本发明属于农林有机资源的高效利用技术领域，涉及用于园林绿化废弃物降解处置的微生物菌剂，具体涉及一种促园林绿化废弃物降解的微生物菌粉应用评价方法。
背景技术：
近年来，随着美丽中国理念的深化和生态城市建设规模的扩张，我国城市绿化水平、整体绿量均得到不断提高，同时也产生了大量园林绿化废弃物。城市园林废弃物主要是指在城市绿地、行道树及城郊林地中绿化植物自然或养护过程中产生的草坪、枯枝落叶及林木修剪物等。这些城市园林废弃物含有大量的淀粉、纤维素、木质素和营养元素，是一种可再利用的有机资源，也是生态系统物质循环的重要组成部分。然而，作为城市固体垃圾的主要来源之一，每年有近5000万吨的园林废弃物进入环卫填埋系统，其不仅造成园林生物质资源浪费和垃圾填埋场收纳能力下降，也易导致周围水体、大气和土壤环境的二次污染。
城市园林废弃物的资源化利用方式主要是就地粉碎作为绿化土壤覆盖物或简易堆肥作为植物生长基质，但存在粉碎易产生扬尘、堆腐不透彻易孪生病菌和臭气等问题。而经过一定预处理，在适宜条件下利用好氧微生物进行堆肥发酵，促进大分子有机物降解和腐殖质类物质形成是实现园林绿化废弃物资源化、高效化利用的主要途径。研究表明，纤维素酶是催化纤维素快速水解和诱导木质素降解酶(胞外过氧化酶和胞外酚氧化酶)产生的核心酶系，主要包括葡聚糖内切酶、外切酶和苷酶，其协同作用将纤维素降解为纤维低聚糖及葡萄糖。因此，如何构建快速降解、彻底腐熟且应用方便的微生物菌剂是促进园林纤维素等大分子物质分解、转化、合成土壤有机质和植物生长营养物质的关键。
目前，国内关于降解农林废弃物纤维素的微生物菌剂相关技术研究主要集中在以下几个方面：
(1)秸秆腐熟菌剂
纤维素是秸秆主要的物质组成成分，因其化学结构复杂、性质稳定，同时秸秆表面易形成非水溶性蜡质层，导致其自然腐解速度缓慢。另由于秸秆的c/n比过高，直接还田会出现土壤微生物与作物争夺氮源的现象，从而影响秧苗生长和作物产量。因此，开发快速降解、高效腐熟的秸秆微生物菌剂是农作废弃物资源化处置与利用的有效技术手段。王元明(2013年)筛选和制备了适用于高温条件下，降解和腐熟水稻秸秆的微生物菌剂。其研究结果为：通过等比例混合两种高温链霉属发酵菌液，制备成即用型腐熟菌液，高温好氧堆肥20天水稻秸秆即可实现较好的降解腐熟效果，其腐熟产品的种子发芽率达到85.96％(王元明，高温纤维素降解菌的筛选及其复合菌剂对秸秆降解效果的研究，南京农业大学，2013)。该应用菌剂具有降解率高、腐熟彻底、适应堆腐高温环境等优点，但该菌剂为液体形态，存在不易保藏和适用温度条件局限等问题，因此无法满足工业级、规模化生产需求。殷中伟(2010年)筛选和制备了适用于降解小麦秸秆的微生物复合菌系。其研究结果为：在小麦秸秆液体培养过程中，复合菌系y2b对纤维素和半纤维素的降解率可达40％以上，且其纤维素酶活在第2d时即可达到最高，为61.2u/ml(殷中伟，秸秆纤维素高效降解菌株的筛选及对秸秆降解效果初步研究，中国农业大学，2010)。该复合菌系具有菌群多样、产酶活性高、降解效率显著等优点，但其所含菌种信息不完全、菌剂形态为液体，仅适用于实验室研究分析，产业化应用可能存在病原菌侵染等风险。
(2)园林生物质堆肥菌剂
