使用分子筛离心柱快速完整获取mRNA核糖体新生肽链复合物的方法及其应用与流程

本发明属于生命科学
技术领域：
，特别涉及一种使用分子筛离心柱快速完整获取mrna核糖体新生肽链复合物的方法及其应用。
背景技术：
：翻译调控是生命体内的重要调控层次，翻译调控占据生命体总调控的50％以上，在生命体中基因被表达不代表进入翻译过程合成蛋白质，因此对生命体的翻译状况进行研究极为重要。细胞进行翻译时，核糖体结合在mrna链上并移动并合成蛋白质，这种完整mrna和核糖体以及新生肽链组成的复合体就是mrna核糖体新生肽链复合物(ribosomenascent-chaincomplex,rnc)，只有提取到完整未降解的rnc，才能对正在翻译的mrna进行定性定量研究。目前rnc的常用提取方法是蔗糖密度超速离心法，此方法能够提取出完整未降解的rnc，保留核糖体上全长的mrna和新生肽链以供其后的各种生化与分子生物学研究(wangetal.,2013；zhangetal.,2009)，可用于动物、植物、微生物的培养细胞和组织(中国发明专利zl201510332732，zl201410452522，zl201410387213)。目前已发表的文献和专利使用的都是蔗糖密度超速离心法，虽然蔗糖密度超速离心法可以提取出完整未降解的rnc，但是该方法需要贵重仪器如超速离心机，耗材(如超速离心管等)成本高，操作繁琐，包括超速离心机预冷2h、蔗糖梯度溶液的配制、超速离心机上机前配平(要求误差为0.01g以内)、超速离心管内rnc的重悬等，因此实验时间漫长(根据样品量和转头的不同需5～13h，如果盲目通过提高离心力来缩短离心时间会导致杂质污染)，蔗糖溶液无法灭菌因而混入rnase的概率大，配平过程需要将裂解上清移至室温操作，易造成rnc的降解，回收率较低，批次间操作不慎容易造成差异，对操作者的经验和操作精细程度有很大的要求。微量样品的提取风险很大，沉淀肉眼难以寻找且容易溶解，并且每次提取的样品数目有限，这些限制条件极大的阻碍了rnc技术的实验室推广和商业应用。传统层析系统(如geaktapure系统)在原理上支持纯化生物样品中的rnc，但是由于层析系统纯化时间过长，许多实验组份无法高压灭活rnase，尤其是层析柱和填料无法灭活rnase，极易导致rnc-rna降解，不能获取到全长mrna，也就无法对正在翻译中的mrna进行定性定量研究，只能用于提取核糖体蛋白。降解严重时甚至导致rnc解体，连新生肽链都难以提取到。因此目前提取rnc的成熟方法只有蔗糖密度超速离心法，缺乏一种快速、简便、高通量的技术。技术实现要素：本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种使用分子筛离心柱快速完整获取mrna核糖体新生肽链复合物的方法。本发明首次提出使用分子筛离心柱方法提取mrna核糖体新生肽链复合物，优化了一整套技术方案。利用分子筛超大分子量物质直接穿透的特性，结合低速离心作为纯化手段，不需要贵重仪器超速离心机和层析系统，只需要普通低速离心机即可，实验步骤少，操作简单，被rnase污染概率小，大幅缩短实验时间、极大降低实验成本的同时能够得到和蔗糖密度超速离心法质量相同、甚至更优的rnc-mrna测序数据，可以有效克服当前方法成本高，操作复杂，通量低的技术缺陷。本发明的另一目的在于提供上述使用分子筛离心柱快速完整获取mrna核糖体新生肽链复合物的方法的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种使用分子筛离心柱快速完整获取mrna核糖体新生肽链复合物的方法，包括如下步骤：(1)使用裂解液裂解生物样品，得到裂解产物；通过差速离心去除裂解液中的碎片，得到裂解后的上清液；(2)使用分子筛离心柱来纯化裂解后的上清液，得到高纯度的mrna核糖体新生肽链复合物。