高辛抗体。

进一步地，所述探针-杂交缓冲液混合体系还包括报告分子标记的肠道菌群通用探针。

进一步地，所述报告分子为地高辛，所述特异亲和素为抗地高辛荧光标记抗体；其中，地高辛标记的具核梭杆菌特异探针的序列如seqidno：1所示，地高辛标记的肠道菌群通用探针的序列如seqidno：2所示。

进一步地，所述荧光标记选自fitc、tritc、cy3、cy5、thiol、deac；更进一步地，所述抗地高辛荧光标记抗体为市售的德国罗氏公司anti-digoxigenin-fluorescein，fabfragments(抗地高辛荧光素fab片段)。

上述试剂盒采用的探针序列具体如下：

本发明的第三方面是提供一种采用上述任一试剂盒检测具核梭杆菌的方法，其包括如下步骤：

步骤1)常规制备组织切片后，进行脱蜡处理；

步骤2)对脱蜡后的组织切片进行清洗并对其上的的细菌细胞壁进行消化；

步骤3)将组织切片梯度脱水并晾干，在组织切片上加入探针-杂交缓冲液混合体系，并封片进行孵育；

步骤4)使用无探针的杂交缓冲液对组织切片进行浸洗，pbs溶液漂洗；

步骤5)复染组织中的dna，封片，拍照；

步骤6)寻找荧光标记信号对细菌进行定位分析，并确定荧光信号在切片中的位置，分析细菌所处的空间位置。

为了进一步优化上述检测具核梭杆菌的方法，本发明采取的技术措施包括：

进一步地，当采用报告分子标记的具核梭杆菌特异探针时，所述方法在步骤4)之后及步骤5)之前包括：步骤41)将洗涤缓冲液稀释好的与报告分子发生免疫化学反应的荧光标记的特异亲和素滴在杂交区域，避光孵育，用pbs溶液浸洗。

进一步地，所述pbs溶液为1×pbs磷酸盐缓冲液，其包括：

溶入1000mldepc去离子水。

进一步地，所述洗涤缓冲液包括：

进一步地，所述步骤2)中的组织切片清洗及其细菌细胞壁的消化包括如下步骤：

a)使用2×ssc缓冲液，室温浸泡切片3～8min；

b)配置溶菌酶溶液，以用于浸泡组织切片，孵育15～25min，漂洗；

c)使用2×ssc缓冲液，室温浸泡切片3～8min。

进一步地，如果组织切片保存时间大于等于1年，在步骤c)之后还包括：

d)将组织切片至于多聚甲醛溶液中固定5～15min；

e)使用2×ssc缓冲液，室温浸泡切片3～8min。

进一步地，溶酶菌消化温度为37℃，浓度为10～100u/μl，消化时间为5～20分钟，溶酶菌溶液需完整覆盖需消化部位。

进一步地，所述多聚甲醛溶液为4％多聚甲醛(paraformaldehyde，pfa)，所述4％多聚甲醛为：4克多聚甲醛溶于90mldepc去离子水配置的1×pbs中，50度加热，逐渐滴加1mnaoh至完全溶解，定容至100ml使用hcl调至ph7.2左右，过滤沉淀。

进一步地，所述2×ssc缓冲液为：取20×ssc，用decp处理后的去离子水稀释10倍获得；所述20×ssc为：氯化钠175.3g；柠檬酸三钠88.2g；depc去离子水1000ml。

进一步地，在所述步骤3)中，梯度脱水的步骤包括：将组织切片依次浸入70～75％乙醇水溶液，80～85％乙醇水溶液，90～99％乙醇水溶液或100％无水乙醇，每缸乙醇体积为承载组织的载玻片体积5倍以上，每缸浸洗2～3min。更优选为75％乙醇水溶液，80％乙醇水溶液，100％无水乙醇，上述乙醇水溶液的浓度梯度可进行微调，例如调整±10％，上述乙醇水溶液可市售获得或自行配制。