园林生物质的堆肥化处理，即在微生物的作用下通过高温发酵，使生物有机质实现矿质化、腐殖化和无害化腐熟产品的过程，其中微生物(菌株或菌系)可改善堆料的理化性质、加速堆肥的腐熟、促转化形成腐殖质。田赟(2012年)研究了外源有机废弃物发酵菌曲与竹酢液比例添加对园林修剪物堆肥腐熟效果的影响。其研究结果为：向园林废弃物堆肥中添加0.5％有机废弃物发酵菌曲+稀释1000倍竹酢液2l，可有效提高堆肥初期温度的上升幅度、加快堆肥腐熟速度、提升堆肥产品质量，同时一定稀释倍数竹酢液的添加可有效减少氮素损失、提高微生菌剂活性(田赟，园林废弃物堆肥化处理及其产品的应用研究，北京林业大学，2012)。在园林废弃堆肥处置中，发酵菌曲和竹酢液的添加可有效提高堆肥产品的全氮、全磷、全钾以及铁和硫的质量分数，促进青苹果竹芋栽培的成活率，并提高其株高与生物量。但该菌曲的生物有效性以及其中微生物的种属信息并不明确。史龙翔(2015年)筛选并组配了适合降解果树枝条纤维素的微生物菌群。其研究结果为：青霉菌(penicilliumsp.)、支顶孢菌(acremoniumalternatum)、黄灰青霉菌(penicilliumaurantioqriseum)与罗尔斯通菌(ralstoiniasp.)等比例组配所得液体微生物菌群，可有效提高果树枝条堆体的腐解温度、延长高温腐解期、促进物料腐熟，且纤维素酶、漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的活性均显著提高(史龙翔，纤维素降解菌的筛选及其在果树枝条腐解中的应用，西北农林科技大学，2015)。该试验筛选并组配了一组可高效降解果树枝条纤维素的微生物菌系，其中青霉菌的纤维素酶活明显高于组合菌系，并在堆肥高温期发挥重要作用。然而，该菌系仍然是各菌液的等比例组配，何种菌株起关键作用以及如何参与降解过程并未明确，同时液体菌系的生物有效性亦未作研究。
技术实现要素：
随着城市绿化水平大幅提高，大量的园林绿化废弃物随之产生，然而其生物质资源的低效处置是城市管理与绿色发展面临的主要问题。纤维素是城市园林废弃物的主要化学成分之一。如何实现城市园林绿化废弃物中纤维素的快速降解和园林生物质资源的高效利用是本专利申请要解决的核心技术问题。
本专利申请发明人通过大量详实的试验得出，产黄纤维单胞菌(cellulomonasflavigena)可有效降解城市园林绿化废弃物中的纤维素。为突显所述产黄纤维单胞菌(cellulomonasflavigena)高效、低能耗处理园林绿化废弃物的应用优势，本发明进一步将产黄纤维单胞菌(cellulomonasflavigena)制备成方便贮存和使用的微生物菌粉，并评价其在园林绿化废弃物降解处置中的效果。
具体地，一种微生物菌粉的评价方法，园林绿化废弃物经物理处理后接种一定剂量的微生物菌粉，置于适宜的环境温度中恒温(30±1℃)培养，定期测定园林绿化废弃物降解剩余物的质量变化情况，通过降解失重率评价所述微生物菌粉对园林绿化废弃物的降解效率；
培养15d时，所述微生物菌粉对园林绿化废弃物的降解失重率不低于30％；
所述微生物菌粉的制备方法为：将产黄纤维单胞菌(cellulomonasflavigena)菌体与吸附性载体以质量1:(0.5-1.5)的比例混合；再加入润湿剂，所述产黄纤维单胞菌(cellulomonasflavigena)菌体与润湿剂的比例为1:(0.5-1.5)；再加入保护剂，所述产黄纤维单胞菌(cellulomonasflavigena)菌体与保护剂的比例为1:(0.5-1.5)；搅拌混匀，真空干燥即得所述微生物菌粉；
所述吸附性载体选用糊精、硅藻土、滑石粉或碳酸钙；
所述润湿剂选用吐温80、聚乙二醇、可溶性淀粉或十二烷基硫酸钠；
所述保护剂选用草炭、高岭土、海藻酸钠或羟甲基纤维素钠。
所述吸附性载体、润湿剂和保护剂的选用，可有效确保微生物菌粉中产黄纤维单胞菌的有效活菌数量。经验证，本发明所述的微生物菌粉的主要技术指标符合《农用微生物菌剂(gb20287-2006)》中有机物料腐熟剂产品粉剂的指标要求。这种微生物菌粉在390d储存期内，产黄纤维单胞菌的活菌数不低于0.5×108个/g，纤维素酶活力不低于30u/g。
