本发明属于生物发酵技术领域，具体地，涉及一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法。
背景技术：
凝结芽孢杆菌（bacilluscoagulans）为革兰氏阳性菌（g+）。该菌既能产生乳酸，又能产生具有强耐受性的休眠孢子体；因此，同时具有乳酸菌和芽孢杆菌的优势。凝结芽孢杆菌在生长过程中可形成大量的代谢产物，如凝固素（coagulin）、l-乳酸和lactosporin。具有增加肠道益生菌的数量，治疗腹泻增强免疫，改善肠易激综合征，降低胆固醇，抑制致病菌的生长等益生特性；且具有广谱抗菌性，能够替代抗生素有效抑制水产及畜牧养殖中的有害菌的繁殖，改善宿主肠道微生态环境；同时还能够产生一些酶类及营养物质，促进宿主对摄入食物营养的吸收，加快宿主生长发育代谢。
作为一种乳酸芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌已经被广泛应用于食品、药品、保健及畜牧水产行业，相应产品层出不穷，需求量不断增加。因为芽孢具有抗逆性强、耐高温、耐酸碱、冷储萌发存活率高等优点，市面上关于凝结芽孢杆菌的产品形式正在从营养体细胞的形式向芽孢形式转移。尽管近年来国内外关于凝结芽孢杆菌高密度培养及促芽孢化培养的研究很多，都是从凝结芽孢杆菌培养基及培养方式进行优化，但是既能兼顾高密度培养又能提高芽孢成率的研究鲜有报道。目前关于芽孢杆菌工业化生产中普遍存在芽孢形成率及产品质量不稳定、培养基成分复杂等问题，一般采用改变发酵过程中的温度、溶氧、搅拌转速来提高芽孢产率，缩短发酵时间，但以上方法在实际操作中操作繁琐、耗能大，增加了生产成本。
技术实现要素：
为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法。所述方法是指在凝结芽孢杆菌杆菌培养发酵过程中，于一定时间依次间隔补加葡萄糖和碳酸钙，碳源的补充能够促进活菌数的增加，提高菌体密度，加快芽孢的形成，而碳酸钙的添加能够有效地缩短芽孢形成时间，提高芽孢数量的同时增加了芽孢的耐受性。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，在凝结芽孢杆菌发酵培养的对数生长初期向培养基中依次间隔流加碳源和碳酸钙。
作为对上述方案的进一步优化，所述碳源为葡萄糖。
作为对上述方案的更进一步优化，所述方法具体包括以下步骤：
步骤一：将凝结芽孢杆菌原始菌种按照体积比为1:15~25的接种量接种于一级培养基中进行活化培养，培养条件为：摇床转速200～220rpm、温度35～38℃、时间20～22h，培养结束得一级菌种；所述一级培养基按质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖1.6～1.8%、蛋白胨1.0～1.4%、酵母粉0.6～1.0%、硫酸镁0.4～0.6%，余量为水；ph7.8～8.2；
步骤二、将步骤一所得一级菌种按照体积比为1:30的接种量接种于二级培养基中进行发酵培养，培养条件为：摇床转速200～240rpm、温度35～38℃，时间为40-50h；当培养至第8～10h时一次性补入葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液的补入量为二级培养基总体积的1.2～1.6%，所述葡萄糖溶液的浓度为1.0g/ml；继续培养发酵至第14～18h时一次性补入终浓度为40～80g/l的碳酸钙固体；
所述二级培养基按质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖1.2～1.6%、蛋白胨1.2～1.6%、酵母粉0.8～1.2%、硫酸镁0.4～0.6%，余量为水；ph7.8～8.2。
作为对上述方案的更进一步优化，将经步骤一活化的一级菌种接种于二级培养基中经至少一次扩大培养后再进行步骤二所述发酵培养；所述扩大培养的培养条件为：接种量体积比为1:30、摇床转速200～240rpm、温度35～38℃、时间16～20h。
有益效果：
1、本发明通过在基础培养基的基础上流加葡萄糖与碳酸钙，为提高凝结芽孢杆菌在工业生产中芽孢的产率、缩短产品周期、提高芽孢抗性以及延长芽孢产品货架期提供了必要的条件，添加葡萄糖后，活菌数明显增加了约10倍；添加碳酸钙后，芽孢成熟时间明显缩短，而芽孢产量稳定在108cfu/ml，显著提高了凝结芽孢杆菌的芽孢生产率。
2、本发明通过两步法促进芽孢形成，首先，碳源的补充能够促进活菌数的增加，提高菌体密度，加快芽孢的形成，在凝结芽孢杆菌生长初期，本申请中采用分批补料流加葡萄糖的方法将活菌数提高到1.0×109cfu/ml。碳酸钙的添加能够有效的缩短芽孢形成时间，提高芽孢数量的同时增加了芽孢的耐受性。工业生产中芽孢形成时间的缩短能够有效的降低生产中的能耗及生产成本，且本申请中的培养基成分简单易得，显著降低了生产成本。
3、本申请通过研究对比发现，凝结芽孢杆菌在培养第16小时时不添加碳酸钙的情况下，不形成芽孢；而在培养第16小时时，添加碳酸钙后，在培养第18小时就能观测到芽孢。本发明碳酸钙的添加量为40～80g/l，碳酸钙的添加能够快速中和凝结芽孢杆菌发酵过程中形成的乳酸，使菌体迅速进入适宜芽孢形成的环境，缩短芽孢形成时间；且碳酸钙是一种廉价易得的生产原料，在工业生产中相比其他固体原料更容易与产品分离。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，具体步骤如下:
1）将凝结芽孢杆菌原始菌种接到一级培养基中进行活化，接种量体积比为1:15，装液量为30ml/250ml，培养条件为摇床转速为200rpm，培养温度为36℃，培养时间为22小时，培养结束得一级菌种。所述一级培养基按照质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖1.8%、蛋白胨1.2%、酵母粉0.6%、硫酸镁0.3%，余量为水；ph7.8。
2）将步骤1）中活化后的凝结芽孢杆菌一级菌种接种于二级液体培养基中进行扩大培养，接种量体积比为1:30ml，装液量为30ml/250ml；培养条件为摇床转速为230rpm/min，培养温度为37℃，培养时间为16小时，培养结束得二级菌种。
3）将经步骤2）处理的凝结芽孢杆菌二级菌种再接种于二级培养基中进行发酵培养，接种量体积比为1:30ml，装液量为30ml/250ml；培养条件为摇床转速为230rpm/min，培养温度为37℃；当培养至第8小时向培养基中添加无菌葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液的添加量为培养基体积的1.5%，葡萄糖溶液的浓度为1.0g/ml；继续培养至第16小时添加无菌碳酸钙固体，使得培养基中碳酸钙的终浓度为60g/l；培养周期为40～45小时，培养结束后收集培养液得到高芽孢率的凝结芽孢杆菌液体产品，采用稀释涂布平板法检测得到活菌数4.5×109cfu/ml，80℃水浴加热10min灭活营养体细胞，稀释涂布得到芽孢数为3.2×108cfu/ml。
所述二级培养基按质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖1.2～1.6%、蛋白胨1.2～1.6%、酵母粉0.8～1.2%、硫酸镁0.4～0.6%，余量为水；ph7.8～8.2。
所述一级培养基和二级培养基在使用前需要灭菌处理，灭菌条件为：115～121℃，灭菌20～30min。
实施例2
一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，具体步骤:
1）将凝结芽孢杆菌原始菌种接到一级培养基中进行活化，接种量体积比为1:25，装液量为50ml/250ml，培养条件为摇床转速为210rpm/min，培养温度为37℃，培养时间为20小时，培养结束得一级菌种。所述一级培养基按照质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖1.6%、蛋白胨1.4%、酵母粉1.0%、硫酸镁0.4%，余量为水，ph8.0。
2）将经步骤1）活化后的凝结芽孢杆菌一级菌种接种于二级培养基中，接种量体积比为1:25ml，装液量为50ml/250ml；培养条件为摇床转速为220rpm/min，培养温度为36.5℃，培养时间为18小时，培养结束得二级菌种。
3）将经步骤2）处理的凝结芽孢杆菌二级菌种再接种于二级培养基中进行发酵培养，接种量体积比为1:50ml，装液量为50ml/250ml；培养条件为摇床转速为240rpm/min，培养温度为38℃；当培养至第8小时向培养基中添加无菌葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液的添加量为培养基体积的1.4%，葡萄糖溶液的浓度为1.0g/ml；继续培养至第16小时添加无菌碳酸钙固体，使得培养基中碳酸钙的终浓度为60g/l；继续培养至芽孢率最大，培养结束后收集培养液得到高芽孢率的凝结芽孢杆菌液体产品，采用稀释涂布平板法检测得到活菌数8.0×109cfu/ml，80℃水浴加热10min灭活营养体细胞，稀释涂布得到芽孢率为5.38×108cfu/ml。
所述二级培养基按质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖1.2～1.6%、蛋白胨1.2～1.6%、酵母粉0.8～1.2%、硫酸镁0.4～0.6%，余量为水；ph7.8～8.2。
所述一级培养基和二级培养基在使用前需要灭菌处理，灭菌条件为：115～121℃，灭菌20～30min。
实施例3
一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，具体步骤如下:
1）将原始菌种接到一级培养基中进行活化，接种量体积比为1:25，装液量为50ml/250ml，培养条件为摇床转速为210rpm/min，培养温度为37.5℃，培养时间为18小时，培养结束得一级菌种。所述一级培养基按照质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖1.7%、蛋白胨1.3%、酵母粉0.9%、硫酸镁0.5%，余量为水，ph8.2。
2）将经步骤1）活化的凝结芽孢杆菌一级菌种接种于二级培养基中，接种量体积比为1:30ml，装液量为30ml/250ml；培养条件为摇床转速为230rpm/min，培养温度为36.5℃，培养时间为16小时，培养结束得二级菌种。