步骤(1)中所述的裂解液为含翻译延伸抑制剂和tritonx-100的盐缓冲液。步骤(1)中所述的裂解液可采用市售产品，采用现有技术公开的常用细胞裂解方法，本领域技术人员可根据实际情况选择适当的方法和条件，本发明对此不作具体限定。所述的裂解液中的翻译延伸抑制剂优选为放线菌酮或氯霉素；放线菌酮适用于真核生物，氯霉素适用于原核生物。所述的放线菌酮的浓度优选为0.05～0.15mg/ml；更优选为0.1mg/ml。所述的氯霉素的浓度优选为0.05～0.15mg/ml；更优选为0.1mg/ml。所述的tritonx-100的浓度为体积百分比0.1～1.5％；更优选为0.2～1％。步骤(1)中所述的生物样品包括真核生物和原核生物。所述的生物样品为真核生物时，所述的裂解液的组成优选如下：15～25mm、ph7.4的hepes-koh溶液、10～20mmmgcl2、150～250mmkcl、50～150μg/ml放线菌酮、1～3mmdtt、0.5～1.5％(v/v)tritonx-100；更优选如下：20mm、ph7.4的hepes-koh溶液、15mmmgcl2、200mmkcl、100μg/ml放线菌酮、2mmdtt、1％(v/v)tritonx-100。所述的生物样品为原核生物时，所述的裂解液的组成优选如下：5～15mm、ph7.8的tris-hcl、5～15mmmgcl2、30～70mmnh4cl、0.1～0.3％(v/v)tritonx-100、100μg/ml氯霉素；更优选如下：10mm、ph7.8的tris-hcl、10mmmgcl2、50mmnh4cl、0.2％(v/v)tritonx-100、100μg/ml氯霉素。为了更有利于从所述的生物样品提取完整的rnc，对于不同的生物样品在加入裂解液前的处理可参考国家发明专利zl201510332732、zl201410452522、zl201410387213。所述的生物样品为原核生物时，在加入所述的裂解液前优选还包括如下处理步骤：在原核生物细胞中加入溶菌酶溶液和mgcl2溶液处理。该步骤有利于原核生物细胞被裂解液裂解，同时保持rnc的完整性。步骤(1)中所述的差速离心的条件优选为于16000～18000g离心10～20min；更优选于17000g离心15min。步骤(2)中所述的分子筛离心柱所使用的分子筛离心柱填料优选排阻范围为2×104～8×106da的分子筛离心柱填料。步骤(2)中所述的使用分子筛离心柱纯化裂解后的上清液的具体步骤优选如下：(a)取出分子筛离心柱，使用柱平衡缓冲液进行柱平衡，然后置于2～8℃环境下待柱填料沉降完全；(b)取出沉降好的分子筛离心柱，离心除去柱内的溶液，得到制备好的柱子；(c)将裂解后的上清液滴加到分子筛离心柱柱床表面，离心收集滤液，得到纯化好的高纯度rnc。步骤(a)中所述的分子筛离心柱包含但不限于microspins-400hr-gehealthcare分子筛离心柱。使用相近排阻范围的其它厂商分子筛离心柱均可达到相同的纯化效果。步骤(a)中所述的柱平衡缓冲液的组成如下：所述的生物样品为真核生物时，所述的柱平衡缓冲液的组成优选如下：15～25mm、ph7.4的hepes-koh溶液、10～20mmmgcl2、150～250mmkcl；更优选如下：20mm、ph7.4的hepes-koh溶液、15mmmgcl2、200mmkcl；所述的生物样品为原核生物时，所述的柱平衡缓冲液的组成优选如下：5～15mm、ph7.8的tris-hcl、5～15mmmgcl2、30～70mmnh4cl；更优选如下：10mm、ph7.8的tris-hcl、10mmmgcl2、50mmnh4cl。步骤(a)中所述的沉降完全指2～8℃重力沉降6小时以上；更优选为于4℃重力沉降8～16h。