一种制备人脐带间充质干细胞外泌体的方法与流程

本发明涉及一种制备人脐带间充质干细胞外泌体的方法，属于细胞培养领域。

背景技术：

脐带间充质干细胞是来源于脐带华通胶组织的间充质干细胞，其来源广泛、免疫原性低，并具有多项分化、免疫调节和造血支持等功能，已经成为细胞治疗的种子细胞，在多种疾病包括糖尿病、神经系统疾病、肝病、心血管疾病、自身免疫疾病等疾病中都有很好的临床疗效，但其发挥作用的机制目前还不明确。最初认为脐带间充质干细胞植入人体后归巢到受损部位，进行细胞自我更新和定向分化，但后续研究表明移植的细胞大部分发生了凋亡，归巢到损伤部位的细胞和分化为靶细胞的数量有限，不能充分解释其组织修复现象。现在越来越多的研究认为脐带间充质干细胞是通过旁分泌机制分泌大量的细胞因子作用于受损部位，进而促进组织修复。

外泌体(exosomes)是一种由多种细胞在正常或病理状态下分泌的微小囊泡，直径在30-150nm，具有脂质双层膜结构。外泌体的功能取决于其来源的细胞类型，其在机体免疫应答、肿瘤生长和迁移、细胞分化、细胞通讯和组织稳态等方面发挥重要作用，在组织再生方面具有良好的临床应用前景。

有研究表明干细胞来源的外泌体与靶细胞通过膜融合或者内吞作用后将生物活性物质转运至靶细胞，介导细胞间通讯并影响靶细胞功能，还具有抑制炎症反应、免疫调节、血管生成、参与组织修复的功能。与干细胞相比，干细胞外泌体更稳定，更安全，保存更方便，质量更好控制，有望成为一种新的治疗方法。

现在大部分研究中采用胎牛血清或血清替代物培养脐带间充质干细胞，收集上清液直接制备外泌体，并未去除血清和血替中自身携带的外泌体，因此成分不纯；有些研究或试剂盒中会加入化学试剂(聚乙二醇)或其他试剂等，可能会引入热源或污染等，也会影响后续研究和临床应用。因此如何去除血清或血清替代物自身携带的外泌体，保证脐带间充质干细胞外泌体的纯度非常重要。

目前提取外泌体的方法主要有超高速离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、试剂盒法、色谱法等。密度梯度离心法得到的样本较纯，但是比较耗时，操作复杂，不利于大规模生产；免疫磁珠法和色谱法也存在效率低，难以大规模生产的问题；试剂盒法操作简单，但是成本比较高，分离的外泌体纯度较低。因此，研究一种高效的、利于大规模生产的、高纯度的脐带间充质干细胞外泌体的制备方法对开展外泌体的科学研究和临床试验研究尤为重要。

技术实现要素：

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种制备人脐带间充质干细胞外泌体的方法，并确保脐带间充质干细胞外泌体的来源。本发明是以新生儿脐带为脐带间充质干细胞来源，使用去除自身携带的外泌体的胎牛血清或者血清替代物配制的培养基培养，收集上清液进一步采用差速离心法分离提取外泌体，操作简单、纯度高、适用于大规模生产。

一种制备人脐带间充质干细胞外泌体的方法，包括如下步骤：

1)脐带间充质干细胞的培养

采集足月剖宫产新生儿脐带剪成2-3cm小段，清洗后剥出华通胶剪至1mm²小块，均匀铺于培养瓶中，置于37℃、5％co2浓度的培养箱中培养，8-24h内加入15ml完全培养基覆盖组织块，培养至第五天半换液，此后每隔2-3天换液，细胞融合度达到70-80％时，吸出组织块加到一个新的培养瓶中，补加培养基到15ml，1-2天后观察新的细胞从组织块周围爬出，融合度达到70％-80％左右时进行传代，记为p1，持续传代操作，获得二次贴壁细胞的p2代到p5代作为实验用的脐带间充质干细胞；

2)脐带间充质干细胞的鉴定

收集步骤1)获得的p2-p5代脐带间充质干细胞pbs漂洗二次，离心去上清液，加入pbs重悬后分装，分别加入10μlpe标记的鼠抗人cd34，cd44，cd45，cd73，cd90，cd105和同型对照，鉴定细胞表型；

