本发明属于植物细胞工程领域，具体涉及一种圆叶丝粉藻原生质体的制备方法。
背景技术：
：海草是一种生活在热带和温带海域浅海中的单子叶大型沉水植物，属于沼生目。它们具有高等植物的一般特征，能够在水中完成生活史。海草的初级生产力很高，是浅海水域生态系统——海草场的重要组成。海草场资源独特，其生态经济价值主要表现在：(1)海草可以加快海水中的悬浮物的沉降、吸收海水中的营养盐和重金属等，进而改善水质；(2)海草通过减缓水流，进而增加水中悬浮物的沉降，达到稳定底质的效果；(3)海草场为众多海洋生物供庇护场所、栖息地、育幼以及觅食场所；(4)海草场能够维持全球碳、氮、磷平衡；(5)海草是提炼碘、铁、钙、氯化钾等物质的廉价原料。我国的海草分布可分为北方海域海草分布区和南方海域海草分布区。北方海域分布区包括辽宁、河北、天津和山东等省市沿海，约含有3属9种3属9种；南方海域分布区包括海南省、广西壮族自治区、广东省、香港特别行政区、台湾省和福建省沿海，约含有9属15种。海南是中国海草场分布面积最大的省份，占我国海草总面积的64％，且主要集中于东部沿岸，如文昌、琼海、陵水、三亚。其中，陵水黎安港以圆叶丝粉藻作为优势种。近年来，受自然因素和人类活动干扰的影响，我国海草场迅速缩减，许多优质海草资源受到严重破坏、繁殖率降低。原生质体是植物细胞中除细胞壁以外的被细胞膜包围的“裸露细胞”，能够长成一个完整的植株个体，具有胚性。可应用于构建细胞融合、克服有性杂交障碍、培育植物新品种。另外，原生质体为植物学研究、作物遗传改良和种质资源保存提供了极为有利的试验材料。目前，已有通过酶解法从海草中分离出原生质体的报道。比如，崔翠菊等人使用浓度为20g/l的纤维素酶和浓度为5g/l果胶酶分离得到大叶藻原生质体(大叶藻原生质体的分离和培养.水产科学,2014,33(8),508-511.)；baleststrie等人使用1w/v％纤维素酶、0.5w/v％半纤维素酶和1w/v％果胶酶分离得到大洋聚伞藻和海神草(isolationandcellwallregenerationofprotoplastsfromposidoniaoceanicaandcymodoceanodosa.aquaticbotany,2001(70),237–242.)。但是，目前公开的资料中未见有针对圆叶丝粉藻原生质体制备方面的研究。此外，由于不同海草细胞壁中成分、含量的差异以及诸多因素影响植物原生质体的制备和活力，利用现有方法制备得到的圆叶丝粉藻原生质体产量不理想、存活率较低。因此，需要探索一种高效降解圆叶丝粉藻细胞壁、制备原生质体的方法。技术实现要素：针对现有技术中暂无有关圆叶丝粉藻原生质体制备方法的问题，本发明提供了一种圆叶丝粉藻原生质体的制备方法。本发明提供的圆叶丝粉藻原生质体的制备方法，包括以下步骤：s1：选取圆叶丝粉藻幼叶，用无菌海水清洗后暂养，得到原材料1；s2：将s1中得到的原材料1放入预处理液中浸泡，得到原材料2；s3：取出s2中得到的原材料2，吸干水分后切成块，加入酶液进行酶解，得到酶解组织；s4：将s3中得到的酶解组织过滤，得到过滤液；s5：将s4中得到的过滤液离心，弃上清液，用w5溶液悬浮沉淀，离心，弃上清液，得到沉淀；s6：将s5中得到的沉淀用mmg溶液悬浮，得到圆叶丝粉藻原生质体。优选地，所述的步骤s1中暂养的条件为：温度20-25℃、光照强度800-1200lx、光照时间8-12小时/天，暂养的时间为1-3天，培养基包括24.3mg/lnano3、3.75mg/lkh2po4；进一步优选地，所述的步骤s1中暂养的条件为：温度22℃、光照强度1000lx、光照时间10小时/天，暂养的时间为2天。