步骤(b)中所述的离心的条件优选为于500～700g离心1～3min；更优选为于600g离心2min。步骤(c)中所述的离心的条件优选为于500～700g离心30～90s；更优选为于600g离心60s。上述的使用分子筛离心柱快速完整获取mrna核糖体新生肽链复合物的方法在mrna建库测序中的应用，优选包括如下步骤：将上述方法获得的rnc进行提取，得到rnc-rna，然后进行mrna建库测序。所述的提取可通过使用trizol或试剂盒实现；优选通过使用trizolrna提取试剂。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：蔗糖密度超速离心法因为要使用超速离心机作为实验仪器，实验步骤多，操作难度高，离心时间漫长。蔗糖溶液因为无法高压会引入rnase污染，上机前超速离心管配平耗时长容易引起rnc的降解，从而无法鉴定到全长mrna。本发明方法使用分子筛离心柱替代蔗糖密度超速离心法提取mrna核糖体新生肽链复合物，和蔗糖密度超速离心法相比：不需要贵重仪器超速离心机，操作简单，步骤少，被rnase污染的概率小，实验重复性高，分子筛离心柱纯化步骤耗时只需10min左右，极大的缩短了实验时间，且可以大批量操作。解决了当前方法耗时长，操作难度高，通量低的限制，同时可以获得高质量的rnc-mrna测序数据，让普通实验室也能进行rnc研究，公司能够提供快速大批量的rnc测序商业服务，对rnc技术推广有重要推动作用。附图说明图1为实施例1不同制备方法得到的rnc-rna通过2％琼脂糖凝胶电泳检测得到的结果图；其中，泳道1为dnamarker，泳道2为鼠肾脏rna(trizol法提取)，泳道3为裂解上清液rna(trizol法提取)，泳道4和泳道5为分子筛离心柱提取得到rnc-rna，泳道6和泳道7为蔗糖密度超速离心法提取得到的rnc-rna。图2为实施例1得到的传统凝胶层析方法提取的rnc，泳道1为dnamarker，泳道2-3为使用传统凝胶层析方法提取的rnc-rna。图3为实施例1得到的dnasei基因mrna覆盖图谱图，图中曲线1对应分子筛离心柱法，曲线2对应蔗糖密度超速离心法。图4为实施例1得到的分子筛层析柱法和蔗糖密度超速离心法基因表达量相关性分析结果图。图5为实施例1得到的分子筛离心柱法与技术重复基因表达量相关性分析结果图。图6为实施例1得到的蔗糖密度超速离心法与技术重复基因表达量相关性分析结果图。图7为实施例2不同制备方法得到的rnc-rna通过3％琼脂糖凝胶电泳检测得到的结果图；其中，泳道1为dnamarker，泳道2为a549细胞总rna(trizol法提取)，泳道3-6分别为分子筛离心柱法提取的rnc-rna，泳道7为蔗糖密度超速离心法提取的rnc-rna。图8为实施例2得到的rps2基因mrna覆盖图谱图，图中曲线1对应分子筛离心柱法，曲线2对应蔗糖密度超速离心法。图9为实施例2得到的分子筛层析柱法和蔗糖密度超速离心法基因表达量相关性分析结果图。图10为实施例2得到的分子筛离心柱法与技术重复基因表达量相关性分析结果图。图11为实施例3不同制备方法得到的rnc-rna通过2％琼脂糖凝胶电泳检测得到的结果图：其中，泳道1为dnamarker，泳道2为大肠杆菌总rna(trizol法提取)，泳道3为裂解产物上清rna(trizol法提取)，泳道4-6为分子筛离心柱法提取的rnc-rna，泳道7为蔗糖密度超速离心法提取的rnc-rna。图12为实施例3得到的rpmb基因mrna覆盖图谱图，图中曲线1对应分子筛离心柱法，曲线2对应蔗糖密度超速离心法。图13为实施例3得到的分子筛层析柱法和蔗糖密度超速离心法基因表达量相关性分析结果图。图14为实施例2得到的分子筛离心柱法与技术重复基因表达量相关性分析结果图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及
