组织块法培养长江三角洲白山羊毛囊干细胞的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种简单、快速分离组织块法培养长江三角洲白山羊（海门山羊）毛囊干细胞方法。

背景技术：

哺乳动物的毛发是由毛囊内的成体干细胞分化而来的，经历脱落和再生两个过程，毛囊是研究成体干细胞的理想模型。毛囊干细胞广泛的存在于皮肤毛囊结构中，是毛囊中的原始细胞，具有多向分化潜能，能通过自身的分裂增殖产生机体所需的细胞。毛囊干细胞位于毛囊隆突部，对毛发周期的维持、组织维持和更新、皮肤损伤修复等密切相关。毛囊(hf)是研究成体干细胞的理想系统，毛囊干细胞与毛囊周期状态密切相关，，毛囊干细胞在受到外界刺激如皮肤损伤或者剪毛等，毛囊干细胞发生募集，促进皮肤修复和毛发生成。

目前大多数分离方法都以小鼠触须毛囊和人类毛发为实验材料，这两种实验材料的毛囊组织较大，通过肉眼可轻松观察并分离培养。主要的分离方法有机械分离法和酶消化法，两种方法虽然均能获得毛囊干细胞细胞，但仍存在组织块贴附不牢、细胞因酶消化和机械分离而损伤等不足，目前国内外鲜有方法描述山羊毛囊干细胞分离过程，大多集中在细毛羊和绒山羊，而绵羊和山羊的毛囊结构在显微镜大小、形态都有差别，就使得毛囊干细胞的分离方法在物种间不能完全适用。长江三角洲白山羊是唯一能生产三类笔料毛的山羊，对于长江三角洲白山羊毛囊干细胞的研究对于我国长江三角洲白山羊产业发展具有重要的意义，不仅可为长江三角洲白山羊羊毛生长调节机制、毛囊生长规律等研究奠定坚实的理论基础，而且可为羊毛品质、产量和质量的提高提供重要的理论和技术支持。因此，找到一种适合长江三角洲白山羊毛囊干细胞的制备方法，对于山羊毛生长调节机制、毛囊生长规律等研究有着重要的作用。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有山羊毛囊干细胞分离技术的不足，提供一种组织块法培养长江三角洲白山羊毛囊干细胞的方法为研究长江三角洲白山羊所产的三类笔料毛生长调节机制、毛囊生长规律提供实验材料，本方法经过简单的操作步骤在短时间内就可以体外分离培养的长江三角洲白山羊毛囊干细胞。

本发明的技术方案如下：

组织块法培养长江三角洲白山羊毛囊干细胞的方法，其特征是，包括以下步骤：

1）样本选取120天胎龄的长江三角洲白山羊，采集其颈背部皮肤冲洗消毒后带回实验室；

2）将步骤1）中的样本切成1mm×1mm大小的组织块，放入0.25%的胰蛋白酶中，在37℃饱和湿度的培养箱中消化90min；

3）随即拿出并用含10%胎牛血清的培养液，漂洗组织块，并把组织块贴附在用i型鼠尾胶原包被的培养皿上；

4）把培养皿放入培养箱中37℃消化孵育30min后，加入含10%胎牛血清的培养液，37℃饱和湿度培养，每隔3天换液观察细胞生长情况；

5）当在显微镜下观察到每块组织块周围有大片原代细胞迁移出组织块时，进行传代培养。

优选地，步骤1)中，样本采集于江苏省国营海门市种羊场，先用手术刀刮干净表面的羊毛，用酒精消毒，再用手术刀割下2cm×2cm的完好皮肤组织样，该皮肤组织样包含表皮层、真皮层、皮下结缔组织，用生理盐水洗净，75%酒精消毒30s后再次用加入5%双抗的生理盐水冲洗3次并放入无血清培养液，于冰盒中带回实验室，在12h内进行分离培养。

