体外快速获得原代细胞的细胞培养方法与流程

本发明涉及细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种体外快速获得原代细胞的细胞培养方法。

背景技术：

细胞培养是指在体外模拟体内环境(无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等)，使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养包括原代培养和传代培养。

原代培养也叫初代培养，指直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的首次培养，原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。较为严格地说，原代培养是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。

细胞原代培养的方式又分为饲养层细胞培养方式和纯细胞因子培养方式。饲养层细胞是指一些特定的细胞经有丝分裂阻断剂处理后所得的细胞单层，在原代或初期培养阶段，细胞一般都需依赖于能分泌他们在体外存活增殖所必需的生长因子的饲养层细胞。不同类型的饲养层细胞分泌的生长因子略有不同，但都要求培养过程中的饲养层细胞不分裂不增殖而仍保持代谢活性。饲养层细胞是细胞培养常用的生长增殖促进剂和分化抑制剂。饲养层细胞培养方式价格相对便宜、效果稳定，但是由于培养过程中的饲养层细胞一般为肿瘤细胞，具有潜在风险。所以，提供一种新型通用性强的饲养层细胞及细胞的培养方法具有重要的意义。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种rm细胞在细胞培养中的应用，以缓解现有技术中细胞培养过程中通用性差、成本较高和存在潜在风险，细胞原代培养成功率低的技术问题。

本发明的第二目的在于提供一种饲养层细胞，以缓解现有技术中的饲养层细胞成本较高，存在潜在风险的技术问题。

本发明的第三目的在于提供一种饲养层细胞的制备方法，以缓解现有技术中的方法成本较高，操作繁琐的技术问题。

本发明的第四目的在于提供上述饲养层细胞在细胞培养中的应用。

本发明的第五目的在于提供一种细胞培养方法，以缓解现有技术中细胞培养复杂，成本较高，成功率较低的问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

rm细胞在细胞培养中的应用。

进一步地，所述rm细胞为饲养层细胞；

优选地，所述细胞培养为细胞原代培养；

优选地，所述细胞包括肿瘤细胞或正常细胞；

优选地，所述正常细胞包括正常上皮细胞；

优选地，所述rm细胞的来源包括商业化途径购买的rm细胞和合法途径获得的rm组织标本。

一种饲养层细胞，包括上述应用中的rm细胞。

进一步地，所述rm细胞传代次数为0-5次。

上述饲养层细胞的制备方法，0-5次传代培养的rm细胞经过有丝分裂阻断剂处理，得到所述饲养层细胞。

进一步地，所述传代培养的培养基为含有5-20％fbs的dmem培养基；

优选地，所述有丝分裂阻断剂为丝裂霉素；

优选地，所述丝裂霉素的浓度为1-20μg/ml。

上述饲养层细胞在细胞培养中的应用。

进一步地，所述细胞培养为细胞原代培养；

优选地，所述细胞包括肿瘤细胞或正常细胞；

优选地，所述正常细胞包括正常上皮细胞。

一种细胞培养方法，将上述饲养层细胞与目标细胞共培养。

进一步地，所述目标细胞包括肿瘤细胞或正常细胞；

优选地，所述正常细胞包括正常上皮细胞；

优选地，所述肿瘤细胞包括肺癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肾癌细胞或胃癌细胞；

优选地，所述细胞培养为细胞原代培养。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供rm细胞用于细胞培养的应用，以rm细胞作为细胞培养中的饲养层细胞，费用低，操作简单，在很大程度上降低了细胞培养，特别是细胞原代细胞培养在基础研究和临床应用中的成本。rm细胞有别于其他的饲养层细胞，安全，潜在风险低，通用性强，可以用于多种细胞的培养。本发明的饲养层细胞培养方法简单方便，无需添加其他的特殊因子，耗时短，成本低。本发明提供的细胞培养方法可重复性和成功率高，安全性好，提高细胞的培养效率，用于临床肿瘤药物筛选或肿瘤机制研究等。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中rm细胞的细胞形态图；

图2为实施例2中rm细胞的细胞形态图；

图3为实施例3中不同浓度的丝裂霉素处理rm细胞结果图，其中，从图a至图f中丝裂霉素的使用浓度依次为4μg/ml，8μg/ml，12μg/ml，16μg/ml，18μg/ml和20μg/ml；

图4为本发明试验例中肺癌细胞无饲养层细胞的培养细胞形态图；

图5为本发明试验例中肺癌细胞与饲养层细胞共培养的细胞形态图；

图6为本发明试验例中乳腺癌细胞无饲养层细胞的培养细胞形态图；

图7为本发明试验例中乳腺癌细胞与饲养层细胞共培养的细胞形态图；

图8为本发明试验例中前列腺癌细胞与饲养层细胞共培养的细胞形态图；

图9为本发明试验例中肾癌细胞与饲养层细胞共培养的细胞形态图；

图10为本发明试验例中胃癌细胞与饲养层细胞共培养的细胞形态图；

图11为本发明试验例中肾正常上皮细胞与饲养层细胞共培养的细胞形态图；

图12为本发明试验例中前列腺正常上皮细胞与饲养层细胞共培养的细胞形态图；

图13为本发明试验例中乳腺正常上皮细胞与饲养层细胞共培养的细胞形态图；

图14为本发明试验例中肺正常上皮细胞与饲养层细胞共培养的细胞形态图；

图15为本发明试验例中肾正常上皮细胞与饲养层细胞共培养p0代的细胞形态图；

图16为本发明试验例中肾正常上皮细胞与饲养层细胞共培养p1代的细胞形图；

图17为本发明试验例中肾正常上皮细胞与饲养层细胞共培养p2代的细胞形态图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。