技术领域：
的技术人员通常理解的相同的含义，如“分子筛离心柱”和“凝胶过滤离心柱”“排阻层析离心柱”“凝胶色谱离心柱”。本发明中所述的分子筛离心柱不等同于凝胶层析柱或分子筛层析柱，在纯化手段和设备上均不相同。使用凝胶层析柱纯化通常需要在层析系统中进行纯化，如geaktapure系统，单独的柱很难操作，不实用。本发明中所述的使用分子筛离心柱快速完整获取mrna核糖体新生肽链复合物的方法的核心实施工具为分子筛离心柱。实施例1使用分子筛离心柱快速完整获取动物组织(balb/c小鼠肾脏)内mrna核糖体新生肽链复合物，具体步骤如下：(1)取出分子筛离心柱(microspins-400hr-gehealthcare)，使用3ml无rnase的柱平衡缓冲液(20mm、ph7.4的hepes-koh溶液、15mmmgcl2、200mmkcl)进行柱平衡，然后入4℃冰箱待柱填料沉降过夜。(2)解剖6周龄balb/c小鼠(广东省医学动物实验中心)，获取肾脏器官，使用dpbs溶液快速清洗血液，放入液氮中急冻。(3)将小鼠肾脏放入研磨管中，使用组织研磨仪进行研磨。(4)向研磨管中加入1ml的细胞裂解液，细胞裂解液的组成如下：20mm、ph7.4的hepes-koh溶液、15mmmgcl2、200mmkcl、100μg/ml的放线菌酮，2mmdtt(二硫苏糖醇)，1％(v/v)tritonx-100；裂解25min，得到小鼠肾脏组织裂解产物。(5)将小鼠肾脏组织裂解产物于17000g离心5min，取上清液，去除大碎片；将得到的上清液再于17000g离心15min，去除小碎片，将得到的上清液转移到另一个ep管中。(6)取出步骤(1)沉降好的分子筛离心柱，于600g离心2min除去柱内的液体，得到制备完成的分子筛离心柱。(7)快速取50μl步骤(5)最终获得的裂解上清液，小心逐滴加入到分子筛离心柱柱床表面，不要冲散柱床表面，于600g离心1min，收集滤液，滤液即纯化好的rnc。(8)使用trizolrna提取试剂(invitrogen公司)，按其说明手册方法操作，从上述rnc溶液中提取rnc-rna。(9)按专利zl201410452522中实施例1所述方法从同批小鼠肾脏组织中使用蔗糖密度超速离心法提取rnc，并用trizol试剂提取rnc-rna，作为对比。(10)取步骤(5)中的裂解上清液，使用凝胶层析系统提取rnc，上清液上sephacryls400层析柱(gehealthcare)，用1×rbbuffer(20mm、ph7.4的hepes-koh溶液、15mmmgcl2、200mmkcl、100μg/ml的放线菌酮，2mmdtt(二硫苏糖醇))洗脱，接取穿透峰，使用trizolrna提取试剂(invitrogen)，按其说明手册方法操作，从上述rnc溶液中提取rnc-rna。(11)使用mgieasyrna文库制备试剂套装对使用分子筛离心柱和蔗糖密度超速离心法提取的rnc-rna中的mrna进行测序建库，bgiseq-500测序仪进行二代测序，获取翻译组测序信息(正在翻译中的mrna定量信息)。(12)为检验本方法可以提出与蔗糖密度超速离心法同样高质量rnc，本实验使用同一批次的组织样品进行蔗糖密度超速离心提取rnc，然后与使用分子筛离心柱提取的rnc进行实验结果对比分析。(13)为检验本发明方法可以从组织中提出未降解的rnc-rna，我们将部分的组织rnc-rna样品进行2％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，与蔗糖密度超速离心法提取的rnc进行比对，使用gelred染色，紫外凝胶成像系统成像。