优选地，所述的步骤s2中的预处理液包括：0.05-0.2g/l磷脂酶和80-120mmol/ledta，所述的浸泡时间为1-4小时；进一步优选地，所述的步骤s2中的预处理液包括：0.1g/l磷脂酶和100mmol/ledta，所述的浸泡的时间为2小时。优选地，所述的步骤s3中的酶液包括：1.0-2.0wt％纤维素酶r-10、0.3-0.8wt％果胶酶r-10、0.2-0.6mol/l甘露醇、10-30mmol/lkcl、10-30mmol/lmes、5-15mmol/lcacl2·2h2o和0.05-0.2wt％bsa，ph值为5.0-6.0。优选地，所述的步骤s3中的酶解条件为23-27℃、100-140rmp摇床进行黑暗酶解6-12小时；进一步优选地，所述的步骤s3中的酶解条件为25℃、120rmp恒温摇床进行黑暗酶解9小时。优选地，所述的步骤s5中的w5溶液包括：9g/lnacl、18.4g/lcacl2·2h2o、0.37g/lkcl和0.3g/lmes；所述的步骤s5中的离心速度为70×g，离心时间为5min。优选地，所述的步骤s6中的mmg溶液包括：1.42g/lmgcl2、1.0g/lmes和73g/l甘露醇。以上技术方案均能够实现本发明所述的技术效果，但在一些优选的实施方案中，所达到的技术效果优于其他方案。例如：当步骤s3的酶液中纤维素酶r-10和果胶酶r-10比例为3:1，其中一个优选的酶液包括：1.2wt％纤维素酶r-10、0.4wt％果胶酶r-10、0.3mol/l甘露醇、15mmol/lkcl、15mmol/lmes、8mmol/lcacl2·2h2o和0.15wt％bsa，ph值为5.5。最优选地，所述的步骤s3中的酶液包括：1.5wt％纤维素酶r-10、0.5wt％果胶酶r-10、0.4mol/l甘露醇、20mmol/lkcl、20mmol/lmes、10mmol/lcacl2·2h2o和0.1wt％bsa，ph值为5.5。本发明还提供了上述制备方法制备的圆叶丝粉藻原生质体在细胞融合中应用。本发明的有益效果在于：(1)本发明使用预处理液提前处理圆叶丝粉藻幼叶，针对圆叶丝粉藻复杂的细胞壁结构，采用磷脂酶和edta组成的预处理液，提高了原生质体制备率，使用本方法制备得到的圆叶丝粉藻原生质体产量可达1.12×106个/g、存活率可达63.54％。(2)本发明使用纤维素酶和果胶酶对圆叶丝粉藻进行酶解，并添加了甘露醇、kcl、mes、cacl2·2h2o和bsa形成稳定的渗透压，维持原生质体活性。(3)本发明首次建立了圆叶丝粉藻原生质体制备方法，该方法简单、有效，制备得到的原生质体得率较高、完整性好，为利用原生质体进行蛋白亚细胞定位、蛋白相互作用、基因表达调控及亚细胞器制备等研究奠定了基础。具体实施方式为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。本说明书中所述实施例1-4及对比例1-4采用的实验材料、试剂和方法如下：1.实验材料圆叶丝粉藻幼叶。圆叶丝粉藻(cymodocearotundata)采自海南陵水黎安港，保存于中国海洋大学大型海藻种质资源库。2.主要试剂的配制(1)暂养培养基：用无菌海水配制，各组分浓度24.3mg/lnano3、3.75mg/lkh2po4，0.22μm微孔过滤膜除菌后使用。(2)预处理液：于无菌海水中分别加入磷脂酶和edta，0.22μm微孔过滤膜除菌后使用。(3)酶液：于无菌海水中分别加入纤维素酶r-10、果胶酶r-10、甘露醇、kcl和mes，溶解后于50℃水浴活化10min，再加入cacl2·2h2o和bas，调节ph，0.22μm微孔过滤膜除菌后使用。(4)w5溶液：于无菌海水中分别加入nacl、cacl2·2h2o、kcl和mes，搅拌均匀，充分溶解后用0.22μm微孔过滤膜除菌。(5)mmg溶液：于无菌海水中分别加入mgcl2、mes和甘露醇，搅拌均匀，充分溶解后用0.22μm微孔过滤膜除菌。