益生菌、发酵剂及在中草药制剂中的应用的制作方法

本发明涉及一种益生菌及发酵剂，特别涉及益生菌、发酵剂及在中草药制剂中的应用。

背景技术：

樟树子(香樟子)干燥果实，圆球形，棕黑色至紫黑色，表面皱缩不平，直径约5～10毫米。味辛性温，无毒，具有散寒祛湿，行气止痛，抑菌，治吐泻，胃寒腹痛，肿毒之功效。灵丹草为菊科植物翼齿六棱菊的干燥地上部分。秋季茎叶茂盛时采割。其味辛、苦，性寒。有清热解毒，止咳祛痰之功效。

弧菌属(vibrio)广泛分布于河口、海湾、近岸海域的海水和海洋动物体内。弧菌病是由弧菌属引起的一类疾病，为海水鱼类最常发生的细菌性疾病。弧菌病共同的病症是体表皮肤溃疡。主要鱼贝类致病菌为：溶藻弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌等；有些弧菌也能引起人类疾病，如溶藻弧菌、创伤弧菌等。

产酶芽孢杆菌在水中增殖后产生的许多胞外酶能把养殖水体和底泥中的淀粉、蛋白质和脂肪等有机质分解，从而达到降低养殖水体富营养化和减少底泥生成的作用。屎肠球菌是乳酸菌中抗逆性较强的一类，具有很好的抗逆性(高温、酸碱、高盐、氧气)，肠道黏附能力好，对部分抗生素也具备很好的耐受性。

使用益生菌对中草药进行发酵，微生物酶的酶促反应能使中草药活性物质更充分的释放或者进一步代谢转化为活性更高的成分。卫生部药品检验所试验表明，发酵中草药只需要传统煎、煮、熬水提物量的1/28，便可发挥与之同等的药效。现代微生物发酵研究表明，微生物在发酵中草药的过程中产生的酶类可以消化植物细胞壁，大幅度的释放活性物质，降解有毒物质，产生新的生物活性物质，从而对中草药有效成分进行生物学转化，将中草药中的大分子物质转化为能够被动物肠道直接吸收的小分子物质，使中草药成为快速吸收、定量疗效的新型药物。单一菌种的中草药发酵常存在产酶种类单一，产酶能力较弱等方面的不足。相比于单菌发酵，混菌发酵可以更大限度的发挥多菌及酶类的复合效用，发酵效率更高，发酵产物更丰富，比单菌发酵更有潜力。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供了一种益生菌、发酵剂及在中草药制剂中的应用，以达到有效抑制弧菌病害，并应用于水产养殖中的目的。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种益生菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)bsx，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期是2018年4月2日，保藏号为cgmccno.15541，dna序列如seqidno.1所示。

一种发酵剂，所述发酵剂由权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)bsx、以及屎肠球菌(enterococcusfaecium)ef026和地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)bl3c制成，所述屎肠球菌(enterococcusfaecium)ef026和地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)bl3c均保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期是2018年4月2日，保藏号分别是：cgmccno.15542、cgmccno.15543，dna序列如seqidno.2和seqidno.3所示。

上述方案中，所述发酵剂的制备方法如下：枯草芽孢杆菌bsx和地衣芽孢杆菌bl3c在液体lb培养基中37℃培养12～16小时，屎肠球菌ef026在液体mrs培养基中37℃培养12～16小时，枯草芽孢杆菌bsx、地衣芽孢杆菌bl3c、屎肠球菌ef026按菌活比1～3：1～3：1～2混合。

进一步的技术方案中，所述发酵剂的制备方法如下：枯草芽孢杆菌bsx和地衣芽孢杆菌bl3c在液体lb培养基中37℃培养14小时，屎肠球菌ef026在液体mrs培养基中37℃培养15小时，枯草芽孢杆菌bsx、地衣芽孢杆菌bl3c、屎肠球菌ef026按菌活比1：1：1混合。

一种发酵剂在中草药制剂中的应用，采用上述发酵剂，所述中草药制剂具有抑制病原弧菌的作用。

进一步的技术方案中，所述发酵剂用于发酵制备液体中草药制剂的具体方法如下：中草药粉碎至30～60目，占总质量的5～15％，水占总质量的65～75％，发酵剂占总质量的15～20％，35～40℃发酵48～72小时。

进一步的技术方案中，所述发酵剂用于发酵制备固体中草药制剂的具体方法如下：中草药粉碎至30～60目，占总质量的10～15％，麸皮占总质量的20～25％，玉米粉占总质量的10～15％，豆粕占总质量的5～10％，硫酸铵占总质量的0.5～1％，磷酸二氢钾占总质量的0.2～0.25％，硫酸镁占总质量的0.05～0.1％，水占总质量的25～30％，发酵剂占总质量的10～15％，30～35℃发酵72～96小时。

