一种印楝细胞悬浮培养基及细胞悬浮培养方法与流程

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种印楝细胞悬浮培养基及细胞悬浮培养方法。

背景技术：

印楝（学名：azadirachtaindicaa.juss.）是楝科印楝属植物，主要分布在东南亚热带地区，在我国广东、海南、四川和云南均有引种栽培，是一种喜高温、耐干旱、喜阳光充足、耐土壤贫瘠且生长迅速的热带或亚热带乔木树种。印楝是世界上公认的理想杀虫植物，以其独特的杀虫效果和高效的杀虫、拒食、趋避、毒杀和抑制生育能力等活性居于植物源农药资源的首位。印楝的果实、种子、种核、枝条、树叶、树皮及树液中都含有活性物质，但以种子尤甚。迄今，印楝中已发现了100多种化合物，至少有70种化合物具有生物活性，它们为二萜类、三萜类、戊三萜类和非萜类化合物，其中最主要的活性成分是印楝素。大量研究结果表明，印楝素对小菜蛾、菜青虫、蝗虫等10余目400多种农、林、仓储和卫生害虫有杀虫活性，对多种线虫和真菌也具有很好的杀灭作用，同时具有害虫不易产生抗药性、持效时间长、在环境中很容易降解及对高等及温血动物无毒等特点，是当前世界各国研究最多、被世界公认的广谱、高效、低毒、低残留的环境友好新型杀虫剂。

目前，印楝素的来源主要是从印楝植物的种子中提取，但是种子收获具有季节性，且易于变质，随着储存时间的延长，其中的印楝素含量逐渐降低。多种外界因素如光照、降雨、施肥、地理位置等也对种子中印楝素含量有重要影响。此外，印楝适合生长在热带或亚热带，因此在我国的栽培受到限制，无法在全国范围内推广种植，而随着市场需求的不断扩大，从印楝植物中直接提取印楝素已不能满足需要，必须寻求更多更可靠的材料来源。

植物细胞悬浮培养（cellsuspensionculture）是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中，通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮状态的培养方法。一个好的细胞悬浮培养体系具有以下特点：一是悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般由几十个以下的细胞组成，但很少完全由单细胞组成；二是均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒；三是生长迅速，悬浮细胞的生物量一般2-3d甚至更短的时间便可增加一倍。植物细胞悬浮培养作为现代生物技术领域的一个重要分支，以其不受外界环境影响、生长周期短、繁殖规模大、产物均一可控的优点被广泛应用于细胞学、发育生物学、分子生物学以及生产次生代谢产物等。因此，建立优良的植物细胞悬浮培养体系成为重要的基础研究工作之一。

虽然用植物细胞悬浮培养的方式生产次生代谢物与从天然植株中直接提取或化学合成法相比具有不可比拟的优势，但目前为止植物细胞悬浮培养实现商业化应用的例子非常少，其中一个很重要的原因就是培养过程中目标产物的产量太低。而在植物细胞悬浮培养的过程中，培养条件和营养条件是影响细胞生长代谢的重要因素，其中培养条件是指温度、光照、ph、溶氧等环境条件的控制，而营养条件主要指植物细胞的培养基。由于在封闭培养环境中培养基是植物细胞的唯一营养来源，因此培养基的成分对植物细胞的生长水平、代谢产物类别具有极其重要的影响，尤其对于以获得特定代谢产物为目的的细胞培养而言，培养基往往是影响培养效率的关键因素。

目前关于印楝细胞培养研究的报道总体来说不多，印楝细胞悬浮培养技术还不完善，对其次生代谢产物合成的调控效果还不理想。因此要想利用印楝细胞悬浮培养来生产印楝素或其它次生代谢产物，就必需摸索出能够促进印楝细胞生长、提高印楝素含量的培养基以及培养条件。本发明在已有的研究基础上，通过调整基本培养基中各组分的配比，并且添加一些营养元素、有机或无机诱导因子，以期大幅度提高印楝细胞中印楝素的含量，从而为印楝素规模化生产的提供技术支撑。