3）将经步骤2）处理的凝结芽孢杆菌二级菌种再接种于二级培养基中，接种量体积比为1:30ml，装液量为30ml/250ml；培养条件为摇床转速为200rpm/min，培养温度为38℃；当培养至第8小时添加1.5%葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液的添加量为培养基体积的1.5%，葡萄糖溶液的浓度为1.0g/ml；继续培养至第16小时添加碳酸钙固体，使得培养基中碳酸钙的终浓度为50g/l；继续培养至芽孢率最大，培养结束后收集培养液得到高芽孢率的凝结芽孢杆菌液体产品，采用稀释涂布平板法检测得到活菌数7.10×109cfu/ml，80℃水浴加热10min灭活营养体细胞，稀释涂布得到芽孢率2.79×108cfu/ml。
所述二级培养基按质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖1.2～1.6%、蛋白胨1.2～1.6%、酵母粉0.8～1.2%、硫酸镁0.4～0.6%，余量为水；ph7.8～8.2。
所述一级培养基和二级培养基在使用前需要灭菌处理，灭菌条件为：115～121℃，灭菌20～30min。
实施例4
一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，具体步骤如下:
1）将原始菌种接到一级培养基中进行活化，接种量体积比为1:15，装液量为30ml/250ml，培养条件为摇床转速为220rpm，培养温度为36.5℃，培养时间为18小时，培养结束得一级菌种。所述一级培养基按照质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖1.6%、蛋白胨1.4%、酵母粉1.0%、硫酸镁0.4%，余量为水。
2）将步骤1）中活化后的凝结芽孢杆菌一级菌种接种于二级培养基中进行扩大培养，接种量体积比为1:30ml，装液量为30ml/250ml；培养条件为摇床转速为230rpm/min，培养温度为37℃；当培养至第8小时向培养基中添加葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液的添加量为培养基体积的1.5%，葡萄糖溶液的浓度为1.0g/ml；继续培养至第16小时添加碳酸钙固体，使得培养基中碳酸钙的终浓度为40g/l；培养50h，培养结束后收集培养液得到高芽孢率的凝结芽孢杆菌液体产品，采用稀释涂布平板法检测得到活菌数5.39×109cfu/ml，80℃水浴加热10min灭活营养体细胞，稀释涂布得到芽孢数为3.04×108cfu/ml。
所述二级培养基按照质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖1.5%、蛋白胨1.5%、酵母粉1.0%、硫酸镁0.5%，余量为水。
对照例5
作为对照，对照例5中对凝结芽孢杆菌的处理方法与实施例4基本相同，不同之处仅在于：对照例5在发酵培养至第16小时时未向培养基中添加碳酸钙固体，培养结束后收集培养液得到凝结芽孢杆菌液体产品，采用稀释涂布平板法检测得到活菌数6.12×109cfu/ml，80℃水浴加热10min灭活营养体细胞然后进行检测，未能检测到芽孢。
为进一步说明采用本发明方法所得芽孢的特性，通过以下几种试验对芽孢耐受性进行检测。
取通过实施例1所述方法所得芽孢为试验组；因为现有技术中有时在发酵培养基中加入碳酸钙以促进细胞增殖，因此，取芽孢形成培养基形成的芽孢抗性作为对照组，对碳酸钙流加刺激下形成芽孢（caco3）的抗性与芽孢形成培养基形成的芽孢（control）抗性的比较，检测方案如下：
一、温度对凝结芽孢杆菌cgmcc9951芽孢的影响，结果如下表1所示。
表1：温度对凝结芽孢杆菌cgmcc9951芽孢的影响
二、胆盐对凝结芽孢杆菌cgmcc9951芽孢的影响，结果如下表2所示。
表2：胆盐对凝结芽孢杆菌cgmcc9951芽孢的影响
三、ph对凝结芽孢杆菌cgmcc9951芽孢的影响，结果如下表3所示。
表3：ph对凝结芽孢杆菌cgmcc9951芽孢的影响
通过表1发现，碳酸钙刺激形成的芽孢抗热性虽稍差于芽孢培养基形成的芽孢，由于饲料制粒中调质与制粒过程时间很短，一般不超过3min，同时制粒温度一般不超过100℃作为温度上限，因此应用碳酸钙产生的芽孢在饲料制粒过程中对其存活率影响不大。试验结果如表2所示，碳酸钙刺激形成芽孢在0.3%的胆盐浓度下2h存活率高达99.79%；在0.7%的胆盐浓度下处理2h存活率仍可达87.22%，均高于芽孢培养基形成的芽孢，由于细菌在肠道的存活和增殖必须能够耐受0.3%的胆盐环境，因此碳酸钙刺激产生的芽孢进入肠道后能够顺利存活并繁殖。一般动物的胃酸为ph2.0-3.0，食物在胃中的停留时间为1-2h，因此，本专利设置ph为1.5、2.0、3.0、4.0，处理时间为1h，2h。表3显示，碳酸钙刺激形成芽孢在ph1.5处理1h的存活率仅为7.14，略高于芽孢培养基形成芽孢；然而本专利发现，在ph≥3时，芽孢存活率均大于100%，说明芽孢在经过胃液ph≥3处理后到达肠道能够快速高效萌发且发挥益生作用。综上所述，碳酸钙刺激形成芽孢的耐酸、耐胆盐性能能较好的发挥该菌的益生特性。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。