将上述制备的微生物菌粉等质量分装于棕色信封袋，封口密闭，并常温(10-30℃)存放于储药柜中。经不同储存期(30d、90d、180d、270d、330d、390d、450d)菌粉的有效活菌数和纤维素酶活力测定得出，在390d储存期内，其主要技术指标符合《农用微生物菌剂(gb20287-2006)》项下有机物料腐熟剂产品粉剂的指标要求，即有效活菌数≥0.50×108个/g、纤维素酶活力≥30u/g。
作为本发明具体的所述微生物菌粉评价方法的实施方式之一，用在10-30℃避光存放390d的所述微生物菌粉降解园林绿化废弃物，所述微生物菌粉对园林绿化废弃物的降解失重率不低于30％。
作为一种优选的实施方式，所述园林绿化废弃物为芦苇(phragmitesaustralis)、郁金香(tulipagesneriana)、银线草(chloranthusjaponicus)、鸢尾(iristectorum)的一种或几种的枯萎茎秆。
另一层面，本发明还给出这种微生物菌粉在降解园林绿化废弃物中的应用。作为所述应用的进一步说明，所述微生物菌粉以产黄纤维单胞菌(cellulomonasflavigena)菌体作为活性菌，用于降解园林绿化废弃物中的纤维素。
与现有技术相比，本发明的有益效果或优点主要体现在以下方面：本发明以产黄纤维单胞菌(cellulomonasflavigena)作为微生物菌粉的有效活性微生物，该微生物菌粉可高效促使园林纤维素的降解。本发明制备的微生物菌粉在390d储存期内，其主要技术指标符合《农用微生物菌剂(gb20287-2006)》中有机物料腐熟剂产品粉剂的指标要求，即有效活菌数≥0.50×108个/g、纤维素酶活力≥30u/g。采用本发明所述条件储存微生物菌粉至450d时，其5‰菌粉混悬液对芦苇茎秆恒温培养至第5d、10d、15d时的降解失重率分别为16.8％、22.2％、29.6％(取平均值)，相对空白对照组(ck:1.01％2.93％3.59％)分别提高了1563％、657％和724％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，下述各实施例仅用于说明本发明，对本发明并没有限制。
实施例1
本实施例提供一种可降解园林纤维素的微生物菌粉，其有效活菌为具有极强降解纤维素能力的产黄纤维单胞菌(cellulomonasflavigena)。本实施例所用产黄纤维单胞菌菌体为纤维单胞菌属模式菌种，该菌种采购自中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心。为制备耐贮存、方便应用的固体状微生物菌粉，本实施例将产黄纤维单胞菌的液体发酵菌体与特定比例的适宜吸附性载体、润湿剂和保护剂混合。具体地，吸附性载体选用糊精、硅藻土、滑石粉或碳酸钙中的一种或多种，以质量比计，所述产黄纤维单胞菌体与吸附性载体的比例为1:(0.5-1.5)；润湿剂选用吐温80、聚乙二醇、可溶性淀粉或十二烷基硫酸钠中的一种或多种，以质量比计，所述产黄纤维单胞菌体与润湿剂的比例为1:(0.5-1.5)；保护剂选用草炭、高岭土、海藻酸钠或羟甲基纤维素钠中的一种或多种，以质量比计，所述产黄纤维单胞菌体与保护剂的比例为1:(0.5-1.5)。进一步地，本实施例将结合具体的试验过程，说明吸附性载体、润湿剂和保护剂的选用类型及用量。