技术实现要素：

本发明旨在针对现有技术存在的缺陷，提供一种印楝细胞悬浮培养基及细胞悬浮培养方法，以解决现有技术中印楝细胞在悬浮培养条件下生物量积累缓慢，印楝素含量较低的问题。

本发明的整体技术构思是：

一种印楝细胞悬浮培养基，其特征在于：该培养基的配方如下：

kno32100-2400mg/l，（nh4）so4450-550mg/l，mgso4·7h2o220-250mg/l，nah2po4237-255mg/l，cacl2·2h2o528-540mg/l，mnso4·4h2o8-12mg/l，h3bo33.2-3.6mg/l，znso4·7h2o3.5-4.0mg/l，ki0.52-0.56mg/l，cuso4·5h2o0.02-0.03mg/l，cocl2·6h2o0.02-0.03mg/l，na2moo4·2h2o0.21-0.25mg/l，feso4·7h2o22-25mg/l，na2-edta31-34mg/l，肌醇94-104mg/l，甘氨酸3-5mg/l，盐酸硫胺素0.9-1.3mg/l，盐酸吡哆醇0.5-0.7mg/l，钒酸钠1.5-1.7mg/l，l-半胱氨酸33-37mg/l，酪氨酸18-22mg/l，烟酰胺0.5-0.7mg/l，二硫苏糖醇1.4-1.8mg/l，β-d-半乳糖2.5-3.0mg/l，环己六醇磷酸酯9.4-10.0mg/l，胺鲜酯0.28-0.32mg/l，6-ba0.4-0.6mg/l，蜕皮激素2.4-3.0mg/l，硝普钠0.1-0.3mmol/l，二辛基磺基琥珀酸钠0.11-0.15g/l，辣蓼草汁13-18ml/l，地黄连汁13-18ml/l，蔗糖17-21g/l，葡萄糖12-14g/l，ph值为5.4-5.8。

所述辣蓼草汁和地黄连汁的制备方法为：分别取辣蓼草、地黄连的新鲜茎叶，洗净后切成小块置于高速组织捣碎机中，以12000r/min的转速处理1min，将得到的汁液经60目筛网过滤，滤液即为辣蓼草汁和地黄连汁。

该方法的步骤如下：

1）无菌试管苗的获得：首先将印楝种子在流动自来水下冲洗干净，然后经消毒处理后接入固体ms培养基中，在温度28±2℃，光照强度1800-2200lx，每天光照14-16h的条件下培养，4-5d后种子萌发，20d左右获得印楝无菌试管苗；

2）愈伤组织诱导与继代培养：取无菌试管苗的幼嫩叶柄，经消毒处理后切成0.5cm²的小块，接种到诱导培养基上培养20-25d，诱导出愈伤组织；选择浅黄色、松散型的愈伤组织转接到继代培养基上培养，每19-23d继代一次，连续继代3-5次获得生长旺盛、颗粒小、质地疏松的愈伤组织；愈伤组织诱导与继代培养的条件均为温度25±2℃，黑暗；

3）细胞悬浮培养：将继代愈伤组织按照60g/l的接种量转移到装有细胞悬浮培养基的三角瓶中，细胞悬浮培养基的装液量为20%-30%，先置于振荡摇床中高速振荡8-10min，振荡转速为200-220r/min，再置于光照摇床中进行悬浮培养，培养初期每7d继代一次，连续继代3-4次形成稳定的印楝细胞悬浮培养体系，继续培养16-20d后收获悬浮细胞。

所述步骤1）和步骤2）中消毒处理的方法为：先用75%乙醇消毒30s-60s，无菌水冲洗2-3次，再用0.1%hgcl2消毒8-10min，无菌水冲洗3-4次，最后用无菌滤纸吸干表面水分。

