一种人体口腔黏膜模型及其制备方法与流程

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种人体口腔黏膜模型及其制备方法。

背景技术：

2009年3月，欧盟化妆品法规(ec)1223/2009正式实施，已禁止化妆品、化学品等的动物实验。而传统的2d模型只能用于研究细胞迁移和增殖，无法用于口腔黏膜的功能、药物经皮吸收及病理学研究。与3d模型相比，2d模型的细胞行为表现有显著差异，在2d培养模型下筛选出的有效原料或产品用于临床疗效不理想。但是人体来源的口腔黏膜组织主要存在取材困难、来源有限，不能满足口腔相关产品体外评价数量需求。

欧洲、美国、日本等世界发达地区或国家已成立动物实验替代机构旨在积极推动替代方法进行更为系统而深入的研究，目前已顺利完成相关技术储备，并通过立法程序建立起相应的技术性贸易措施体系。

我国现也已有和国际接轨的相关法律法规，以体外替代试验方法取代传统的动物试验。gb/t16886-1《医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验》提到：只要科学上证明能获得与动物试验同样的信息，建议优先采用体外模式。

在此背景下，以正常的人体口腔黏膜生理结构和功能为基础,利用组织工程原理和技术构建的3d口腔黏膜模型成为未来首选的生物学评价工具。

正常的人体口腔黏膜生理结构包括固有层和上皮层，其中，上皮层为复层鳞状上皮，主要由角质细胞构成，此外还有少数非角质细胞。固有层由致密的结缔组织组成。固有层的基本细胞成分是成纤维细胞，有合成和更新纤维及基质的功能。固有层的纤维主要是ⅰ型胶原纤维。

现有技术的组织工程口腔黏膜模型只构建了口腔黏膜上皮层，并且以口腔黏膜鳞状癌细胞为种子细胞。因此现有技术模型构建而成的结构不能很好的反映人天然口腔黏膜结构。例如，专利cn105255833a公开了一种口腔黏膜上皮模型及其体外构建方法，使用口腔黏膜鳞状癌细胞经体外扩增后，采用气液面培养法，使其复层化，形成体外口腔黏膜上皮模型。

技术实现要素：

本发明的目的是，提供一种人体口腔黏膜模型及其制备方法，构建与人体口腔黏膜上皮组织的结构及功能高度相似的体外口腔黏膜上皮模型。

为了达到上述技术目的，本发明提供了如下的技术方案：

本发明提供一种人体口腔黏膜模型，包括自下而上排列的基底层、固有层和上皮层，所述固有层包括口腔成纤维细胞和生物支架材料，所述上皮层包括口腔上皮细胞。

优选地，所述基底层包括支撑膜，所述支撑膜所使用的材料可以是尼龙膜、硅胶膜、橡胶膜或合成高分子材料膜。在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中所用的支撑膜为合成高分子材料膜，pe膜或pet膜。

优选地，所述口腔成纤维细胞的来源不受本发明的限制，可以为可向成纤维细胞分化的干细胞，也可以为口腔组织分离培养的原代细胞，也可为商业化的永生口腔成纤维细胞。

优选地，所述生物支架材料的来源不受本发明的限制，可以为胶原蛋白、细胞外基质复合物、透明质酸、多糖、硫酸软骨素、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物中的一种或两者以上混合物。

优选地，所述口腔上皮细胞包括口腔角质细胞，其来源不受本发明的限制，可以为可向角质细胞分化的干细胞，也可以为口腔组织分离培养的原代细胞，也可为商业化的永生口腔角质细胞。

优选地，所述成纤维细胞复合于生物支架材料内部，使生物支架材料模拟细胞外基质的作用，在细胞之间形成适宜的空间分布和细胞联系，从而更加接近人体的口腔黏膜固有层。

与现有技术相比，本发明提供的人体口腔黏膜模型包括基底层以及固有层之外，还包括上皮层，从而高度接近人体口腔黏膜的上皮组织的结构。由于将成纤维细胞复合于生物支架材料内部，使生物支架材料模拟细胞外基质的作用，在细胞之间形成适宜的空间分布和细胞联系，并且使上皮细胞在固有层表面接种，通过气液面培养法使上皮细胞复层化，使该模型接近人体口腔黏膜的上皮组织的结构和功能。因此，该模型可以应用于口腔护理产品、小分子化合物、活性蛋白、医疗器械、化学品、一次性卫生用品等产品的安全性与功效性检测及其他与口腔黏膜接触的材料的安全性与功效性评价，并且使得到的检测数据与评价结果更接近口腔黏膜的测评结果。在体外条件下该模型的功能和活性维持时间，能够满足相关口腔黏膜生物学检测的需求。

本发明还提供了一种人体口腔黏膜模型的制备方法，其包括如下步骤:

(1)口腔上皮细胞和成纤维细胞的培养；

(2)基底层的配置：取dmem培养基、牛血清、生物支架材料混合，调节ph值至ph7.0-ph7.6后，置于支撑膜上，固化；

(3)固有层的配置：取dmem培养基、牛血清、生物支架材料混合，调节ph值至ph7.0-ph7.4后，加入成纤维细胞，置于所述基底层之上，固化之后，加入成纤维培养基，培养4-7天；

(4)上皮层的配置：取上皮细胞平铺于所述固有层，孵育0.5h-3h，加入上皮培养基，培养1-3天；

(5)全层口腔黏膜的形成和成熟：将上皮培养基舍弃，进行气液界面培养5-14天。

本发明的制备方法，上皮层的配置中上皮细胞的添加量为5×10⁵-5×10⁷个/ml。

本发明提供的制备方法中，固有层的配置中成纤维细胞的添加量为1×10⁵-1×10⁷个/ml。

本发明提供的制备方法中，上皮层和固有层的配置中上皮和成纤维细胞培养基包括以下含量的各个组分：

本发明提供的制备方法中，全层口腔黏膜的成熟中，所述气液界面培养的培养基包括以下含量的各个组分：

附图说明

图1是实施例2的人体口腔黏膜模型在20倍镜下显微镜图；

图2是实施例2的人体口腔黏膜模型200倍镜下显微镜图；

图3是实施例2的人体口腔黏膜模型400倍镜下显微镜图；

图4是实施例2的人体口腔黏膜模型与对照组分别进行紫外光谱测试的柱形图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

一种人体口腔黏膜模型，包括自下而上排列的基底层、固有层和上皮层，所述固有层包括口腔成纤维细胞和生物支架材料，所述上皮层包括口腔上皮细胞。

所述基底层包括支撑膜，所述支撑膜所使用的材料可以是尼龙膜、硅胶膜、橡胶膜或合成高分子材料膜。例如，所用的支撑膜为合成高分子材料膜，pe膜或pet膜。

所述口腔成纤维细胞的来源不受本发明的限制，可以为可向成纤维细胞分化的干细胞，也可以为口腔组织分离培养的原代细胞，也可为商业化的永生口腔成纤维细胞。

所述生物支架材料的来源不受本发明的限制，可以为胶原蛋白、细胞外基质复合物、透明质酸、多糖、硫酸软骨素、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物中的一种或两者以上混合物。

所述口腔上皮细胞包括口腔角质细胞，其来源不受本发明的限制，可以为可向角质细胞分化的干细胞，也可以为口腔组织分离培养的原代细胞，也可为商业化的永生口腔角质细胞。

所述成纤维细胞复合于生物支架材料内部，使生物支架材料模拟细胞外基质的作用，在细胞之间形成适宜的空间分布和细胞联系，从而更加接近人体的口腔黏膜固有层。

本实施例1提供的人体口腔黏膜模型包括基底层以及固有层之外，还包括上皮层，从而高度接近人体口腔黏膜的上皮组织的结构。由于将成纤维细胞复合于生物支架材料内部，使生物支架材料模拟细胞外基质的作用，在细胞之间形成适宜的空间分布和细胞联系，并且使上皮细胞在固有层表面接种，通过气液面培养法使上皮细胞复层化，使该模型接近人体口腔黏膜的上皮组织的结构和功能。因此，该模型可以应用于口腔护理产品、小分子化合物、活性蛋白、医疗器械、化学品、一次性卫生用品等产品的安全性与功效性检测及其他与口腔黏膜接触的材料的安全性与功效性评价，并且使得到的检测数据与评价结果更接近口腔黏膜的测评结果。在体外条件下该模型的功能和活性维持时间，能够满足相关口腔黏膜生物学检测的需求。

实施例2

一种人体口腔黏膜模型的制备方法，其制备过程包括：

步骤一、口腔角质细胞的扩增培养：

取口腔角质细胞，复苏扩增后，使用p5代细胞，以胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度5.0×10⁵个/ml，接种于培养皿中，加培养液ⅰ培养，轻轻晃动培养瓶，使细胞分散均匀后，置于37℃、5％co2条件下培养；

所述培养液ⅰ包括如下组分：

步骤二、牙龈成纤维细胞的扩增培养：

取口腔角质细胞，复苏扩增后，使用p5代细胞，以胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度5.0×10⁵个/ml，接种于培养皿中，加培养液ⅱ培养，轻轻晃动培养瓶，使细胞分散均匀后，置于37℃、5％co2条件下培养；

所述培养液ⅱ包括如下组分：

步骤三、基底层的配置：

取collageni、dmem培养基、fbs(牛血清)按照1：2：1比例混合，置于pet膜上，于25℃条件下静置1h，再移至37℃培养箱静置1h。

步骤四、固有层的配置：

取collageni、dmem培养基、fbs(牛血清)按照1：2：1比例混合，将混合液重悬牙龈成纤维细胞，使其密度为1.5×10⁵个/ml，置于基底层上，于25℃条件下静置1h，再移至37℃培养箱静置1h。固化后，加入培养液ⅱ浸泡固化后的固有层，于37℃二氧化碳培养箱中培养4-7天，得固有层。