进一步地，在所述步骤3)中，杂交缓冲液的ph值为7.0-7.5，探针浓度为5～30ng/ul，孵育温度55-60℃，时间3.5-4.5小时，过程中保持环境湿度60％以上。

进一步地，在所述步骤4)中，采用无探针的杂交缓冲液浸洗5～10min，46℃一次，使用pbs溶液漂洗组织。进一步地，所述杂交缓冲液包括：

进一步地，步骤5)采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚复染组织中的dna，封片，-20℃冻存1h之后，在暗室中使用荧光显微镜观察杂交信号并拍照。

更进一步地，使用地高辛间接标记的探针检测对具核梭杆菌的方法包括如下步骤：

(1)常规制备组织切片后，进行脱蜡：采用二甲苯脱蜡，乙醇(优选乙醇(100％、85％、75％))梯度复水，去离子水漂洗；。

(2)加入溶菌酶对切片上的细菌细胞壁进行消化，使细胞壁中不溶性黏多糖分解成为可溶性糖肽，致细胞壁破裂，方便探针进入细菌胞质并对其中的遗传物质进行原位杂交，消化温度为37℃，溶菌酶浓度为10～100u/μl，消化酶溶液需完整覆盖需消化部位；消化时间为15～25分钟；在消化之前及之后均采用2×ssc缓冲液进行浸泡。

(3)将组织切片梯度脱水并晾干(优选依次浸入75％乙醇水溶液，80％乙醇水溶液，100％无水乙醇，每缸乙醇体积为承载组织的载玻片体积5倍以上，每缸浸洗2～3min)之后，在组织切片上加入探针-杂交缓冲液混合体系，并使用封片胶封片，防止杂交区域在变性及孵育过程中干燥，杂交缓冲液ph值为7.0-7.5，探针浓度为5～30ng/ul，温度55-60℃，时间3.5-4.5小时，过程中保持环境湿度60％以上；

(4)使用无探针的杂交缓冲液50ml对切片进行浸洗，5～10min，46℃一次，洗去多余的探针以及不牢固的非特异性结合，使用1×pbs溶液漂洗组织；

(5)将洗涤缓冲液稀释好的抗地高辛荧光标记抗体(anti-digoxigenin-fluorescein,fabfragments，roche)，1：2000稀释，滴在杂交区域，依据抗原-抗体结合原理使其与探针结合，避光孵育30-35min，用pbs溶液浸洗；抗体标记种类没有限制，一般习惯使用fitc或deac标记eub338序列，使用fitc或cy3标记具核梭杆菌特异序列。

(6)加入dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)10ul复染组织中的dna以显示组织结构，方便之后的镜检与拍摄，封片，-20℃冻存1h之后，在暗室中使用荧光显微镜观察杂交信号并拍照；

(7)寻找荧光标记信号对细菌进行定位分析，并确定荧光信号在切片中的位置，分析细菌所处的空间位置。

与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

本发明采用的荧光试剂和探针经济安全、稳定，一次标记后可在一年内使用，而多色荧光原位杂交技术还可以在同一组织中对多种微生物进行定点和群落分析。荧光原位杂交技术结合了分子生物学的精确性和形态学分析的可视性，能够对组织或者粪便中的微生物(具核梭杆菌)进行检测和鉴定，并对微生物群落进行评价，具有快速、简便、精确的优点，有较大的临床应用价值。本发明实现在组织切片原位直接观察具核梭杆菌的分布以及数量，同时采用组织作为对照，可以精确定位菌体的位置，实现了对具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum)的定性和定位分析。

附图说明

图1为使用地高辛间接标记的探针采用荧光原位杂交技术对大肠癌组织中的具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum)进行定性和定位分析的结果图；

图2为使用直接标记的探针采用荧光原位杂交技术对大肠癌组织中的具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum)进行定性和定位分析的结果图。

