一种肝纤维化类器官模型的体外构建方法与流程

本发明涉及一种肝纤维化类器官模型的体外构建方法。

背景技术：

肝纤维化是一种复杂的炎症反应，由长期的慢性肝损伤造成，并有极大的风险发展为肝硬化乃至肝癌。病原学显示，多种因素与肝纤维化相关，如肝炎病毒感染，过量饮酒，自身免疫性疾病，肥胖等。肝纤维化可被定义为广泛性的瘢痕形成过程，并伴随内部构成及功能改变。其中肝星状细胞激活引起的细胞外基质分泌异常在肝纤维化中扮演着极其重要的作用。因此，以往肝纤维化的体外模型往往基于肝星状细胞的普通2d培养。尽管对于纤维化机制研究及药物筛选显示一定的参考价值，但普通单层培养并不能很好的模拟肝脏生理及病理状态下的微环境，例如缺乏细胞-细胞，细胞-胞外基质间的相互作用。因此，考虑到肝脏组织中成分的复杂性，一种新的模拟肝脏纤维化微环境的3d模型亟待开发。

类器官技术是一种利用哺乳动物多能干细胞、成体组织来源的干细胞或成体细胞的特性构建的模拟体内特性，并具有多细胞类型的体外模型。近来多项研究报道，这些有复杂内部结构的类器官，在功能及构造上已经趋近于相应体内结构。这种技术为研究组织器官的生理病理状态，及药物筛选提供了理想的平台。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速简易的肝纤维化类器官模型的体外构建方法，本发明提供的方法可以在较短时间内得到大小结构均一、纤维化表征明确的肝纤维化类器官模型，为进一步肝纤维化机制研究及药物筛选提供平台。

本发明的技术解决方案是：

一种肝纤维化类器官模型的体外构建方法，其特征是：包括下列步骤：

将肝细胞、肝星状细胞、枯否细胞及肝窦内皮细胞，混悬于培养基a；培养至第4天，换为培养基b维持培养；第10天开始，换为培养基c，连续培养六天；

所述培养基a包括：牛胰岛素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes）、氢化可的松、谷氨酰胺（glutamax）、胎牛血清、i型鼠尾胶原蛋白和无酚红威廉姆斯e培养基(william'semedium)。

所述培养基b包括：庆大霉素、转铁蛋白（transferrin）、维生素c，牛胰岛素、胎牛血清、亚硒酸钠、亚油酸、氢化可的松、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes）、谷氨酰胺（glutamax）、人表皮生长因子（hegf）和hbm肝细胞基础培养基；

所述培养基c包括：庆大霉素、转铁蛋白（transferrin）、维生素c、牛胰岛素、胎牛血清、亚硒酸钠、氢化可的松、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes）、谷氨酰胺（glutamax）、转化生长因子-β(tgf-β)、人表皮生长因子（hegf）和hbm肝细胞基础培养基。

将肝细胞、肝星状细胞、枯否细胞及肝窦内皮细胞，使用计数仪计数，按7:1.5:0.5:1的特定比例，混悬于培养基a。

将肝细胞、肝星状细胞、枯否细胞及肝窦内皮细胞按特定比例混匀于a后，计数后按每孔1200个细胞使用排枪均匀地接种于超低吸附圆底细胞板，每孔接种细胞混悬液的体积为100µl。

肝细胞、肝星状细胞、枯否细胞及肝窦内皮细胞按比例混悬于培养基a，接种于超低吸附圆底细胞板，然后放入37℃二氧化碳培养箱，静置3天，尽量避免移动。

培养至第4天，使用微量移液枪，紧贴培养基液面，吸出旧培养基；再沿孔壁缓慢加入100µl培养基b，隔日吸弃孔中50µl培养基，并加入等量培养基b，持续培养6天。

培养至第10天后，使用微量移液枪，紧贴培养基液面，吸出旧培养基；再沿孔壁缓慢加入100µl培养基c，隔日吸弃50µl培养基，加入等量培养基c，持续培养6天。

培养基a包括：2µg/mli型鼠尾胶原蛋白，10%胎牛血清，8µg/ml牛胰岛素，10ng/ml氢化可的松，2µmol/ml谷氨酰胺（glutamax），2µmol/ml4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes），无酚红威廉姆斯e培养基(william'semedium)；培养基b包括：100µg/ml庆大霉素，10%胎牛血清，10µg/ml转铁蛋白（transferrin），10μg/ml亚硒酸钠，10μg/ml亚油酸，1µg/ml维生素c，8µg/ml牛胰岛素，10ng/ml氢化可的松，2µmol/ml谷氨酰胺（glutamax），2µmol/ml4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes），2ng/ml人表皮生长因子（hegf），hbm肝细胞基础培养基；培养基c包括：5ng/ml转化生长因子-β（tgf-β），2%胎牛血清，100µg/ml庆大霉素，10µg/ml转铁蛋白（transferrin），10μg/ml亚硒酸钠，1µg/ml维生素c，8µg/ml牛胰岛素，10ng/ml氢化可的松，2µmol/ml谷氨酰胺（glutamax），2ng/ml人表皮生长因子（hegf），2µmol/ml4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes），hbm肝细胞基础培养基。