3.实验方法3.1原生质体的制备以2g圆叶丝粉藻幼叶为例，具体步骤如下：s1：选取圆叶丝粉藻幼叶，用无菌海水清洗后暂养，得到原材料1；s2：将s1中得到的原材料1放入预处理液中浸泡，得到原材料2；s3：取出s2中得到的原材料2，吸干水分后，将原材料2切成0.2cm2的小块，加入10ml酶液进行酶解，得到酶解组织；s4：将s3中得到的酶解组织用200目筛绢进行过滤，得到过滤液；s5：将s4中得到的过滤液于70×g离心5min，弃上清液，用w5溶液悬浮沉淀，离心，弃上清液，得到沉淀；s6：将s5中得到的沉淀用2mlmmg溶液悬浮，得到圆叶丝粉藻原生质体。3.2原生质体的检测用0.1％vbl型荧光增白剂对所得原生质体进行染色5min，于荧光显微镜下观察，激发光波长为370nm紫外光。有细胞壁的细胞由于纤维素的存在会呈现蓝绿色荧光；原生质体由于叶绿体的存在会呈现红色荧光且外围无蓝绿色荧光。3.3原生质体的产量测定将收集得到的原生质体用mmg溶液稀释，滴加在血球计数板上，在光学显微镜下观察计数，每个样品重复计数3次，最后计算原生质体的产量。使用的血球计数板为25x16规格，每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。具体步骤如下：(1)首先在显微镜下检查计数板上的计数室是否干净，若沾有污物，须用酒精棉轻轻擦洗，用蒸馏水冲净，再用吸水纸吸干；(2)将盖玻片盖在计数室上面；(3)取10μl原生质体悬浮液滴在盖玻片一侧边缘，使它沿着盖玻片和计数板间的缝隙渗入计数室，直到充满计数室为止；(4)计数时要使显微镜载物台保持水平，不能倾斜。分别统计计数室内4个角中格及中央中格(共五个中格)的原生质体数量，然后根据以下公式求出原生质体数含量及产量。原生质含量(个/ml)＝5个中格内原生质体总数×5×10000×稀释倍数原生质体产量(个/g)＝原生质含量(个/ml)×稀释后体积(ml)/材料鲜重(g)(5)计数完毕后，将计数板洗净吸干。3.4原生质体的活力测定取10μl原生质体悬浮液，加入1μl0.5％evansblue染色，摇匀放置1min，静置后在荧光显微镜下观察，活的原生质体呈绿色，死细胞呈深蓝色。原生质体的活力＝(未被染色的原生质体数/原生质体总数)*100％4.实施例及对比例表1各步骤中关键点的实施例对比例1与实施例1相比，仅缺少预处理步骤。对比例2与实施例1相比，预处理液中仅缺少磷脂酶。对比例3与实施例1相比，预处理液中仅缺少edta。对比例4与实施例3相比，仅缺少预处理步骤。对比例5使用期刊文章《大叶藻原生质体的分离和培养》(水产科学,2014,33(8),508-511.)所述大叶藻原生质体的制备方法获得圆叶丝粉藻原生质体。5.实验结果圆叶丝粉藻原生质体产量(个/g)圆叶丝粉藻原生质体的活力实施例10.86±0.04×10655.42±2.41％对比例10.49±0.13×10636.17±1.37％对比例20.64±0.06×10642.72±2.02％对比例30.70±0.05×10643.59±0.96％实施例20.90±0.03×10656.34±1.42％实施例31.12±0.04×10663.54±1.21％对比例40.54±0.08×10638.51±1.01％实施例40.95±0.05×10659.17±1.89％对比例50.28±0.08×10632.98±3.31％综上所述，本制备方法提供的含有磷脂酶和edta的预处理液，提高了原生质体制备率，使用本方法制备得到的原生质体产量可达1.12×106个/g、存活率可达63.54％。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12