具体实施方式

本发明涉及一种用于检测具核梭杆菌的试剂盒，其包括：探针-杂交缓冲液混合体系；其中，所述探针-杂交缓冲液混合体系包括报告分子标记的具核梭杆菌特异探针或者荧光标记的具核梭杆菌特异探针；其中，当采用报告分子标记的具核梭杆菌特异探针时，所述试剂盒还包括与报告分子发生免疫化学反应的荧光标记的特异亲和素。本发明还涉及一种采用上述试剂盒检测具核梭杆菌的方法。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

下述实施例中采用的试剂、仪器及探针如下：

1、荧光原位杂交(fish)的主要试剂

2、荧光原位杂交(fish)主要仪器和设备

3.荧光原位杂交(fish)探针设计

用于fish检测的fn细菌探针来自探针库probebase(http://www.microbial-ecology.net/probebase/)：

(1)间接标记：

地高辛标记的具核梭杆菌特异探针序列：digoxigenin-5'-cgcaatacagagttgagccctgc-3'-digoxigenin(seqidno：1)。

肠道菌群通用探针序：digoxigenin-5'-gctgcctcccgtaggagt-3'-digoxigenin(seqidno：2)。

(2)直接标记：

cy3标记的具核梭杆菌特异探针序列：cy3-5'-gctgcctcccgtaggagt-3'-cy3(seqidno：3)。

通用细菌探针eub338(pb-00159)序列：5'-gctgcctcccgtaggagt-3'(seqidno：4)，采用deac(diethylaminocoumarin-5-dutp二乙胺基香豆素)标记。

4.下述实施例中使用各配置液：

实施例1

本实施例为用荧光原位杂交技术使用地高辛间接标记的探针对大肠癌组织中的具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum)进行定性和定位分析，其包括如下步骤：

一、脱蜡：

(1)取肠癌石蜡组织切片(上海市第十人民医院病理科)(厚度4um)，采用二甲苯脱蜡3次，每次5min；

(2)乙醇(100％、85％、75％)梯度复水，每次2min；二、溶菌酶处理：

(1)使用2×ssc缓冲液，室温浸泡切片5min。

(2)用pbs配置溶菌酶溶液，浓度调整为10u/μl。用溶菌酶溶液浸泡组织切片，37℃孵育20min，用pbs漂洗3次。

(3)使用2×ssc缓冲液，室温浸泡切片5min。

(4)对于保存时间较久的石蜡切片(保存时间1年或以上的)，将切片至于4％多聚甲醛溶液中固定10min，以提升杂交信号效果。

(5)使用2×ssc缓冲液，室温浸泡切片5min。

三、脱水：

将切片放置于(75％、85％、100％)梯度酒精容器内脱水，每次2～3min，自然晾干。

四、杂交：

(1)用洗涤缓冲液(20mmtris-hcl，0.1％sds，0.9％nacl[ph7.2])稀释探针，调整探针浓度为280ng/ml；

(2)取一个湿盒，交叉放置切片；

(3)于暗处(避光处)将含地高辛标记的特异探针浓度为5ng/ul的杂交缓冲液10ul加至杂交区域，加盖盖玻片，封片剂封片；

(4)thermobrite杂交仪中56℃杂交过夜；

(5)去除盖玻片；

(6)杂交过夜后将载玻片于46℃预热的杂交缓冲液中漂洗10min，

(7)pbs漂洗3次，每次2min暗处自然晾干；

(8)将洗涤缓冲液稀释好的抗地高辛荧光标记抗体(anti-digoxigenin-fluorescein,fabfragments,roche)，1：2000稀释，滴在杂交区域，暗处37℃孵育30min。

(9)pbs磷酸盐缓冲液室温(25℃)下浸洗3次，每次2min暗处晾干。

五、封片观察拍照

滴加10uldapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)，封片剂中性树胶封片；-20℃冻存1h后暗室中使用荧光显微镜进行观察杂交信号并拍照。