步骤五、上皮层的配置：

舍弃部分固有层培养基，使固有层表面没有液体，以便于表皮细胞均匀附着在真皮层；取表皮细胞(1.5×10⁵个/ml)平铺于所述固有层，于37℃孵育2h使上皮细胞完全附着在固有层上，加入上述培养液ⅰ，于37℃二氧化碳培养箱培养2天；之后进行气液界面，于37℃二氧化碳培养箱培养2-3天，即得。

步骤六、全层口腔黏膜的形成和成熟：将上皮培养基舍弃，加培养液ⅲ进行气液界面培养7天，即得。

所述培养液ⅲ包括如下组分：

本实施例2提供的人体口腔黏膜模型的制备方法模拟人体口腔黏膜的生长发育过程，制备周期短，方法简易，可控性强，原料易于获取，可实现大规模产业化生产，保证维持口腔黏膜各层细胞生长的微环境，制备的全层口腔黏膜更接近于正常人体口腔黏膜结构，并具备相应的功能性，在体外条件下其功能和活性维持时间，能够满足相关口腔黏膜生物学检测的需求。既弥补了传统的使用单层黏膜组织模型的方法的缺陷，在缩短构建时间、降低成本的同时，又保证了模型的安全性与功效性。

对实施例2的口腔黏膜模型的结构进行直接观测：

为了能够直观地观测到实施例2所得的人体口腔黏膜模型的结构，将实施例2的人体口腔黏膜模型置于光学显微镜下观测：

1、对实施例2的人体口腔黏膜模型进行组织学切片：

(1)取材：新鲜组织用固定液固定24h以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。

(2)脱水浸蜡：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。具体地，其脱水处理的步骤按照如下顺序进行：采用浓度为75％的酒精脱水处理4h，而后采用85％酒精脱水处理2h，采用90％的酒精脱水处理2h，采用95％的酒精处理1h，再使用无水乙醇处理30min，而后使用无水乙醇处理30min；再使用醇苯处理5-10min，使用二甲苯处理5-10min，使用二甲苯处理5-10min，使用温度为65℃的融化石蜡处理1h，使用65℃的融化石蜡处理1h，使用65℃的融化石蜡处理1h。

(3)包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。

(4)切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机切片，厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，在烘箱内60℃的温度下烤片。水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。

2、he染色

(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ中20min、二甲苯ⅱ中20min、无水乙醇ⅰ中5min、无水乙醇ⅱ中5min、75％酒精中5min，最后用自来水洗。

(2)苏木素染色：将上述切片置于苏木素染液中染3-5min，用自来水清洗，采用分化液分化，再次清洗，返蓝液返蓝，最后用流水冲洗。

(3)拍摄：正置光学显微镜(日本尼康,nikoneclipsee100)在不同倍镜下拍照。

参照图1-3所示，该人体口腔黏膜自上而下分别为由上皮细胞生发复层分化组成的上皮层，由成纤维细胞及其胞外基质组成的固有层组合。

口腔黏膜模型应用于检测口腔细菌致病性评价：

根据本发明的设计构思，拟将实施例2制得的口腔黏膜模型应用于口腔细菌的致病性检测。具体地，其检测方法为：

1、制备实验组：将实施例2制得的口腔黏膜连同transwell小室转移到装有1.5ml培养基的6孔板中，将牙龈卟啉单胞菌涂抹于口腔黏膜的上皮层上，分别孵育8、14和24小时；

2、制备空白对照组：将实施例2制得口腔黏膜连同transwell小室转移到装有1.5ml培养基的6孔板中，将生理盐水涂抹于口腔黏膜的上皮层上，分别孵育8、14和24小时；

3、将所收集的实验组与空白对照培养基，根据乳酸脱氢酶细胞毒性检测剂盒说明书的操作方法进行处理，检测牙龈卟啉单胞菌对细胞的毒性。

参照图4的柱形图所示，其中纵坐标表示的是选择490nm波长，在酶标仪上读取光密度值(od490)，其中柱形图的高度越高表示口腔细胞的死亡率越高。随实验时间的延长，牙龈卟啉单胞菌在实施例2的口腔粘膜中导致更高的细胞死亡率，继而引发口腔炎症等疾病。因此，实施例2的口腔粘膜模型可以模拟牙龈卟啉单胞菌在口腔粘膜中的菌群生长情况，进而可以用于检测牙龈卟啉单胞菌对人体口腔细胞的毒性，避免进行活体实验，在体外培养的方式可以获得致病性细菌在人体的生长情况的检测的结果，并且使检测成本更低，为进一步的药物实验等工作提供极大的方便。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。