所述步骤2）中的诱导培养基为固体培养基，其配方为：ms培养基+2,4-d0.1mg/l+6-ba1.0mg/l+naa0.2mg/l+硝酸铈0.7mg/l+精胺4.5mg/l+二硫苏糖醇1.6mg/l+水解乳蛋白120mg/l+蔗糖30g/l+植物凝胶7g/l，ph值为5.8。

所述步骤2）中的继代培养基为半固体培养基，其配方为：ms培养基+2,4-d1.0mg/l+6-ba0.6mg/l+naa0.1mg/l+精胺4.5mg/l+二硫苏糖醇1.6mg/l+水解乳蛋白250mg/l+植物凝胶3g/l，ph值为5.8。

所述步骤3）中悬浮培养的条件为摇床转速100-120r/min，温度25±2℃，光照时间11-13h/d，光照强度1000-1600lx。

本发明有如下优点：

1）本发明的印楝细胞悬浮培养基，首先在基本培养基的基础上进行了优化，调整了硝态氮与铵态氮的配比，提高了钙离子与磷酸盐的含量，以蔗糖和葡萄糖作为复合碳源，均有利于印楝细胞生物量的积累和细胞中印楝素含量的提高。

2）本发明的印楝细胞悬浮培养基中还添加了多种营养成分如l-半胱氨酸、酪氨酸、烟酰胺，高效植物激素胺鲜酯，能促进细胞生长代谢；添加了抗氧化剂二硫苏糖醇和分散剂二辛基磺基琥珀酸钠，能降低培养过程中的褐化率，提高悬浮培养体系的分散性和稳定性；添加印楝素合成前体物质β-d-半乳糖，信号分子no供体硝普钠，以及其它诱导物质如钒酸钠、环己六醇磷酸酯、蜕皮激素、辣蓼草汁、地黄连汁，多种因素联合应用对印楝细胞次生代谢产物的合成起到协同作用，从而大大提高了印楝素的含量，取得了良好的培养效果。本发明为印楝悬浮细胞的大规模培养以及印楝素的商业化生产提供了技术支撑，因此具有良好的推广前景。

附图说明

图1：细胞悬浮培养基ph值对印楝悬浮细胞生长和印楝素含量的影响；

图2：接种量对印楝悬浮细胞生长和印楝素含量的影响；

图3：摇床转速对印楝悬浮细胞生长和印楝素含量的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种印楝细胞悬浮培养基，该培养基的配方如下：

kno32250mg/l，（nh4）so4500mg/l，mgso4·7h2o235mg/l，nah2po4246mg/l，cacl2·2h2o534mg/l，mnso4·4h2o10mg/l，h3bo33.4mg/l，znso4·7h2o3.8mg/l，ki0.54mg/l，cuso4·5h2o0.025mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，na2moo4·2h2o0.23mg/l，feso4·7h2o23.5mg/l，na2-edta32.5mg/l，肌醇100mg/l，甘氨酸4mg/l，盐酸硫胺素1.1mg/l，盐酸吡哆醇0.6mg/l，钒酸钠1.6mg/l，l-半胱氨酸35mg/l，酪氨酸20mg/l，烟酰胺0.6mg/l，二硫苏糖醇1.6mg/l，β-d-半乳糖2.75mg/l，环己六醇磷酸酯9.7mg/l，胺鲜酯0.3mg/l，6-ba0.5mg/l，蜕皮激素2.6mg/l，硝普钠0.2mmol/l，二辛基磺基琥珀酸钠0.13g/l，辣蓼草汁16ml/l，地黄连汁15ml/l，蔗糖19g/l，葡萄糖13g/l，ph值为5.6；其中辣蓼草汁和地黄连汁是以辣蓼草和地黄连新鲜茎叶为原料，通过压榨、过滤的方法得到的汁液。

一种印楝细胞悬浮培养方法，该方法的步骤如下：

1）无菌试管苗的获得：首先将印楝种子在流动自来水下冲洗干净，然后经消毒处理后接入固体ms培养基中，在温度28℃，光照强度2000lx，每天光照15h的条件下培养，4-5d后种子萌发，20d左右获得印楝无菌试管苗；