3)脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备

配制含10％去除外泌体的fbs的完全培养基，选择步骤1)中制备的生长状态良好的脐带间充质干细胞用含10％去除外泌体的fbs的完全培养基培养，细胞的融合度达到70-80％时更换新的含10％去除外泌体的fbs的完全培养基继续培养48h，收集培养上清液；

将上述上清液放入冷冻离心机，300g，4℃离心8-10min，去除细胞碎片获得上清液a；将上清液a继续放入离心机2000g，4℃离心8-10min去除完整细胞和死细胞，获得上清液b；将上清液b继续放入离心机10,000g，4℃离心28-30min去除沉淀获得上清液c；0.22μm滤器过滤上清液c，去除大于200nm的粒子，获得上清液d；将上清液d放入超速离心机，100,000g，4℃离心115-120min，弃上清，用预冷的pbs清洗获得的沉淀e；将沉淀e放入超速离心机，100,000g，4℃离心115-120min，弃上清，沉淀用预冷的pbs重悬，获得重悬液标记后储存。

进一步的，步骤1)中所述完全培养基为去除自身携带的外泌体的胎牛血清或者血清替代物配制的dmem/f12或α-mem培养基。

进一步的，上述去除自身携带的外泌体的胎牛血清或者血清替代物在完全培养基中的比例分别为10～20％，5％～10％；

所述血清替代物指elitegrotm-adv，购于biomedicalelitecellcorp。

进一步的，上述含有去除自身携带的外泌体的胎牛血清的完全培养基包括如下组分：

430-450mlα-mem培养基中加入50ml去外泌体的胎牛血清(fbs)，20-25μg的人表皮生长因子(egf)，10-12μg的血管内皮生长因子(vegf)。

进一步的，上述含有去除自身携带的外泌体的血清替代物的完全培养基包括如下组分：

460-475ml的α-mem培养基，20-25ml的elitegrotm-adv。

进一步的，上述去除胎牛血清或者血清替代物自身携带的外泌体的制备方法为：

采集胎牛血清或者血清替代物使用超高速离心机100,000g，4℃离心10-12小时，收集上清即可获得去除自身携带的外泌体的胎牛血清或者血清替代物。

进一步的，步骤1)所述的传代操作包括如下步骤：

s1将培养瓶中的细胞使用生理盐水冲洗两遍；

s2在步骤s1中冲洗后的细胞中加入0.05％胰蛋白酶-edta消化1min，加入含10％fbs的完全培养基终止消化；

s3使用pbs重悬消化后的细胞并计数，按照5×10⁴个/ml进行传代培养。

有益效果：

(1)大部分研究中采用胎牛血清或血清替代物培养脐带间充质干细胞，收集上清液直接制备外泌体，并未去除血清和血替中自身携带的外泌体，因此成分不纯，会影响后续研究和临床应用。本发明采用去除自身外泌体的血清或血清替代物的完全培养基培养脐带间充质干细胞，收集的上清液用于制备外泌体，纯度更高，来源明确。

(2)采用差速离心法制备外泌体，操作简单，易于大规模生产。

(3)整个过程保证无菌无支原体污染，产品安全性更高。

附图说明

图1原代培养的脐带间充质干细胞的细胞形态。

图2第2代脐带间充质干细胞的细胞形态。

图3第3代脐带间充质干细胞的细胞表面标志物。

图4电镜下观察到的脐带间充质干细胞外泌体。

具体实施方式

本发明提供了一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

1、脐带间充质干细胞的培养和鉴定

1.1分离培养：无菌条件下采集足月剖宫产新生儿脐带，4小时内进行处理。将脐带用剪刀剪成约2-3cm/小段，用含青霉素-链霉素的生理盐水反复清洗脐带，去除表面血渍。剔除三根血管和羊膜，剥出华通胶，用剪刀将华通胶剪碎至约1mm²的小块，均匀铺于t75cm²培养瓶中(铺瓶时，尽量组织块均匀分布，中间留出空隙，不要剪出气泡，不利于细胞爬出)，置于37℃、5％co2浓度的培养箱中培养，8-24h内(不要铺完组织立即加入培养基，防止太早加入培养基组织贴壁不牢，也不能晚于24小时，怕组织干燥不利于细胞爬出)加入15ml完全培养基(450mlα-mem培养基中加入50ml的胎牛血清(fbs)，25μg的人表皮生长因子(egf)，10μg的血管内皮生长因子(vegf))，轻轻晃动培养瓶使培养基覆盖组织块，于37℃、5％co2浓度的培养箱中继续培养(前五天严禁挪动培养瓶)。第5天观察细胞爬出情况并半换液，以后每隔2-3天换液(换液时动作要轻缓，防止组织块漂起)。

