一种登革热模型的构建方法与流程

本发明属于生物模型构建技术领域，尤其涉及一种登革热模型的构建方法。

背景技术：

登革热是一种蚊媒病毒感染，感染后出现流感样症状；有时还会发展为可能致命的并发症，这称为重症登革热。近几十年全球登革热发病率大幅度增长，现在约有一半世界人口面临登革热的危险。在亚洲和拉丁美洲一些国家，重症登革热是导致儿童严重患病和死亡的一个主要原因。登革热的预防和控制呼唤依赖于denv基础研究的重要进展，然而denv基础研究受限于感染模型。

目前denv昆虫感染模型主要是埃及伊蚊，由于蚊子因遗传背景不清晰且基因组操作困难，这使得研究受到限制。黑腹果蝇是经典的遗传学研究生物，其优势主要有：体积小、易于操作、饲养简单、成本低廉、生命周期短(约两周)、繁殖力强、子代数量多，以及便于进行表型分析，有利于一般实验室使用等。因遗传操作工具丰富，可实现黑腹果蝇的全基因组水平基因的表达下调。果蝇基因组序列分析表明，超过60％的人类疾病基因在果蝇中有直系同源基因。在抗病毒研究方法，果蝇感染模型一方面可以为人类的抗病毒天然免疫提供参考，另一方面也可以作为传播病毒媒介的重要替代研究模型。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种登革热模型的构建方法，其能为denv感染研究提供重要的模型，便于深入了解denv病毒在昆虫和人类中的感染机制以及研发出抗病毒药物。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种登革热病毒，其采用白纹伊蚊的c6/36细胞培养得到denv病毒ii型。

另外，本发明还提供所述的登革热病毒在构建登革热模型中的应用，所述登革热模型的生物是黑腹果蝇或黑腹果蝇胚胎细胞。

另外，本发明还提供一种登革热模型的构建方法，其包括以下步骤：向黑腹果蝇或黑腹果蝇胚胎细胞内注射登革热病毒；所述登革热病毒采用白纹伊蚊的c6/36细胞培养得到denv病毒ii型得到。

作为上述技术方案的改进，所述登革热病毒的注射量为10moi。

作为上述技术方案的改进，所述构建方法包括以下步骤：采用rnai干扰方法下调黑腹果蝇的argonaute-2基因，再向黑腹果蝇体内注射登革热病毒。

作为上述技术方案的改进，所述构建方法包括以下步骤：采用rnai干扰方法下调黑腹果蝇胚胎细胞中表达stat92e转录因子和upd3配体的基因，再向黑腹果蝇胚胎细胞内注射登革热病毒。

作为上述技术方案的改进，所述构建方法包括以下步骤：采用rnai干扰方法下调黑腹果蝇中表达信号转导衔接蛋白的stam基因，再向黑腹果蝇内注射登革热病毒。

本发明的有益效果在于：本发明提供一种登革热模型的构建方法，本发明发现：1)denvii型43株能够比较有效地感染黑腹果蝇胚胎细胞，是比较适合构建denv感染果蝇模型的病毒株；2)ago-2基因表达下调的黑腹果蝇可以有效地支持denvii型43株的感染复制；3)stat92e转录因子和upd3配体表达下调的黑腹果蝇胚胎细胞可以有效地支持denvii型43株的感染复制；4)stam基因表达下调的黑腹果蝇可以有效地支持denvii型43株的感染复制；本发明登革热模型的生物是黑腹果蝇或黑腹果蝇胚胎细胞，首次成功建立denv感染的果蝇模型，能够较好地模拟denv感染蚊子和人类，可为denv在昆虫和人类感染机制及抗病毒药物治疗研究提供较好的理论依据。

附图说明

图1显示denv病毒ii型43株感染黑腹果蝇s2细胞；其中，感染的黑腹果蝇s2细胞能产生非结构蛋白ns1，彩色图中显示绿色荧光(图中未能视出)；

图2显示黑腹果蝇ago-2下调后支持denvii型43株的感染复制；其中，黑色shmcherry表示野生型，灰色shago-2表示ago-2下调；denv感染15h后，ago-2下调组感染的效果更显著；

图3显示下调的免疫通路对denv感染复制的影响；其中，下调stat92e转录因子和upd3配体可以稳定且显著地支持denv感染复制；

图4显示stam下调的黑腹果蝇注射denv后的存活率；

图5显示stam下调的黑腹果蝇注射denv后，denv的复制情况；图中，每个时间点分为2组：从左至右依次是野性型果蝇和stam缺陷型果蝇。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

denvii43能够有效地感染黑腹果蝇s2细胞

方法：现有技术公开denv很难感染果蝇细胞，本发明采用白纹伊蚊的c6/36细胞培养得到denv病毒ii型43株，经浓缩、感染黑腹果蝇s2细胞(胚胎细胞)，然后采用免疫荧光分析s2细胞中阳性表达denvns1蛋白的比率。

如图1所示，10moidenv可以有效地感染s2细胞；感染5天后分析，发现感染率可以达到50％以上；这表明denvii型43株能够比较有效地感染黑腹果蝇s2细胞，其是比较适合构建denv感染黑腹果蝇模型的病毒株。

denvii型43株有效地感染黑腹果蝇

方法：利用浓缩的denvii型43株病毒，注射黑腹果蝇，在denv感染的不同时间点，收取黑腹果蝇，检测果蝇体内的denvrna水平。

如图2所示，野生型黑腹果蝇中denv维持低水平的复制，但在经ago-2(argonaute-2基因)rnai干扰的黑腹果蝇中，denv在感染后期可以比较有效地复制。该结果提示，ago-2表达下调的黑腹果蝇可以比较有效地支持denvii型43株的感染复制。

s2细胞感染模型可用于抗病毒天然免疫相关研究

方法：利用dsrna下调s2细胞中的抗病毒天然免疫通路的关键基因，然后利用denvii型43株感染该s2细胞，感染4天后，收取细胞，用trizol法抽提出细胞总rna；用反转录试剂盒primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser合成cdna；实时定量pcr：用试剂盒sybrgreentmpremix进行qpcr，检测denvrna量。

如图3所示，jak-stat通路中下调stat92e转录因子和upd3配体可以明显观察到更高水平的denvrna；这表明jak-stat调控denv的感染复制。

stam(信号转导衔接蛋白)缺陷型的黑腹果蝇能够更好地支持denv感染

方法：利用rnai果蝇库，本发明注射denv病毒，在感染不同时间点检测denvrna拷贝数和存活率。

在筛选1000多株黑腹果蝇，本发明发现stam表达下调的果蝇，能够较好地支持denv感染。stam表达下调的果蝇感染denvii型43株后，果蝇存活率低(如图4所示)，同时在感染15d后denv病毒载量也更高(如图5所示)。

最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。