结果如图1所示：泳道4、5为分子筛离心柱提取rnc-rna，泳道6、7为蔗糖密度超速离心法提取rnc-rna。由图1可知，分子筛离心柱提取得到的rnc-rna的28srrna和18srrna条带明亮清晰，无明显拖尾，无降解，在rnc完整度上和蔗糖密度超速离心法具有同样的提取效果，在蔗糖密度超速离心法得到的rnc-rna的28srrna条带上方肉眼可见存在杂带污染，而分子筛离心柱法在28srrna条带上方不存在杂带。图2使用传统凝胶层析方法(使用geakta系统)提取的rnc组分，其rna降解严重，28s和18srrna完全降解，不可用于mrna测序。因此电泳结果显示分子筛离心柱纯化效果优于蔗糖密度超速离心法和传统凝胶层析法。(14)将测序数据的全部测序片段(reads)进行接头去除，使用fanse3算法比对至小鼠转录组参考序列及小鼠参考基因组。(15)为检验本发明方法能够提取到全长mrna，使用步骤(14)中的转录组参考序列比对数据绘制全长mrna覆盖图谱，以基因dnasei为例。结果如图3所示，测序结果和蔗糖密度超速离心法相同，可以覆盖整条mrna。(16)为检验本发明方法提取出的rnc-mrna基因表达定量效果与蔗糖密度超速离心法相似性高，使用步骤(14)中的转录组参考序列比对数据计算rpkm，计算微生物样品的分子筛离心柱rnc基因表达量rpkm和蔗糖密度超速离心法rnc基因表达量rpkm的pearson相关系数，结果如图4。由图4结果可知，分子筛离心柱rnc基因表达量rpkm和蔗糖密度超速离心法rnc基因表达量rpkm的pearson相关系数r2＝0.98408，相关性非常高，可认为重复性很好，表明分子筛离心柱和蔗糖密度超速离心法对组织rnc具有相同的提取效果。(17)为检验本发明的技术重复性，使用(16)中的基因表达量rpkm数据分别计算分子筛离心柱法和蔗糖密度超速离心法与其技术重复的pearson相关系数r2，结果如图所示，图5为分子筛离心柱法与技术重复计算结果，r2＝0.99229，图6为蔗糖密度超速离心法与技术重复计算结果，r2＝0.98239。结果表明：分子筛离心柱法的技术重复性优于蔗糖密度超速离心法。(18)为检验本发明的基因鉴定数量和蔗糖密度超速离心法相似，使用步骤(14)中的转录组参考序列比对数据统计比对到每个基因上的测序片段数量(readcounts)，readcounts>10的基因认为是在该样品中有表达的基因，结果如表1所示。由表1结果可知，分子筛离心柱提取的rnc能够定量到14567个基因，而蔗糖密度超速离心法能够定量到14648个基因，基因鉴定数量的波动在正常技术重复波动范围内，如果纯化效果差，鉴定到的基因数会显著增多。(19)为检验本发明方法提取出的rnc-mrna和蔗糖密度超速离心法提取的rnc-mrna不存在过多的差异基因，使用edger分析步骤(18)中readcounts数据，鉴定分子筛离心柱提取的rnc与蔗糖密度超速离心法提取rnc之间的差异基因，pvalue<0.01的基因认为是差异基因，结果如表2所示。分子筛离心柱和蔗糖密度超速离心法之间不存在差异基因，可以认为两个技术无显著差异。实施例2使用分子筛离心柱快速完整获取人非小细胞肺癌细胞a549(中国科学院细胞库)内mrna核糖体新生肽链复合物，步骤如下：(1)取出分子筛离心柱(microspins-400hr-gehealthcare)，使用3ml的柱平衡缓冲液(20mm、ph7.4的hepes-koh溶液、15mmmgcl2、200mmkcl)进行柱平衡，然后置于4℃冰箱待柱填料沉降过夜。(2)向细胞培养瓶(1000万个a549细胞)中加入1ml细胞裂解液，细胞裂解液的组成如下：20mm、ph7.4的hepes-koh溶液、15mmmgcl2、200mmkcl、100μg/ml放线菌酮、2mmdtt、1％(v/v)tritonx-100；裂解25min，得到细胞裂解产物。