优选地，步骤2)中，将步骤1)中采集的皮肤组织样经75%酒精浸泡30s，1×pbs冲洗干净，放入培养皿中，在超净台中用手术刀片将皮肤组织样顺着毛发生长的方向切割成1mm×1mm，放入培养皿中，加入0.25%胰蛋白酶使之没皮肤组织样，37℃饱和湿度消化90min。

优选地，步骤3)中，所提到的i型鼠尾胶原包被的培养皿包被过程如下：在无菌的超净台中用移液器吸取0.5mli型鼠尾胶原滴于直径6cm的培养皿中，使之均匀涂布与培养皿底部。

优选地，步骤5)中，把培养皿放入培养箱中37℃消化孵育30min后，小心的加入含10%胎牛血清的培养液，不要让组织块漂浮在培养液中。

优选地，步骤5)中，当步骤4)中培养的组织块在显微镜下观察到每块组织块周围有大片原代细胞迁移出组织块时，1×pbs冲洗细胞1次，加入0.25%胰蛋白酶至刚好没过培养皿表面，37℃消化2min，显微镜下看到大块游离的细胞团块，用移液器吹打，用无菌镊子夹除组织块，1200r/min离心去上清，按照1.0×10⁶个/ml的浓度于培养瓶中培养，每3天更换培养液。

优选地，步骤5）结束后，选择对数生长期细胞，37℃消化2min，1200r/min离心后，加入10ml1×pbs制成细胞悬液，1200r/min离心弃上清，然后加入细胞冻存液并调整至1.0×10⁶个/ml，分装入无菌冻存管中，封口，标记；将冻存管置于冻存盒放入超低温冰箱24h后移入液氮中长期保存细胞；复苏细胞时，用37℃温水快速解冻细胞，并与9倍体积的细胞培养液混合孵育10min后离心收集细胞，按5×10⁵个/ml的细胞密度接种于培养瓶。

优选地，所述的冻存液为含10%dmso和90%fbs。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明操作简单、快速，利用酶消化法成功启动了长江三角洲白山羊毛囊干细胞的原代培养，成功建立了长江三角洲白山羊毛囊干细胞系。

(2)本发明利用0.25%（体积浓度）胰蛋白酶在37℃条件下消化处理皮肤组织，能够使毛囊干细胞更容易迁移出组织块，相比较与直接培养组织块，缩短毛囊干细胞迁移出组织块的时间，同时经过i型鼠尾胶原包被的培养皿可以固定组织块，加快了毛囊干细胞迁移出组织块的速度。

(3)采用该方法分离细胞系生长分裂状态良好，原代细胞生长速度较快，第三天在显微镜下就可以观察到有少量细胞迁移出组织块（如图1中a所示），第四天可以在显微镜下看到每块组织块周围都有较多的细胞爬出组织块（如图1中b所示），第五天就可以在显微镜视野下观察到每块组织块周围都有大片的的细胞团围绕在组织块周围（如图1中c所示）。

(4)经上述细胞染色体分析、毛囊干细胞标记物检测，以及细胞活力检测等结果表明，所构建的长江三角洲白山羊毛囊干细胞系活力旺盛、毛囊干细胞标记物阳性率高，可为研究皮肤细胞基因表达与通路调控，皮肤附属结构的生长与分化机制，尤其是皮肤主要细胞间的相互作用机制研究提供良好的实用模型。

附图说明

图1为本发明中毛囊干细胞爬出组织块的过程图；

图2为本发明中毛囊干细胞h.e染色图；

图3为本发明中免疫荧光染色图；

图4为本发明中毛囊干细胞标记物阳性率示意图；

图5为本发明中破膜检测毛囊干细胞标记物阳性率示意图；

图6为本发明中cd49f阳性毛囊干细胞筛选图；

图7为本发明中细胞活力检测图；

图8为本发明中克隆形成率检测图；

图9为本发明中复苏存活率检测图。

具体实施方式

组织块法培养长江三角洲白山羊毛囊干细胞的方法：

首先，山羊皮肤组织样品的选择，所用的样品来源于长江三角洲白山羊（海门山羊），选取120天胎龄左右的胎羊，用剪刀采集颈背部皮肤冲洗消毒后带回实验室；

用手术刀切成1mm大小的组织块，放入胰蛋白酶中，在37℃饱和湿度的培养箱中消化90min；随即拿出并用换含10%胎牛血清的培养液漂洗，并在体视显微镜下用镊子去除皮下结缔组织和表皮，留下皮肤组织的真皮层；