吸附性载体类型的确定，通过测定不同吸附期所用载体的吸菌量，即有效活菌数作为评价指标。具体测定方法为：发酵菌液与吸附性载体以10:1(体积质量比，v/m)的比例混悬，静置30min，经3500rpm转速离心5min，取下层沉积物置于35℃培养箱中，分别在第1、3、5h和第1、3、5d时测定其有效活菌数，根据有效活菌数数量由多到少排序筛选最佳吸附性载体。
不同吸附性载体的选用，及各吸附性载体在不同吸附期的有效活菌数参见表1。本试验考察了糊精、硅藻土、滑石粉、碳酸钙作为吸附性载体对产黄纤维单胞菌的吸菌量。从表1可以看出，糊精、硅藻土、滑石粉、碳酸钙均可有效地吸附产黄纤维单胞菌，其中，糊精在第1、3、5h和第1、3、5d时吸附产黄纤维单胞菌的有效活菌数量分别为(3.15-3.21)×108个/g、(3.06-3.12)×108个/g，均多于硅藻土、滑石粉、碳酸钙在相应时期的有效活菌数。因此，可选用糊精作为优选的吸附性载体。
表1不同吸附性载体在不同吸附期的有效活菌数
润湿剂类型的确定，采用刻度量筒法测定菌粉样品沉入筒底时间作为评价指标。具体评价方法为：根据上述方法筛选所得吸附性载体的离心沉积物，以1:1(质量比，m/m)的比例添加不同类型润湿剂，35℃真空干燥24h，研磨成粉末，称取1g样品快速倒入盛有500ml水的500ml刻度量筒中，不搅动，立刻秒表计时，99％样品沉入筒底时间越短即表明润湿性越好。不同润湿剂对应菌粉样品的沉降时间，参见表2。
表2不同润湿剂对应菌粉样品的沉降时间
本试验考察了吐温80、聚乙二醇、可溶性淀粉、十二烷基硫酸钠对菌粉样品的润湿性能。从表2可以看出，吐温80、聚乙二醇、可溶性淀粉、十二烷基硫酸钠对菌粉样品均有润湿性，但彼此之间的润湿性存在差异，其中，聚乙二醇在3次试验中对菌粉样品沉入筒底时间测定结果分别为35s、38s、36s，沉降时间均明显短于吐温80、可溶性淀粉、十二烷基硫酸钠对菌粉样品的沉降时间。因此，可选用聚乙二醇作为优选的润湿剂。
保护剂类型的确定，通过测定50℃高温条件下菌粉有效活菌数作为评价指标。具体测定法为：发酵菌液离心所得菌体与保护剂以1:1(质量比，m/m)的比例混拌，并置于50℃培养箱中，分别在第1、3、5h和第1、3、5d时测定其有效活菌数，根据有效活菌数数量由多到少排序筛选最佳保护剂。不同保护剂的选用，及各保护剂在不同吸附期的有效活菌数参见表3。
表3不同保护剂在不同吸附期的有效活菌数
本试验考察了草炭、高岭土、海藻酸钠、羟甲基纤维素钠作为保护剂对产黄纤维单胞菌在不同吸附期的有效活菌数。从表3可以看出，草炭、高岭土、海藻酸钠、羟甲基纤维素钠均可有效地使产黄纤维单胞菌保持有效状态，其中，高岭土在第1、3、5h和第1、3、5d时的产黄纤维单胞菌有效活菌数量分布分别为(2.23-2.25)×108个/g、(2.19-2.21)×108个/g，多于草炭、海藻酸钠、羟甲基纤维素钠作为保护剂在相应时期的有效活菌数。因此，可选用高岭土作为优选的保护剂。
所选用吸附性载体、润湿剂和保护剂用量的确定，采用l9(34)正交试验法，以菌粉有效活菌数作为评价指标。在上述单因素考察的基础上，以糊精(a)、聚乙二醇(b)、高岭土(c)、温度(d)为主要考察对象，表4给出了l9(34)正交试验的因素与水平。
表4l9(34)正交试验因素与水平
表4所涉及的菌体与吸附性载体、润湿剂和保护剂用量均以质量比(m/m)的比例混拌。根据表4的因素水平，以制备菌粉的有效活菌数作为评价指标，采用l9(34)正交试验法确定最佳比例关系。表5给出了l9(34)正交试验结果及直观分析结果。
表5l9(34)正交试验及直观分析结果