(3)细胞裂解产物于17000g离心5min去除大碎片，取上清液17000g离心15min去除小碎片，然后将裂解上清液转移到另一个ep管中。(4)取出沉降好的分子筛离心柱，于600g离心2min除去柱内的液体，得到制备完成的分子筛离心柱。(5)快速取50μl裂解上清液，小心逐滴加入到分子筛离心柱柱床表面，不要冲散柱床表面，于600g离心1min收集滤液，滤液即纯化好的rnc。(6)使用trizolrna提取试剂(invitrogen公司)，按其说明手册方法操作，从上述rnc溶液中提取rnc-rna。(7)使用蔗糖密度超速离心法提取rnc作为对照，将剩余的裂解上清液分别加入到不同的装有14.5ml30％(w/v)蔗糖溶液表面(由100μg/ml放线菌酮和2mmdtt的柱平衡缓冲液配制)，4℃、42500rpm超速离心5h，将沉淀重悬，全程在冰上进行操作。使用trizolrna提取试剂(invitrogen公司)，按其说明手册方法操作，从rnc中提取rnc-rna。(8)使用mgieasyrna文库制备试剂套装对使用分子筛离心柱和蔗糖密度超速离心法提取的rnc-rna中的mrna进行测序建库，bgiseq-500测序仪进行二代测序，获取翻译组测序信息(正在翻译中的mrna定量信息)。(9)为检验本方法可以提出与蔗糖密度超速离心法同样高质量rnc，本实验使用同一批次的细胞样品进行蔗糖密度超速离心提取rnc，然后与使用分子筛离心柱提取的rnc进行实验结果对比分析。(10)为检验本发明方法可以从细胞中提出未降解的rnc-rna，我们将部分的细胞rnc-rna样品进行2％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，与蔗糖密度超速离心法提取的rnc进行比对，使用gelred染色，紫外凝胶成像系统成像检测。结果如图7所示，泳道3、4、5、6为分子筛离心柱法提取的rnc-rna，泳道7为蔗糖密度超速离心法提取的rnc-rna。由图7可知，分子筛离心柱提取的rnc-rna的28srrna和18srrna条带明亮清晰，无明显降解，在rnc完整度上和蔗糖密度超速离心法具有同样的提取效果，在蔗糖密度超速离心法的28srrna条带上方肉眼可见存在杂带污染而分子筛离心柱法在28srrna条带上方不存在杂带，电泳结果显示本方法纯化效果优于蔗糖密度超速离心法。(11)将测序数据的全部测序片段(reads)进行接头去除，使用fanse3算法比对至人转录组参考序列及人参考基因组序列。(12)为检验本发明方法能够提取到全长mrna，使用步骤(11)中的转录组参考序列比对数据绘制全长mrna覆盖图谱，以基因rps2为例，结果如图8所示，测序结果和蔗糖密度超速离心法相同，可以覆盖整条mrna。(13)为检验本发明方法提取出的细胞rnc-mrna基因表达定量效果与蔗糖密度超速离心法相似，使用步骤(11)中的转录组参考序列比对数据计算rpkm，通计算微生物样品的凝胶过滤法rnc的基因表达量rpkm和蔗糖密度超速离心法rnc基因表达量rpkm的pearson相关系数。结果如图9所示，分子筛离心柱rnc基因表达量rpkm和蔗糖密度超速离心法rnc基因表达量rpkm的pearson相关系数平方r2＝0.98239，相关性非常高，可认为两者是技术重复，表明分子筛离心柱和蔗糖密度超速离心法对细胞rnc具有相同的提取效果。(14)为检验本发明的技术重复性，使用(13)中的基因表达量rpkm数据计算分子筛离心柱法与其技术重复的pearson相关系数r2，结果如图10所示，图10为分子筛离心柱法与技术重复计算结果，r2＝0.99363。