通过寻找荧光标记信号从而对细菌进行定位分析，并确定荧光信号在切片中的位置，分析细菌所处的空间位置。

上述方法所得的结果如图1所示，其为用荧光原位杂交技术对大肠癌组织中的具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum)进行定性和定位分析(使用地高辛间接标记的探针)，其中a部分：箭头为特异性梭杆菌与序列eub338重合部分，实际颜色为红色荧光信号与绿色荧光信号重叠后的黄色荧光信号；b部分：淡色dapi图像为肠道组织结构；c部分：箭头为序列eub338特异性结合部分，实际颜色为绿色荧光信号；d部分：箭头为特异性梭杆菌序列结合部分，实际颜色为红色荧光信号。

实施例2

本实施例为用荧光原位杂交技术使用直接标记的探针对大肠癌组织中的具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum)进行定性和定位分析，其包括如下步骤：

一、脱蜡：

(1)取肠癌石蜡组织切片(厚度4um)，采用二甲苯脱蜡3次，每次5min；

(2)乙醇(100％、85％、75％)梯度复水，每次2min；

(3)去离子水漂洗5min；

二、溶菌酶处理:

(1)使用2×ssc缓冲液，室温浸泡切片5min。

(2)用pbs配置溶菌酶溶液，浓度调整为10u/μl。用溶菌酶溶液浸泡组织切片，37℃孵育20min，用pbs漂洗3次。

(3)使用2×ssc缓冲液，室温浸泡切片5min。

(4)对于保存时间较久的石蜡切片(保存时间1年或以上的)，将切片至于4％多聚甲醛溶液中固定10min，以提升杂交信号效果。

(5)使用2×ssc缓冲液，室温浸泡切片5min。

三、脱水

将切片放置于(75％、85％、100％)梯度酒精脱水，每次2～3min，自然晾干；

四、杂交：

(1)用洗涤缓冲液(20mmtris-hcl，0.1％sds，0.9％nacl[ph7.2])稀释探针，调整探针浓度为280ng/ml；

(2)取一个湿盒，平行放置切片；

(3)于暗处将含探针浓度为5ng/ul的杂交缓冲液10ul加至杂交区域，加盖盖玻片，封片剂封片；

(4)thermobrite杂交仪中65℃杂交过夜；

(5)去除盖玻片；

(6)杂交过夜后将载玻片于46℃预热的杂交缓冲液漂洗10min；

(7)pbs磷酸盐缓冲液室温(25℃)下浸洗3次，每次2min暗处晾干；

五、封片观察拍照

滴加10uldapi，封片剂封片，-20℃冻存1h后暗室中使用荧光显微镜进行观察杂交信号并拍照。

通过寻找荧光标记信号从而对细菌进行定位分析，并确定荧光信号在切片中的位置，分析细菌所处的空间位置。

上述方法所得的结果如图2所示，其为用荧光原位杂交技术对大肠癌组织中的具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum)进行定性和定位分析(使用直接标记的探针)；其中，a部分：箭头处肠腺体中高亮点状信号，为异常增生的肠导腺体中含有聚集的fn菌群；b部分：为a图放大1倍后所获得。

由上述实施例可知，本发明解决了之前无法在组织切片原位直接观察具核梭杆菌的分布以及数量的问题，同时采用组织作为对照，可以精确定位菌体的位置，实现了对具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum)的定性和定位分析。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110>上海市第十人民医院

<120>一种用于检测具核梭杆菌的试剂盒及其方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>具核梭杆菌特异探针(地高辛标记)(artificialsequence)

<400>1

cgcaatacagagttgagccctgc23

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>肠道菌群通用探针(地高辛标记)(artificialsequence)

<400>2

gctgcctcccgtaggagt18

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>具核梭杆菌特异探针(cy3标记)(artificialsequence)

<400>3

gctgcctcccgtaggagt18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>肠道菌群通用探针(deac标记)(artificialsequence)

<400>4

gctgcctcccgtaggagt18