表5的直观分析k值及极差r值表明，载体糊精为最主要考察因素，菌粉配比及储存温度的最佳条件为a3b1c1d2，另考虑到糊精(a)的k2与k3值和聚乙二醇(b)的k1与k2值差异性不显著，即选择因素a、b、c的最佳比例条件确定为1:1.2、1:0.8、1:0.5。
实施例2
本实施例提供一种可降解园林纤维素的微生物菌粉的制备方法，包括步骤：1)菌液发酵，对产黄纤维单胞菌进行液体发酵，停止发酵时发酵菌液中产黄纤维单胞菌的活菌数不低于2.0×108个/ml；2)菌体分离，去除发酵菌液中的水分，获得产黄纤维单胞菌菌体；3)菌粉制备，按质量比加入吸附性载体、润湿剂和保护剂，搅拌混匀，真空干燥即得所述微生物菌粉。
1)菌液发酵
以有效活菌数达到2.0×108个/ml以上的产黄纤维单胞菌(cellulomonasflavigena)的培养发酵液作为种子液，以10％的接种体积接种至液体发酵用发酵罐中，通过工业培养条件对产黄纤维单胞菌进行液体发酵，当菌液有效活菌数达到2.0×108个/ml以上时停止发酵。
关于液体发酵用培养基配方中碳源、氮源的确定是以产纤维素酶活力为指标筛选所得。采用单因素变量试验法，以替代性碳、氮源为可变性因素组合不同的碳、氮源组合(因素信息见表6)，其它培养基配方及发酵条件不变，通过dns比色法测定其相应发酵液产纤维素酶活力，排序筛选产酶活力最高的碳、氮源组合。测定结果见表7。
表6不同的碳、氮源因素信息
表7不同碳、氮源组合及相应发酵液产纤维素酶活力测定结果
结合表6和表7可以得出，利用碳、氮源可替代的专用培养基对产黄纤维单胞菌进行液体发酵，液体发酵用培养基碳源、氮源分别选用羧甲基纤维素钠和硝酸铵为最佳碳、氮源组合，并且羧甲基纤维素钠(cmc-na)与硝酸铵的投料比(质量比)为5:1。
基于上述试验结果，本实施例给出一种优选的液体发酵培养基配方：cmc-na5g、nh4no31g、kcl0.5g、mgso4·7h2o0.5g、kh2po40.9g、酵母浸粉0.5g，蒸馏水定容至1000ml，ph7.0-7.2。这一培养基适用于种子发酵和规模发酵。
本实施例所述液体发酵所用种子液的培养条件：将配制的液体培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶装200ml，经湿热灭菌处理(121℃，103mpa，30min)，无菌操作条件下每瓶接种菌饼(直径1.5cm)2个，恒温30℃、振荡转速160rpm，持续培养36-48h，至种子液有效活菌数达到2.0×108个/ml以上时停止发酵。
本实施例所述液体发酵培养条件：制备上述发酵用培养基，置于全自动发酵罐中，按照常规操作进行灭菌处理(121℃，103mpa，30min)，以10％的体积分数在无菌条件下接入种子液，恒温30±1℃、搅拌速度250-300rpm、通风量0.25-0.30m3/min、罐压0.035-0.055mpa，持续发酵36-48h，通过血球计数板进行有效活菌数测定，当菌液有效活菌数达到2.0×108个/ml以上时停止发酵。
2)菌体分离
将上述所得发酵菌液进行室温静置，并使用高速冷冻型蝶式分离机，以3500rpm转速、5±1℃离心温度，进行高速离心10min，去除发酵液中的水分，获得灰黄色膏状菌体。
在本步骤中，所述室温静置，是指20-25℃条件下在蝶式分离机中静置60-100min。室温静置的目的在于实现发酵液中菌体和水分的有效分离，并最大程度的避免菌体的损失。所述膏状菌体是指低温高速离心后获得含有约10％水分的菌泥。在菌体分离过程中，近菌泥上层的水溶液为高浓度的菌液，若彻底分离则导致菌体损失。另外，菌粉制备试验证明，含有约10％水分的菌泥与吸附性载体、保护剂的吸附粘合性较好，且具有亲水性，易与润湿剂聚合。因此，本实施例菌体分离步骤中，所得菌体一般是指含有约10％水分的菌泥。