更进一步的技术方案中，所述中草药为香樟子或灵丹草。

通过上述技术方案，本发明提供的2株益生菌(枯草芽孢杆菌bsx、地衣芽孢杆菌bl3c)能产生强大的复合酶系，包括蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、木质素酶、半纤维素酶、纤维素酶等。屎肠球菌ef026在提高动物免疫力、调节肠道微生态平衡，提高营养吸收、减少腹泻率、降低死亡率等方面均有很好的效果。香樟子和灵丹草经该微生物发酵剂发酵后，对病原弧菌的抑制作用提高了2～4倍。应用本发明的中草药制剂不具有抗生素残留和药物耐受性等风险，绿色环保，在水产养殖领域具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明所述三株益生菌的菌落形态；

图2示本发明所述中草药制剂对副溶血弧菌的抑制作用；

图3示本发明所述中草药制剂对哈维氏弧菌的抑制作用；

图4示本发明所述中草药制剂对溶藻弧菌的抑制作用。

注：图中字母l表示灵丹草；x表示香樟子；中间数字0，1，2分别代表空白组，液体发酵，固体发酵；右边的0，2，4分别代表稀释倍数，0为不稀释，2为稀释2倍，4为稀释4倍；“水”为阴性对照。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

1、菌落培养

将枯草芽孢杆菌bsx、地衣芽孢杆菌bl3c均在lb液体培养基中活化，以1％接种量转接于5mllb液体培养基。将屎肠球菌ef026在mrs液体培养基中活化，以1％接种量转接于5mlmrs液体培养基。将上述菌液在37℃，180rpm条件下培养12～16小时后，用无菌水对其进行10倍梯度稀释，取各梯度浓度bsx、bl3c菌液100μl涂布于90×90mmlb固体培养基上，37℃条件下培养12～16小时，取各梯度浓度ef026菌液100μl涂布于90×90mmmrs固体培养基，37℃条件下培养16～20小时，取合适浓度的培养皿观察菌落形态，见图1。

2、两种益生菌的产酶活性的测定

利用lb培养基、tcbs培养基、木质素降解培养基、cmc(羧甲基纤维素)分离培养基、蛋白降解培养基、淀粉降解培养基、半纤维素降解培养基、果胶降解培养基对枯草芽孢杆菌bsx、地衣芽孢杆菌bl3c的产酶特性的研究。将枯草芽孢杆菌bsx、地衣芽孢杆菌bl3c在lb液体培养基中活化，37℃培养16小时后，在相应的酶板上点10μl菌液，培养一到两天后，通过染色剂染色漂洗或直接观察，测菌落直径及水解圈直径，结果见表1。

表1.枯草芽孢杆菌bsx、地衣芽孢杆菌bl3c的产复合酶能力

3、发酵剂的制备

将枯草芽孢杆菌bsx、地衣芽孢杆菌bl3c在lb液体培养基中活化，以1％接种量转接于100mllb液体培养基，培养14小时；屎肠球菌ef026在mrs液体培养基中活化，以1％接种量转接于100mlmrs液体培养基，培养15小时后作为种子液。将处于对数生长期的生长良好的枯草芽孢杆菌、屎肠球菌和地衣芽孢杆菌按照菌活比为1：1：1的配制混合发酵菌种。

4、中草药制剂的制备

实施例1、液体发酵香樟子制剂的制备

(1)液体发酵香樟子制备中草药制剂

香樟子粉碎至40目，占总质量的15％，水占总质量的70％，接种上述3所制备的15％的发酵剂，37℃发酵72小时。

指示菌：副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌等。

(2)发酵液抑菌实验

将发酵液用灭菌后0.22nm的膜过滤除菌，并利用二倍稀释法进行稀释。取指示菌100μl在tcbs固体培养基上涂布，将10μl发酵液及二倍稀释后的发酵液点在涂有指示菌的tcbs培养基上，在37℃培养过夜，观察透明圈情况。

透明圈直径约10mm，香樟子发酵液稀释至四倍对副溶血弧菌，溶藻弧菌，哈维氏弧菌均有抑制作用，空白组对这三种指示菌均只有原液有抑菌活性(图2至图4所示)，发酵所用菌液本身对病原弧菌无抑制作用。本发明中的枯草芽孢杆菌bsx、屎肠球菌ef026和地衣芽孢杆菌bl3c混合液体发酵香樟子最小抑病原弧菌浓度(mic)约为0.0375g/ml。

实施例2、固体发酵香樟子制剂的制备

(1)固体发酵香樟子制备中草药制剂。

香樟子粉碎至40目，占总质量的15％，麸皮占总质量的20％，玉米粉占总质量的10％，豆粕占总质量的9％，硫酸铵占总质量的0.7％，磷酸二氢钾占总质量的0.25％，硫酸镁占总质量的0.05％，水占总质量的30％，接种15％的上述3所制备的发酵剂，30℃发酵72小时。指示菌同实施例1所示。

(2)发酵后抑菌实验

取发酵后中草药制剂1g，用9ml无菌水充分溶解，用灭菌后0.22nm的膜过滤除菌，并用二倍稀释法进行稀释。取指示菌100μl在tcbs固体培养基上涂布，将10μl发酵液及二倍稀释后的发酵液点在涂有指示菌的tcbs培养基上，在37℃培养过夜，观察透明圈情况。