把组织块贴附在鼠尾胶原包被的培养皿中，放入培养箱孵育30min，再小心的加入含10%胎牛血清的培养（不要让组织块漂浮在培养液中），37℃饱和湿度培养，每隔3天换液观察细胞生长情况；

待显微镜视野中每块组织块周围有大片原代毛囊干细胞爬出组织块时，进行传代培养；进行传代培养时先用0.25%胰蛋白酶消化2min，用无菌的镊子夹出组织块，再收集细胞进行第一次传代。

采用该方法分离细胞系生长分裂状态良好且操作简单、快速，减少了原代细胞分离培养过程中被污染的可能性。

建立长江三角洲白山羊毛囊干细胞的过程如下：

（1）样本采集于江苏省国营海门市种羊场，选取120胎龄（羊妊娠期正常时间是146到157天，平均下来是150天，这里就是还没有生产的山羊。）的胎羊颈背部的皮肤，先用手术刀刮干净表面的羊毛，用酒精消毒，再用手术刀割下2cm×2cm大小的完好皮肤组织样（包含表皮层、真皮层、皮下结缔组织），用生理盐水洗净，75%（体积浓度）酒精消毒30s后再次用加入5%双抗（是指青链霉素占青链霉素混合液的体积比为5%）的生理盐水冲洗3次并放入无血清培养液，于冰盒中带回实验室，在12h内进行分离培养；

（2）将步骤（1）中采集的皮肤组织样经75%（体积浓度）酒精浸泡30s，1×pbs（即0.01mol/lpbs）冲洗干净，放入培养皿中，在超净台中用手术刀片将组织块切割成1mm×1mm大小，放入培养皿中，加入0.25%胰蛋白酶使之没组织块，37℃饱和湿度消化90min；

（3）当步骤（2）消化后的组织块用含10%胎牛血清的培养液（说明书中的培养液均是指含10%胎牛血清、bfgf10ng/ml、egf10ng/ml、igf-110ng/ml、1%双抗、i型鼠尾胶原1%的dmem/f12培养液，10%胎牛血清是指每100ml培养液含有10ml胎牛血清）漂洗组织块2次；

（4）步骤（3）中经过漂洗的组织块在体视显微镜下用无菌镊子去除表皮层和皮下结缔组织，把组织块贴附在i型鼠尾胶原包被过的培养皿上，每个组织块间隔不大于1cm，并置于培养箱中孵育30min，小心加入培养液使之没过组织块，置于37℃、5%（体积浓度）co2、饱和湿度培养箱进行培养，每三天换液（培养液）并观察生长状况；

（5）步骤（4）中所提到的i型鼠尾胶原包被的培养皿包被过程如下，在无菌的超净台中用移液器吸取0.5mli型鼠尾胶原滴与直径6cm的培养皿中，使之均匀涂布与培养皿底部；

（6）当在显微镜下观察到步骤（4）中每块组织块周围有大片原代细胞迁移出组织块时，1×pbs冲洗细胞1次，加入0.25%胰蛋白酶至刚好没过培养皿表面，37℃消化2min，显微镜下看到大块游离的细胞团块，用移液器吹打，用无菌镊子夹出组织块，1200r/min离心去上清，按照1.0×10⁶个/ml的浓度于培养瓶中培养，每3天更换培养液；