本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。

本发明中，如果没有特别的说明，百分数(％)或者份指的是相对于组合物的重量百分数或重量份。

本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。

本发明中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“6～22”表示本文中已经全部列出了“6～22”之间的全部实数，“6～22”只是这些数值组合的缩略表示。

本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。

本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以不按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

本发明提供rm细胞在细胞培养中的应用。rm细胞(人胚胎绒毛细胞)指的是从合法途径获得的rm组织标本，培养出来的细胞就叫做rm细胞，rm细胞经过有丝分裂阻断剂处理后成为饲养层rm细胞。rm组织样本可以为但不限为医院染色体检测剩余的rm组织样本。需要说明的是，本发明中所指的rm细胞并非来源于具有发展成人的潜在可能性的胚胎，可以为从商业化途径购买的rm细胞、合法怀孕的正常胎停的胚胎或药物流产的胚胎。

rm细胞在细胞培养中为饲养层细胞。以rm细胞作为细胞培养中的饲养层细胞，费用低，操作简单，在很大程度上降低了细胞培养，特别是细胞原代培养在基础研究和临床应用中的成本。rm细胞有别于其他的饲养层细胞，安全，潜在风险低，通用性强，可以用于多种细胞的培养。

在一些实施方式中，细胞培养为细胞原代培养。

在一些实施方式中，细胞包括肿瘤细胞或正常细胞，其中正常细胞包括正常上皮细胞。无论是肿瘤细胞还是正常细胞都能够应用rm细胞实现体外培养和扩增，提高细胞培养效率，通用性强。

一种饲养层细胞，包括上述rm细胞。

在一些实施方式中，rm细胞传代次数为0-5次。由于6代以内的rm细胞才能保持自身较好的生长活性，因此rm细胞的传代次数不宜超过5次。

一种饲养层细胞的制备方法，0-5次传代培养的rm细胞经过有丝分裂阻断剂处理，得到饲养层细胞。本发明的饲养层细胞培养方法简单方便，无需添加其他的特殊因子，耗时短，成本低。

在一些实施方式中，传代培养的培养基为含有5-20％fbs的dmem培养基。

在一些优选地实施方式中，rm细胞来源于合法途径获得的rm组织标本，利用胰蛋白酶将组织块消化后，用含10％fbs的dmem培养基重悬，接种到t25的培养瓶中，置于37℃，5％co2的培养箱中培养。对于p0代细胞，生长速度较缓慢，每隔2天在倒置显微镜下观察是否有细胞爬出，当有细胞爬出时，进行换液处理，换掉漂浮的死细胞和未贴壁的组织残渣。由于p0代细胞生长缓慢，当细胞生长到60％左右即可进行传代，p0代之后的细胞，按照正常的细胞传代要求，当细胞长满90％左右时进行扩增传代。

在一些实施方式中，有丝分裂阻断剂为丝裂霉素。

在一些实施方式中，丝裂霉素的浓度为1-20μg/ml。

本发明提供上述饲养层细胞在细胞培养中的应用。

在一些实施方式中，细胞培养为细胞原代培养，细胞包括肿瘤细胞或正常细胞，其中，正常细胞包括正常上皮细胞。

一种细胞培养方法，将上述饲养层细胞与目标细胞共培养。本发明提供的细胞培养方法可重复性和成功率高，安全性好，提高细胞的培养效率，用于临床肿瘤药物筛选或肿瘤机制研究等。

在一些实施方式中，目标细胞包括肿瘤细胞或正常细胞，其中，正常细胞包括正常上皮细胞。该细胞培养方法适用于多种细胞，通用性强，肿瘤细胞例如但不限于肺癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肾癌细胞或胃癌细胞等等，正常上皮细胞例如但不限于肺上皮细胞、乳腺上皮细胞、前列腺上皮细胞、肾上皮细胞或胃上皮细胞等等，都能够稳定大量扩增。

在一些实施方式中，细胞培养为细胞原代培养。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1rm细胞的培养

本实施例中材料来源为：收集合法的可用作饲养层的rm组织标本。用添加1％双抗(链霉素/青霉素)的pbs浸泡2min，弃掉pbs，用手术小剪刀尽可能的将其剪碎成小的组织块，转移至15ml的离心管中，加适量的胰蛋白酶，37℃消化5-10min，直至观察到组织块明显变小，胰酶悬液变浑浊，加含血清的培养基终止消化。以400g，5min离心得到细胞沉淀，用含10％fbs的dmem培养基重悬，接种到t25的培养瓶中，置于37℃，5％co2的培养箱中培养。细胞的形态如图1所示。