2）愈伤组织诱导与继代培养：取无菌试管苗的幼嫩叶柄，经消毒处理（方法与步骤1）中相同）后切成0.5cm²的小块，接种到固体诱导培养基（配方为：ms培养基+2,4-d0.1mg/l+6-ba1.0mg/l+naa0.2mg/l+硝酸铈0.7mg/l+精胺4.5mg/l+二硫苏糖醇1.6mg/l+水解乳蛋白120mg/l+蔗糖30g/l+植物凝胶7g/l，ph值为5.8）上培养23d，诱导出愈伤组织；选择浅黄色、松散型的愈伤组织转接到半固体继代培养基（配方为：ms培养基+2,4-d1.0mg/l+6-ba0.6mg/l+naa0.1mg/l+精胺4.5mg/l+二硫苏糖醇1.6mg/l+水解乳蛋白250mg/l+植物凝胶3g/l，ph值为5.8）上培养，每21d继代一次，连续继代4次获得生长旺盛、颗粒小、质地疏松的愈伤组织；愈伤组织诱导与继代培养的条件均为温度25℃，黑暗；

3）细胞悬浮培养：将继代愈伤组织按照60g/l的接种量转移到装有250ml细胞悬浮培养基的1000ml三角瓶中，此时细胞悬浮培养基的装液量为25%，先置于振荡摇床中高速振荡10min，振荡转速为210r/min，再置于光照摇床中进行悬浮培养，培养的条件为摇床转速110r/min，温度25℃，光照时间12h/d，光照强度1300lx，培养初期每7d继代一次，连续继代4次形成稳定的印楝细胞悬浮培养体系，继续培养至第18d时收集悬浮细胞，测定细胞生物量和印楝素含量。

测定方法：

细胞生物量的测定：将细胞悬浮液置于离心管中，在6000r/min的转速下离心15min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤沉淀2-3次，再弃去上清液，将沉淀置于烘箱中60℃干燥至恒重后称重，即为细胞生物量（g/l）。

印楝素含量的测定：将烘干的细胞研磨成细粉，称取1.0g于10ml甲醇中进行提取，并按体积比3:2的比例向甲醇提取液中添加无菌蒸馏水，然后用与甲醇提取液体积相同的二氯甲烷萃取15min，萃取两次，合并两次萃取液，之后进行40℃真空旋转蒸发；旋转蒸发后的产物用5ml色谱纯甲醇重新溶解，用0.22µm滤膜过滤，运用高效液相色谱法进行印楝素含量测定，根据印楝素标准曲线计算出印楝素的含量（mg/g）。

实施例2培养条件的优化试验

2.1细胞悬浮培养基ph值对印楝悬浮细胞生长和印楝素含量的影响

将细胞悬浮培养基的ph值分别调节为4.8、5.2、5.6、6.0、6.4，按照实施例1中印楝悬浮细胞培养方法进行培养，收集悬浮细胞，测定不同ph值下的细胞生物量和印楝素含量，结果如图1所示。从图1可知，随着培养基ph值的升高，细胞生物量和印楝素含量呈现先增大后减小的趋势，当培养基ph值为5.6时，印楝细胞生物量和印楝素含量均达到最大值，因此5.6为最佳培养基ph值。

2.2接种量对印楝悬浮细胞生长和印楝素含量的影响

分别将愈伤组织按照20、40、50、60、80g/l接种量转移到细胞悬浮培养基中，按照实施例1中印楝悬浮细胞培养方法进行培养，收集悬浮细胞，测定不同接种量下的细胞生物量和印楝素含量，结果如图2所示。从图2可知，当接种量在20-60g/l时，印楝细胞生物量和印楝素含量随接种量的增大而增大，接种量为60g/l时达最大；当接种量升高至80g/l时，印楝细胞生物量和印楝素含量又有所降低，因此60g/l为最佳接种量。当接种量过低时，不能充分利用悬浮培养基中的营养成分，在相同的培养时间内，细胞增量小，要达到最大生物量，会延长培养时间；当接种量过大时，细胞竞争有限的营养成分，对悬浮细胞的生长不利。