透明圈直径约8mm，香樟子固体发酵后稀释至四倍对副溶血弧菌有抑制作用，稀释至二倍对哈维氏弧菌有抑制作用，原液对溶藻弧菌有抑制作用，空白组只有原液有抑菌活性(图2至图4所示)。

实施例3、液体发酵灵丹草制剂的制备

(1)液体发酵灵丹草制备中草药制剂

灵丹草粉碎至30目，占总质量的10％，水占总质量的75％，接种3所制备的15％混合发酵剂，37℃发酵72小时。指示菌同实施例1所示。

(2)发酵液抑菌实验

方法同实施例1所示。透明圈直径约10mm，灵丹草制剂对副溶血有抑菌作用，稀释二倍后对哈维氏弧菌和溶藻弧菌仍有抑制作用，空白组原液无抑病原弧菌活性(图2至图4所示)。液体发酵灵丹草最小抑病原弧菌浓度(mic)约为0.05g/ml。

实施例4、固体发酵灵丹草制剂的制备

(1)固体发酵灵丹草制备中草药制剂

灵丹草粉碎至30目，占总质量的14％，麸皮占总质量的20％，玉米粉占总质量的10％，豆粕占总质量的10％，硫酸铵占总质量的0.7％，磷酸二氢钾占总质量的0.25％，硫酸镁占总质量的0.05％，水占总质量的30％，接种15％的上述3所制备的发酵剂，30℃发酵72小时。指示菌同实施例1所示。

(2)发酵后抑菌实验

方法同实施例2所示。透明圈直径约8mm，灵丹草固体发酵后对副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌有抑制作用，空白组无抑菌活性(图2至图4所示)。灵丹草固体发酵最小抑病原弧菌浓度(mic)约为0.1g/ml。

4、液体香樟子发酵制剂和灵丹草发酵制剂分别对南美白对虾病原弧菌数量、生长指标的影响(1)实验室养殖条件

实验水体0.1m³，放养南美白对虾p6期幼体300尾，ph值7.8，光照强度5×100lx，盐度25‰。每组每次投喂饲料0.6g，每天投喂四次，投喂时间分别为8：00，11：00，16：00，22：00。实验共分三组，分别为对照组、两个实验组分别为香樟子组和灵丹草组，每组三个重复。对照组每次投喂饲料0.6g；香樟子组投喂添加浓度为150mg/ml实施例1的香樟子发酵液的饲料；灵丹草组投喂添加浓度为100mg/ml实施例3的灵丹草发酵液的饲料，连续一个月。

(2)病原弧菌的测定

每隔一天，取养殖水样按10倍、100倍用灭菌海水稀释，然后取0.1ml涂布tcbs平板，每平板3个平行，30℃培养24小时，计数。

(3)南美白对虾的生长指标的测定

养殖20天后，测定南美白对虾的生长指标，成活率与体重增长率按如下公式计算：

成活率(％)＝收获时存活数目×100/初始放养数目

体重增长率(％)＝(收获时50尾对虾的体重-初始放养时50尾对虾的体重)×100/初始放养时50尾对虾的体重

(4)香樟子液体发酵制剂对水体中病原弧菌数量的影响

添加香樟子发酵制剂8天后直到实验结束，实验组的病原弧菌数量均比对照组低。三个重复饲喂20天后，病原弧菌平均值分别比对照组降低了52.56％、43.40％、48.70％。

(5)香樟子液体发酵制剂对南美白对虾生长指标的影响

1、成活率

一定浓度的香樟子发酵制剂对南美白对虾成活率影响显著(p<0.05)；当投放10天时，成活率最高，达到95.30％，比对照组增加了18.13％。

2、体重增长率

当投放10天时，体重增长率最高，达到1340.16％，比对照组增加了50.19％，显著高于其它各组(p<0.05)。duncan多重比较结果表明，体重增长率最高时香樟子发酵制剂的使用量为0.15～1.5g/ml。

(6)灵丹草发酵制剂对水体中病原弧菌数量的影响

添加灵丹草发酵制剂8天后直到实验结束，实验组的病原弧菌数量均比对照组低。三个重复饲喂20天后，病原弧菌平均值分别比对照组降低了41.45％、41.38％、45.52％。

(7)灵丹草液体发酵制剂对南美白对虾生长指标的影响

1、成活率

一定浓度的灵丹草发酵制剂对南美白对虾成活率影响显著(p<0.05)；当投放10天时，成活率最高，达到91.0％，比对照组增加了10.65％。

2、体重增长率

当投放10天时，体重增长率最高，达到1096.64％，比对照组增加了36.50％。duncan多重比较结果表明，体重增长率最高时灵丹草发酵制剂的使用量为0.1～1g/ml。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>青岛海洋生物医药研究院

青岛百奥安泰生物科技有限公司

大理金明动物药业有限公司

<120>益生菌、发酵剂及在中草药制剂中的应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1360

<212>dna

<213>枯草芽孢杆菌bsx(bacillussubtilis)

<400>1

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<213>屎肠球菌ef026(enterococcusfaecium)

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<212>dna

<213>地衣芽孢杆菌bl3c(bacilluslicheniformis)

<400>3

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