实施例2rm细胞的传代扩增

对于p0代细胞，生长速度较缓慢，每隔2天在倒置显微镜下观察是否有细胞爬出，当有细胞爬出时，进行换液处理，换掉漂浮的死细胞和未贴壁的组织残渣。由于p0代细胞生长缓慢，当细胞生长到60％左右即可进行传代，用0.125％的胰蛋白消化细胞，以1:3的比例进行传代，扩增细胞。p0代之后的细胞，按照正常的细胞传代要求，当细胞长满90％左右时，用0.125％消化细胞，1:3的比例进行扩增传代。rm细胞的细胞形态如图2所示。

实施例3饲养层rm细胞的制备

用来制备饲养层细胞的rm细胞，需在6代以内才能保持自身较好的生长活性，因此当rm细胞扩增至p5代时，不再进行传代扩增。当p5代细胞长至90％时，弃掉培养基，加pbs润洗后用含丝裂霉素终浓度为4ug/ml的dmem培养液37℃处理2h，移液管吸走培养液，加pbs润洗2次，0.125％的胰蛋白酶消化细胞，用400g离心5min，用预冷的10％dmso+90％fbs的冻存液重悬细胞沉淀，置冻存盒中于-80℃冰箱中一个月内保存备用，长期储存需转至液氮罐中。

不同浓度的丝裂霉素处理饲养层rm细胞的结果如图3所示，其中a-f分别为丝裂霉素的使用浓度4μg/ml，8μg/ml，12μg/ml，16μg/ml，18μg/ml，20μg/ml的处理结果。

实施例4目标标本的收集和处理

收取深圳市人民医院癌症患者的新鲜肿瘤组织和癌旁组织，所有样本都签署知情同意书，加入组织保存液，放在冰上取回备用。将组织放在6cm的培养皿中，加入预冷的含双抗(链霉素/青霉素)的pbs，上下反复冲洗组织3-5次，用手术剪刀将组织剪碎成1mm×1mm×1mm的组织块，转移至含有4ml混合消化酶的15ml离心管中，转移至37℃培养箱中消化0.5h-3h，每隔半小时观察组织的消化程度。待观察到组织块明显缩小，消化酶液明显变浑浊，400g，5min，4℃离心收集细胞沉淀，用10mldmem培养基重悬后，用70-um的细胞筛过滤，滤液收集到新的离心管中，400g，5min，4℃离心收集细胞。

实施例5饲养层rm细胞和原代细胞共培养

从液氮罐或者-80℃冰箱中取出已经制备好的饲养层rm细胞，迅速放进37℃水浴锅中快速摇晃，直至冻存液完全融化，将细胞悬液转移到含有4mldmem培养基的15ml离心管中，400g，5min离心收集细胞沉淀，用含有10％fbs的dmem培养基重悬，按照2×10⁴/cm²的密度将细胞悬液接种到24孔板中。饲养层rm细胞会在3-5h后贴壁生长，已经贴壁生长的饲养层rm细胞可以放置在培养箱中备用。将实施例4中处理好的组织细胞用f培养基重悬后接种到贴壁生长的饲养层rm细胞中，放在37℃，5％co2的培养箱中培养，每天观察细胞的生长状态，并在倒置显微镜下拍照记录。

上述的f培养基每100ml包括73.7ml的完全培养基dmem，25ml的f12nutrientmix，0.1ml的hydrocortisone/egfmix(hydrocortisone终浓度25ug/ml，egf0.125ug/ml)，0.1ml的胰岛素，1ml的青霉素/链霉素/两性霉素b混合液，0.1ml的y因子。其中，完全培养基100ml的dmem包括10％的fbs，1％的l-glutamine及1％的青霉素/链霉素/两性霉素b混合液。

试验例

本发明对肺癌细胞进行了有饲养层的细胞共培养，同时以无饲养层但其他条件相同的培养作为对照组，结果分别如图4(无饲养层细胞)和图5(有饲养层细胞)所示，从结果中可以看出，本发明提供的饲养层细胞能够促进肺癌细胞原代培养快速大量增殖。

本发明对乳腺癌细胞进行了有饲养层的细胞共培养，同时以无饲养层的培养作为对照组，结果分别如图6(无饲养层细胞)和图7(有饲养层细胞)所示，从结果中可以看出，本发明提供的饲养层细胞能够促进乳腺癌细胞原代培养快速大量增殖，不会出现团聚的现象。

前列腺癌细胞、肾癌细胞、胃癌细胞分别与本发明的饲养层细胞共培养后的结果如图8-10所示。

肾正常上皮细胞、前列腺正常上皮细胞、乳腺正常上皮细胞、肺正常上皮细胞分别与本发明的饲养层细胞共培养后的结果如图11-14所示。

本发明又将肾正常上皮细胞与饲养层细胞共培养进行了传代培养，p0-p2代的肾正常上皮细胞形态如图15-17所示。

由上述实验结果可知，饲养层rm细胞应用于细胞培养，特别是细胞原代培养中具有良好的效果，作为饲养层细胞通用性强，操作简单，成本低，重复性好并且成功率高，安全性也得到了保障，适合大规模的使用。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。