实验结果表明，本发明可于16天迅速构建肝纤维化类器官模型，且模型形状均一，大小均为200μm左右，避免体积过大中心细胞缺氧坏死的情况。同时该类器官可分泌白蛋白，并表达cyp4a3，cyp450等肝特异标志物。在第十天后使用培养基c持续诱导六天，可以在肝脏类器官中获得稳定的纤维化表型，如在蛋白及基因水平表达纤维化标志物α-肌动蛋白和i型胶原蛋白。

本发明基于肝脏内细胞成分比例，快速构建大小结构均一、纤维化表征明显的3d肝脏纤维化类器官体外模型。本发明构建的肝脏纤维化类器官模型，原理明确，结构稳定，方法简易，构建迅速，可操作性强，适用于肝脏纤维化发生发展机制研究，抗纤维化药物高通量筛选等，具有产业化意义。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为肝纤维化类器官的制备工艺流程图。

图2为不同时间点的光镜拍摄图。

图3是共聚焦检测肝纤维化类器官肝特异标志物的表达示意图。

图4是live/dead荧光检测肝纤维化类器官生长状态示意图。

图5是elisa检测肝纤维化类器官模型白蛋白(a)和炎症因子(b和c)分泌水平示意图。

图6是rt-pcr检测肝纤维化类器官模型白蛋白(a)和纤维化标志物(b和c)mrna水平示意图。

图7是共聚焦检测肝纤维化类器官纤维化标志物的表达示意图。

图8是免疫组化检测肝纤维化类器官纤维化标志物的表达示意图。

具体实施方式

参见图1，图1为本发明提供的肝纤维化类器官的制备工艺流程图。

步骤一，原代分选多种肝成分细胞，通过液氮冻存保种；或直接购置冻存的多种肝成分细胞。将肝细胞，肝星状细胞，枯否细胞，肝窦内皮细胞，使用自动细胞复苏系统小心复苏，800rps离心，使用培养基a重悬，分别使用细胞计数仪计数。按照7:1.5:0.5:1比例，以1200个细胞每孔/100µl，使用排枪小心均匀地种于超低吸附的圆底细胞培养板，持续培养3天。培养基a成分包括：2µg/mli型鼠尾胶原蛋白，10%胎牛血清，8µg/ml牛胰岛素，10ng/ml氢化可的松，2µmol/ml谷氨酰胺（glutamax），2µmol/ml4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes），无酚红威廉姆斯e培养基(william'semedium)。

步骤二，接种后在培养基a中置于37℃，5%co2培养箱中培养，静置培养3天，即可观察每个孔形成大小均一的细胞团。在第4天更换培养基b，同等条件继续培养。培养基b成分包括100µg/ml庆大霉素，10µg/ml转铁蛋白（transferrin），10%胎牛血清，10μg/ml亚硒酸钠，10μg/ml亚油酸，1µg/ml维生素c，8µg/ml牛胰岛素，10ng/ml氢化可的松，2µmol/ml谷氨酰胺（glutamax），2µmol/ml4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes），2ng/ml人表皮生长因子（hegf），hbm肝细胞基础培养基。

步骤三，使用微量移液枪，紧贴培养基液面，隔日吸弃孔中50µl旧培养基，缓慢加入等量培养基b，持续培养6天。在细胞培养板各个孔可见大小为200μm左右的类器官。在第10天，更换培养基c，同等条件继续培养六天，隔日半量换液。培养基c包括：5ng/ml转化生长因子-β（tgf-β），100µg/ml庆大霉素，10µg/ml转铁蛋白（transferrin），2%胎牛血清，10μg/ml亚硒酸钠，1µg/ml维生素c，8µg/ml牛胰岛素，10ng/ml氢化可的松，2µmol/ml谷氨酰胺（glutamax），2ng/ml人表皮生长因子（hegf），2µmol/ml4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes），hbm肝细胞基础培养基。

参见图2，图2是根据步骤一至三，从4h到第16天在不同时间节点拍摄的类器官模型光镜图。在培养基a中培养3天，在第4天开始置于培养基b中使类器官模型形成并成熟，在第10天开始进行纤维化诱导，第16天形成肝纤维化类器官模型。人类肝脏中主要分为肝实质细胞和非实质细胞，其中非实质细胞主要有肝星状细胞，肝窦内皮细胞和枯否细胞。将这四种细胞模拟肝中细胞比例混合接种于超低吸附圆形96孔板中，通过自组装形成类器官样模型后，在接下来的培养周期内都可以较好地保持形态特征。本发明构建的肝类器官稳定在直径200µm以内，这可以较好的避免由于体积过大中心缺氧而造成的细胞坏死。同时，在使用培养基c进行纤维化诱导后，从形态上观察并未发现异常变化。