结果表明：分子筛离心柱法具有良好的技术重复性。(15)为检验本发明提取的rnc基因鉴定数量和蔗糖密度超速离心法相似，使用步骤(11)中的转录组参考序列比对数据统计比对到每个基因上的测序片段数目(readcounts)，readcounts>10的基因认为是在该样品中有表达的基因，结果如表1所示。由表1结果可知，分子筛离心柱提取的rnc能够定量到14704个基因，而蔗糖密度超速离心法能够定量到14736个基因，基因鉴定数量的波动在正常技术重复波动范围内。(16)为检验本发明方法提取出的rnc-mrna和蔗糖密度超速离心法提取的rnc-mrna不存在过多的差异基因，使用edger分析步骤(15)中readcounts数据，鉴定分子筛离心柱提取的rnc与蔗糖密度超速离心法提取rnc之间的差异基因，pvalue<0.01的基因认为是差异基因，结果如表2所示。由表2可知，分子筛离心柱和蔗糖密度超速离心法之间只存在3个差异基因，可以认为两个技术无显著差异，属于测序误差范围内。实施例3使用分子筛离心柱快速完整获取微生物(大肠杆菌k-12bw25113，biovector中国质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心)内mrna核糖体新生肽链复合物，步骤如下：(1)取出分子筛离心柱(microspins-400hr-gehealthcare)，使用3ml的柱平衡缓冲液(10mm、ph7.8的tris、50mmnh4cl、0.01mmgcl2)进行柱平衡，然后入4℃冰箱待柱填料沉降过夜。(2)将大肠杆菌bw25113甘油种划线lb平板，培养过夜。(3)挑平板上单菌落，接种于3mllb液体培养基中，37℃、200rpm活化过夜。(4)按体积百分比1％的接种量接种活化后的种子液，接种于50mllb液体培养基中，37℃、200rpm培养至培养液od600＝0.6。(5)向步骤(4)所得培养液中加入氯霉素，氯霉素在培养中的浓度为100μg/ml，冰水中摇动5min速冷至4℃，4℃、5000g离心5min，去上清。(6)向步骤(5)所得沉淀加入4℃预冷的50mlpbs(含100μg/ml氯霉素)，重悬沉淀，4℃、5000g离心5min收集菌，弃上清。(7)重复步骤(6)；(8)向步骤(7)所得沉淀加入4℃预冷溶菌酶(lysozyme)缓冲液(sigma)5.4ml，重悬细胞沉淀，加入0.6ml溶菌酶酶液(12.5mg/ml，溶菌酶溶于pbs溶液)，轻轻吹打混匀，置于冰上静置5min，每隔1min轻轻摇匀，加入浓度为1m的mgcl2溶液0.15ml，轻轻摇匀，4℃、5000g离心5min收菌，弃上清。(9)向上步所得沉淀加入0.6ml4℃预冷的细胞裂解液(10mm、ph7.8的tris-hcl、50mmnh4cl、10mmmgcl2、0.2％(v/v)tritionx-100、100μg/ml氯霉素)，吹打重悬沉淀，冰上静置5min，4℃、17000g离心15min，然后将裂解上清液转移到另一个ep管中。(10)取出沉降好的分子筛离心柱，于600g离心2min除去柱内的液体，得到制备完成的分子筛离心柱。(11)快速取50μl裂解上清液，小心逐滴加入到分子筛离心柱柱床表面，不要冲散柱床表面，于600g离心1min收集滤液，滤液即纯化好的rnc。(12)使用trizolrna提取试剂(invitrogen公司)，按其说明手册方法操作，从上述rnc溶液中提取rnc-rna。(13)使用蔗糖密度超速离心法提取rnc作为对照。将剩余的裂解上清液分别加入到不同的装有14.5ml35％(w/v)蔗糖浓度的hepe缓冲液上，4℃42500rpm超速离心5h，将沉淀重悬，全程在冰上进行操作。使用trizolrna提取试剂(invitrogen公司)，按其说明手册方法操作，从rnc中提取rnc-rna。