3)菌粉制备
将上述所得菌体按质量比加入吸附性载体、润湿剂和保护剂，以质量比计，所述菌体与吸附性载体的比例为1:(0.5-1.5)，所述菌体与润湿剂的比例为1:(0.5-1.5)，所述菌体与保护剂的比例为1:(0.5-1.5)。搅拌混匀，真空干燥，获得类白色微生物菌粉。在本步骤中，真空干燥参数优选为：-0.08mpa条件下，35℃干燥24-36h。
实施例3
本实施例给出实施例1和2制备的微生物菌粉的评价方法。本实施例采用降解失重率法评价微生物菌粉对园林绿化废弃物的降解效率，将不同储存期(30d、90d、150d、210d、270d、330d、390d和450d)的微生物菌粉分别配置成5‰菌粉混悬液，分别在恒温(30±1℃)培养的第5d、10d和15d时计算其对园林绿化废弃物的降解失重率，失重比率越大说明其降解效率越高。
本实施例所述园林绿化废弃物是指芦苇(phragmitesaustralis)、郁金香(tulipagesneriana)、银线草(chloranthusjaponicus)、鸢尾(iristectorum)的一种或几种的枯萎茎秆。为了避免其它杂菌对所选材料的污染与干扰，在降解效率评价步骤实施前对选用的枯萎茎秆做灭菌处理，并真空干燥。优选地，灭菌处理方法为湿热灭菌法，灭菌条件为121℃，103mpa，30min。真空干燥的设定温度为75℃，真空度为-0.08mpa，干燥时间为24～36h。
为了进一步明确本实施例所述方法，使其更具操作性和实用性。本实施例所涉及的化学药品试剂均为分析纯；药品配制所使用的水为去离子水，如磷酸缓冲液所用的水为去离子水；无菌水浸泡枯萎茎秆所使用的水为无菌水，即湿热灭菌法处理的去离子水。
具体地，园林绿化废弃物降解失重率测定方法如下：园林绿化废弃物用无菌水浸泡过夜，真空干燥至恒重，剪碎至长约2cm的段；将上述待降解材料分装于500ml三角瓶内，每个三角瓶装5g上述待降解材料；向每个三角瓶内加入(nh4)2so40.2g、mgso4·7h2o0.05g，5mmol/lph＝7.0的磷酸缓冲液(pbs)40ml。每瓶分别接种5‰菌粉混悬液10ml，以接种10ml无菌水作为空白对照组(ck)，混匀后置于30±1℃恒温培养，定期观察并测定枯草的形态和质量变化情况。每处理试验均重复3次。本实施例的评价结果见表8。
降解失重率计算公式：d＝(m0-m1)/m0×100％。其中，d表示定期培养后园林绿化废弃物的降解失重率，％；m0表示无菌水浸泡过夜，过滤，真空干燥所得处理前园林绿化废弃物质量，g；m1表示定期(第5d、10d和15d)培养后，无菌水洗去菌体和孢子，过滤，真空干燥所得未降解园林绿化废弃物质量，g。
表8不同储存期微生物菌粉对园林绿化废弃物的降解效果评价
表8显示，对储存于常温、避光条件下第30d、90d、150d、210d、270d、330d、390d和450d的微生物菌粉均可有效降解园林绿化废弃物。微生物菌粉对园林绿化废弃物的降解能力，随储存期的延长而有所降低，390d储存期内所述微生物菌粉对园林绿化废弃物的降解失重率高于30％，450d储存期内所述微生物菌粉对园林绿化废弃物的降解失重率接近30％。在同一储存期内，所述微生物菌粉对园林绿化废弃物的降解失重率随培养时间的延长而增加，培养15d后可实现园林绿化废弃物的有效降解。
上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。