参见图3，在培养第10天，使用免疫荧光鉴定类器官中肝特异标志物白蛋白，和特异酶cyp4a3及cyp450。具体地来说，使用吸头小心吸出类器官球，置于体积分数为4%的多聚甲醛中固定30min，然后使用0.1%triton-x透膜15min。加入5%bsa溶液封闭2h后孵育于特异性一抗中4℃过夜。隔日使用pbs洗3遍后加入对应荧光二抗，避光室温孵育一小时。使用pbs洗3遍后，室温避光dapi染色30min。在特定激发光下共聚焦检测三者荧光表达强度。在第10天，肝类器官模型中肝标志物白蛋白以及代谢酶cyp4a3及cyp450均有特异表达，提示肝类器官模型具有肝脏组织类似特性。

参见图4，按照工艺流程，在培养的第10天和第16天分别取出部分肝类器官，使用live/dead法分析生存状态。具体地来说，使用吸头小心吸出两组类器官球，使用pbs浸洗3遍。预先配置染色液(calceinam/ethidiumhomodimer-1,1:4)，加入类器官球避光染色30min，在特定激发光下共聚焦检测。如图4所示，在培养基c诱导纤维化后，相较于第10天，肝类器官中的死细胞略有增加，但总体生存状态并没有明显的区别，未见明显大量肝细胞死亡。这也与肝纤维化是一种慢性肝损伤疾病的概念相符。

参见图5，取第10天和第16天肝类器官的培养基上清液，用免疫酶联吸附法(elisa)，检测肝纤维化类器官白蛋白和炎症因子的分泌情况。具体地来说，取标准品和不同时间点肝类器官上清100µl加入特定孔中，室温孵育2.5h。使用300µl清洗缓冲液冲洗4次，每次5min，倒置检测板拍打去除余液。加入100µl抗体稀释液，室温孵育1h。使用300µl清洗缓冲液冲洗4次后，加入100µl链霉亲和素室温孵育45min。继续使用300µl清洗缓冲液冲洗4次，加入tmb底物溶液室温避光孵育30min。各孔加入50µl终止液，在读板器上以450nm波长检测。如图5所示，使用培养基c连续诱导培养6天后，上清液中肝特异标志物白蛋白的含量明显下降，提示肝类器官的白蛋白分泌功能受到抑制，推测肝脏类器官中的肝细胞受到一定的损伤。同时，类器官炎症因子tnf-α和il-1β分泌明显增多。提示本发明构建的肝纤维化类器官体外模型在较短时间内就能具有肝损和炎症的特征。

参见图6，使用rt-pcr检测肝类器官中白蛋白及纤维化标志物mrna表达水平。使用rneasymini试剂盒(qiagen)提取第10天和第16天肝类器官总rna，使用high-capacitycdnareversetranscription试剂盒(appliedbiosystems)逆转录为cdna。使用powerup™sybr™greenmastermix（thermofisherscientific），按照引物(acta2，f:aaaagacagctacgtgggtga;r:gccatgttctatcgggtacttc.alb,f:tgcaactcttcgtgaaacctatg;r:acatcaacctctggtctcacc.col1a1,f:gagggccaagacgaagacatc;r:cagatcacgtcatcgcacaac.gapdh,f:ggagcgagatccctccaaaat,r:ggctgttgtcatacttctcatgg)在实时定量pcr仪上进行rt-pcr。如图6所示，与elisa结果一致，使用培养基c连续培养6天后编码白蛋白的alb基因表达明显下调。同时，编码纤维化标志物α肌动蛋白的acat2基因及编码i型胶原蛋白的col1a1表达显著上升，提示本发明构建的肝纤维化类器官体外模型在较短时间内具有了纤维化表征。

参见图7，使用免疫荧光/激光共聚焦鉴定类器官中纤维化标志物α肌动蛋白和i型胶原蛋白表达。具体方法同图3。如图7所示，使用培养基c连续培养6天后纤维化标志物α-肌动蛋白和i-型胶原蛋白表达明显上升，说明本发明构建的肝纤维化类器官具有典型的纤维化表型。

参见图8，使用免疫组化检测类器官中纤维化标志物α肌动蛋白和i型胶原蛋白表达。取第10天和第16天肝类器官，使用4%福尔马林固定1h，石蜡包埋，切取5µm切片。脱蜡水化，放入3%双氧水以减少内源性过氧化氢酶。100℃下用柠檬酸盐缓冲液抗原修复30min，在bsa溶液中室温封闭1h。在湿盒中一抗稀释液4℃孵育过夜，tbst清洗三遍后，加入二抗稀释液室温孵育1h。dab溶液处理后，使用苏木精复染。封片并于显微镜下观察拍照。与以上共聚焦荧光分析一致，如图8免疫组化染色，培养基c连续诱导培养6天后纤维化标志物α-肌动蛋白和i-型胶原蛋白表达明显上升，进一步说明本发明成功构建了肝纤维化类器官模型。

以上说明仅是本发明的优选实施方式，在遵循本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应被视为本发明的保护范围。