（7）选择对数生长期细胞，37℃消化2min，1200r/min离心后，加入10ml1×pbs制成细胞悬液，1200r/min离心弃上清，然后加入细胞冻存液并调整至1.0×10⁶个/ml，分装入无菌冻存管中，封口，标记。将冻存管置于冻存盒放入超低温冰箱24h后移入液氮中长期保存细胞。复苏细胞时，用37℃温水快速解冻细胞，并与9倍体积的细胞培养液混合孵育10min后离心收集细胞，按5×10⁵个/ml的细胞密度接种于培养瓶；所述的冻存培养液为含10%（体积浓度）dmso和90%（体积浓度）fbs。

图1中：a是采用本发明体外组织块培养的长江三角洲白山羊毛囊干细胞72h（三天）后在显微镜下可以看到有少量细胞迁移出组织块生长；b是采用本发明方法96h（四天）可以在显微镜下看到组织块周围都有较多的细胞爬出组织块；c是采用本发明方法120h（五天）可以在显微镜视野下观察到每块组织块周围都有大片的的细胞团围绕在组织块周围，此时进行传代培养。

图2是采用本发明方法传代培养至第3代的长江三角洲白山羊毛囊干细胞，细胞经过h.e染色后呈现典型的铺路石状，a.50×10；b.20×10；（显微镜放大倍数，乘号前的是物镜，后面是目镜）。

图3是采用本发明方法，传代至第三代的长江三角洲白山羊毛囊干细胞荧光检测毛囊干细胞标志物cd49f、cd34；a1、a2、a3是cd49f，a4、a5、a6是对照组；b1、b2、b3是cd34，b4、b5、b6是对照组；

其中a1、a2、a3种的绿色荧光表示cd49f的表达情况；b1、b2、b3种的绿色荧光表示cd34的表达情况，蓝色荧光是dapi细胞核染色情况；cd34和cd49f在细胞内均高表达，cd34比cd49f表达量略高。

图4是采用本发明方法，传代至第三代的长江三角洲白山羊毛囊干细胞流式检测干毛囊干细胞标志物cd49f、cd34；流式检测结果表明cd34蛋白的阳性率为零，cd49f阳性率为52.9%。

图5是采用本发明方法，传代至第三代的长江三角洲白山羊毛囊干细胞破膜流式检测干毛囊干细胞标志物cd34，流式检测结果表明在cd34蛋白的阳性率为52.7%。

图6是采用本发明方法，传代至第三代的长江三角洲白山羊毛囊干细胞流式分选干毛囊干细胞标志物cd49f，a、空白对照组，b、实验组，cd49f阳性率高达89.9%。

图7是采用本发明方法，分别选取p3，p6，p10，p13细胞，检测0、1、2、3、4、5、6、7、8d的细胞活力，随着细胞传代次数的增多，细胞的增殖能力变弱。

图8是采用本发明方法，选取p3、p6、p10、p13细胞，做克隆形成率的测定，随着细胞传代次数的增多，克隆形成率均逐渐降低，第十代下降明显。

图9是采用本发明方法，选取p3、p6、p10、p13细胞，做复苏存活率测定，随着细胞传代次数的增多，复苏存活率均逐渐降低，第13代细胞依然可以达到40%以上。本发明提供了一种快速简单的方法-体外分离培养长江三角洲白山羊毛囊干细胞，该方法操作简单方便，只经过简单的操作即可获得体外分离培养的毛囊干细胞系，减少了原代细胞分离培养的步骤，降低了体外分离培养过程中被污染的可能性，采用该方法分离细胞系生长分裂状态良好，呈现典型的铺路石状，原代细胞爬出组织块的速度较快，第三天就可以观察到有细胞爬出组织块生长，第四天就可以在显微镜视野中观察到每块组织块周围都有较多的细胞爬出组织块，第五天就可以在显微镜视野下观察到大片的的细胞团围绕在组织块周围，此时进行第一次传代培养。经细胞染色体分析、毛囊干细胞标记物检测，以及细胞活力检测等结果表明，所构建的长江三角洲白山羊毛囊干细胞系活力旺盛、毛囊干细胞标记物阳性率高，可为研究皮肤细胞基因表达与通路调控，皮肤附属结构的生长与分化机制，尤其是皮肤主要细胞间的相互作用机制研究提供良好的实用模型。