2.3摇床转速对印楝悬浮细胞生长和印楝素含量的影响

在置于光照摇床中进行悬浮培养时，分别将摇床转速设置为70、90、110、130、150r/min，按照实施例1中印楝悬浮细胞培养方法进行培养，收集悬浮细胞，测定不同接种量下的细胞生物量和印楝素含量，结果如图3所示。从图3可知，当摇床转速在70-110r/min时，印楝细胞生物量和印楝素含量随转速的升高而增大，摇床转速为110r/min时达最大；当摇床转速高于110r/min时，印楝细胞生物量和印楝素含量又明显降低，因此110r/min为最佳摇床转速。摇床转速不仅影响着培养基的溶氧，还影响着细胞与培养基的接触与吸收利用情况，摇床转速过低，细胞在培养基中不能形成均匀的离散系，导致营养吸收不完全，使得细胞生长缓慢，影响次生代谢产物的积累；摇床转速过高，则存在着细胞与培养基之间剪切力过大，导致细胞产生破碎现象。

对比例1

一种印楝细胞悬浮培养基，该培养基的配方如下：b5培养基+naa3.0mg/l+蔗糖30g/l，该配方来源于文献《印楝细胞悬浮培养系的建立及悬浮培养》；印楝细胞悬浮培养方法与实施例1相同。

对比例2

一种印楝细胞悬浮培养基，该培养基的配方如下：ms培养基+naa3.0mg/l+6-ba1.0mg/l+蔗糖40g/l，该配方来源于文献《影响印楝愈伤组织生长和印楝素累积的因素》；印楝细胞悬浮培养方法与实施例1相同。

对比例3

一种印楝细胞悬浮培养基，该培养基的配方如下：ms培养基+水杨酸92.0mg/l+naa6.0mg/l+壳聚糖54mg/l+iba3.0mg/l+蔗糖40g/l，该配方来源于文献《响应面优化诱导子促进印楝悬浮细胞培养产印楝素的研究》；印楝细胞悬浮培养方法与实施例1相同。

对比例4

一种印楝细胞悬浮培养基，该培养基的配方如下：ms培养基+2,4-d2.0mg/l+6-ba0.5mg/l+蔗糖30g/l+10%椰乳，该配方来源于文献《添加剂和激素对印楝脱分化及印楝素含量的影响》；印楝细胞悬浮培养方法与实施例1相同。

从表1可以看出，实施例1即采用本发明的细胞悬浮培养基对印楝细胞进行悬浮培养，获得的细胞生物量为14.61g/l，印楝素含量为12.27mg/g，与其它4个对比例相比都有所提高，尤其是印楝素含量差异显著，说明本发明的培养基能够有效促进印楝细胞生长代谢，提高其次生代谢产物的合成能力。本发明的细胞悬浮培养基没有直接采用b5或ms等基本培养基，而是在基本培养基的基础上进行了优化，调整了硝态氮与铵态氮的配比，提高了钙离子与磷酸盐的含量，以蔗糖和葡萄糖作为复合碳源，均有利于印楝细胞生物量的积累和细胞中印楝素含量的提高；本发明的细胞悬浮培养基中还添加了营养成分如l-半胱氨酸、酪氨酸、烟酰胺，高效植物激素胺鲜酯，能促进细胞生长，抗氧化剂二硫苏糖醇和分散剂二辛基磺基琥珀酸钠，能提高悬浮培养体系的稳定性，印楝素合成前体物质β-d-半乳糖，信号分子no供体硝普钠，以及其它诱导物质如钒酸钠、环己六醇磷酸酯、蜕皮激素、辣蓼草汁、地黄连汁，多种因素联合应用对印楝细胞次生代谢产物的合成起到协同作用，从而大大提高了印楝素的含量。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。