当局部细胞融合度达到70％-80％左右时，吸出组织块加到一个新的培养瓶中，补加培养基到15ml，二次贴壁的细胞第2-3天后观察新的细胞从组织块周围爬出，第4-5天融合度达到70％-80％，二次贴壁的细胞如图1所示，a为二次贴壁培养第2天的细胞形态(×40)；b为二次贴壁培养第3天的细胞形态(×40)；c为二次贴壁培养第5天的细胞形态(×40)。细胞进行传代操作，吸弃组织块和培养基，加入生理盐水冲洗两遍，加入0.05％胰蛋白酶-edta消化1min，加入含10％fbs的完全培养基终止消化，重悬细胞后计数，按照5×10⁴个/ml进行传代。p2-p5代脐带间充质干细胞用来测定细胞表型，提取和制备外泌体。p2代脐带间充质干细胞如图2所示，其中，a为传代后第2天的细胞形态(×40)；b为传代后第3天的细胞形态(×40)。

1.2细胞表型鉴定：收集一定数量的脐带间充质干细胞悬液于离心管中，1200rpm离心8min，弃上清液，加入10mlpbs洗两次，离心弃上清，保留细胞，加pbs重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁷个/ml，分装100μl/ep管，加入10μlpe标记的鼠抗人cd34，cd44，cd45，cd73，cd90，cd105和同型对照，混匀，37℃避光孵育30min。1200rpm离心8min，弃上清，pbs洗涤细胞2次，离心后用200μlpbs重悬细胞，流式细胞仪上机检测。表面标记物的含量如图3所示。实验结果表明脐带间充质干细胞高表达cd44、cd73、cd90和cd105，不表达cd34和cd45，表明脐带间充质干细胞符合间充质干细胞的表型特征。

2、脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备：

具体制备方法如下：

2.1去外泌体的fbs制备：超高速离心机100,000g，4℃离心12小时，收集上清，去除胎牛血清自身携带的外泌体，配制含10％去外泌体的fbs的完全培养基：(450mlα-mem培养基中加入50ml去外泌体的胎牛血清(fbs)，25μg的人表皮生长因子(egf)，10μg的血管内皮生长因子(vegf))。

2.2上清液收集：选择生长状态良好的p2-p5代脐带间充质干细胞，用含10％fbs的完全培养基(450mlα-mem培养基中加入50ml胎牛血清(fbs)，25μg的人表皮生长因子(egf)，10μg的血管内皮生长因子(vegf))培养，观察融合度达到70％-80％时，弃掉旧培养基上清液，加入生理盐水洗两遍，更换含10％去外泌体的fbs的完全培养基(450mlα-mem培养基中加入50ml去外泌体的胎牛血清(fbs)，25μg的人表皮生长因子(egf)，10μg的血管内皮生长因子(vegf))培养48小时。收集培养上清液，置于离心管中，放入4℃备用。

2.3外泌体的提取：

①台式冷冻离心机300g，4℃离心10min，去除细胞碎片，取上清液到新的离心管中。

②2000g，4℃离心10min去除完整细胞和死细胞，取上清液到新的离心管中。

③10,000g，4℃离心30min进一步去除细胞碎片，取上清液到新的离心管中。

④0.22μm滤器过滤该上清液，去除大于200nm的粒子，收集上清于新的超速离心管中。

⑤100,000g，4℃离心120min，弃上清，将沉淀用预冷的pbs清洗。

⑥100,000g，4℃离心120min，弃上清，将沉淀用预冷的pbs重悬，留取30μl重悬液用于透射电镜观察和10μl用于bca浓度测定，其余重悬液标记浓度，分装后-80℃储存。

3、透射电镜观察脐带msc外泌体的形态：取10μl外泌体悬液滴入2nm孔径的载样铜网上，室温静置1min；滤纸从一侧吸干滤网上的液体，再滴入30μl磷酸钨溶液(ph6.8)，室温下负染5min；滤纸吸干负染液，室温干燥，透射电镜下观察并选取角度拍照。电镜结果如图4(200nm，放大100000×)所示，可见外泌体的双层膜脂质结构，直径约30-150nm。