(14)使用mgieasyrna文库制备试剂套装对微生物样品使用分子筛离心柱和蔗糖密度超速离心法提取的rnc-rna中的mrna进行测序建库，bgiseq-500测序仪进行二代测序，获取翻译组测序信息(正在翻译中的mrna定量信息)。(15)为检验本方法可以提出与蔗糖密度超速离心法同样高质量rnc，本实验使用同一批次的微生物样品进行蔗糖密度超速离心提取rnc，然后与使用分子筛离心柱提取的rnc进行实验结果对比分析。(16)为检验本发明方法可以从微生物中提出未降解的rnc-rna，我们将部分微生物rnc-rna样品进行2％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，与蔗糖密度超速离心法提取的rnc进行比对，使用gelred染色，紫外凝胶成像系统成像拍摄，结果如图11所示，泳道4、5、6为分子筛离心柱提取的rnc-rna，泳道7为蔗糖密度超速离心法提取的rnc-rna。由图11可知，分子筛离心柱提取的rnc-rna的23srrna和16srrna条带明亮清晰，无明显降解和蔗糖密度超速离心法相比具有同样的提取效果。(17)将测序数据的全部测序片段(reads)进行接头去除，使用fanse3算法比对至大肠杆菌基因组和大肠杆菌转录组。(18)为检验本发明方法能够提取到全长mrna，使用步骤(17)中的转录组参考序列比对数据绘制全长mrna覆盖图谱，以基因rpmb为例，结果如图12所示，测序结果和蔗糖密度超速离心法相同，可以覆盖整条mrna。(19)为检验本发明方法提取出的rnc-mrna基因表达定量结果与蔗糖密度超速离心法相同，使用步骤(17)中的转录组参考序列比对数据计算rpkm，计算微生物样品的分子筛离心柱rnc基因表达量rpkm和蔗糖密度超速离心法rnc的基因表达量rpkm的pearson相关系数。结果如图13所示，分子筛离心柱法rnc基因表达量rpkm和蔗糖密度超速离心法rnc基因表达量rpkm的pearson相关系数平方r2＝0.98627，相关性非常高，可认为两者是技术重复。(20)为检验本发明的技术重复性，使用(19)中的基因表达量rpkm数据计算分子筛离心柱法与其技术重复的pearson相关系数r2，结果如图14所示，图14为分子筛离心柱法与技术重复计算结果，r2＝0.98329。结果表明：分子筛离心柱法具有良好的技术重复性。(21)为检验本发明的提取rnc-mrna基因鉴定数量和蔗糖密度超速离心法相似，使用步骤(17)中的转录组参考序列比对数据统计比对到每个基因上的测序片段数目(readcounts)，readcounts>10的基因认为是在该样品中有表达的基因，结果如表1所示。由结果可知，分子筛离心柱提取的rnc能够定量到4189个基因，而蔗糖密度超速离心法能够定量到4118个基因，由于样品之间存在测序通量差异，基因鉴定数量的波动在正常技术重复波动范围内。(22)为检验本发明方法提取出的rnc-mrna和蔗糖密度超速离心法提取的rnc-mrna不存在过多的差异基因，使用edger分析步骤(21)中readcounts数据，分析分子筛离心柱提取的rnc与蔗糖密度超速离心法提取rnc之间的差异基因，pvalue<0.01的基因认为是差异基因，结果如表2所示。由表2可知，分子筛离心柱法和蔗糖密度超速离心法之间不存在差异基因，可以认为两个技术不存在显著差异，属于测序误差范围内。表1实施例1、2、3的基因鉴定数量表2实施例1、2、3鉴定的差异基因数量样品差异基因数目balb/c小鼠肾脏0细胞(a549)3大肠杆菌k-12bw251130上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12