一种重组酵母菌株及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组酵母菌株及其应用。

背景技术：

酿酒酵母作为公认安全微生物(gras)，在工业生产中已得到广泛的应用。作为模式真核系统，酿酒酵母拥有众多基因操作工具，代谢工程改造方便快捷；并且酿酒酵母对严苛的工业生产条件表现出高度的耐受性。所以，酿酒酵母常常是进行生物合成的首选宿主。在进行代谢工程改造时，多是通过静态控制系统过表达代谢途径中的关键酶。静态控制系统不仅会造成代谢流量过早地进入目标代谢途径，影响微生物细胞生长；还会造成代谢网络的不平衡，并且重要代谢产物会随着细胞生长状态的不同而产生变化，这就需要动态调控网络来提升细胞的生产性能。

目前半乳糖诱导调控元件是酿酒酵母代谢途径构建过程中经常使用，并行之有效的系统，但这个系统需要半乳糖诱导，并且该诱导剂在发酵过程中会被消耗，需要及时补加，且价格比较昂贵，因此这种策略在工业生产中并不经济。为了解决这一问题，申请号为cn201610321188.9的中国专利通过敲除gal80，使该启动子不需要半乳糖诱导，并且仅受高葡萄糖抑制，低葡萄糖诱导，这就可以利用葡萄糖浓度对代谢途径进行控制。但是，利用葡萄糖进行代谢途径的表达调控在实际操作中并不方便，常常会出现泄漏表达，而且工业生产中工艺复杂，基因表达很难实现人为的控制。而申请号为cn201711403958.5的中国专利通过蛋白工程手段对gal4进行改造，使它变成一种不借助于诱导剂，而是通过感知温度培养因子的变化来实现对代谢途径的调控。但这种方法需要精准的温度控制，并且需要低温，在实际生产中会增加能耗，产生额外的生产成本。所以，开发自调控体系，使其不受坏境条件调控，只对生长状态产生响应，对平衡细胞生长和产物积累具有重要的意义，对实际生产也有具有巨大的经济价值。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种重组酵母菌，所述的重组酵母菌表达番茄红素合成基因crte、crtb和crti，所述的crte、crtb和crti基因均置于生长偶联动态调控元件hsp26启动子之下，并以串联的形式整合于酿酒酵母基因组上，所述的crte基因的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述的crtb基因的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述的crti基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。

所述的crte、crtb和crti基因来源于戈壁奇球菌(deinococcusgobiensis)，经密码子优化后全基因合成，利用crispr/cas9系统整合于酿酒酵母基因组。

优选，所述的重组酵母菌过表达限速步骤动态调控hmgr基因，所述的hmgr基因的核苷酸序列如seqidno.4所示，所述的hmgr基因置于生长偶联动态调控元件cit1启动子之下，其效果优于置于hsp26启动子或hsp104启动子之下。

优选，所述的重组酵母菌中酿酒酵母基因组的竞争性代谢途径erg9启动子被生长偶联动态调控元件pdc1启动子替换。

优选，所述的重组酵母菌中酿酒酵母基因组的的hmg1基因启动子及其调控区域被生长偶联动态调控元件cit1启动子替换。

优选，所述的重组酵母菌中酿酒酵母基因组的ald6基因被敲除。

本发明的第二个目的是提供上述的重组酵母菌在类胡萝卜素合成中的应用。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

(1)本发明构建的番茄红素合成基因以串联的形式整合于基因组上，相较于分散表达拥有更高的表达活性。

(2)本发明采用的生长偶联调控元件在关键基因(合成基因、限速步骤、竞争性途径)的调控中发挥着重要作用，既保证了必要的高表达，又防止代谢途径过早的进入目标代谢途径；在保证生长必需的同时使更多代谢流进入目标代谢途径。

(3)本发明利用生长偶联调控元件在酿酒酵母中构建动态调控系统，该调控系统只对细胞生长状态产生响应，只有达到对数期后期，基因才进入表达高峰期，并持续稳定表达，不需要诱导剂，不需要进行参数调节(如葡萄糖浓度、温度等)，操作简便，易于控制，不会增加额外成本。

附图说明

图1为基因编辑系统phcas9m-grna质粒图谱；

图2为不同整合方式的生长偶联菌株(bd03、bx03、bl03)表达番茄红素的含量及构建的菌株示意图，其中a为bd03、bx03、bl03菌株表达番茄红素的含量，b为构建的bd03、bx03、bl03菌株示意图。

图3为不同整合方式的生长偶联菌株(bd03、bx03、bl03)的crte、crtb和crti基因转录量，其中a为bd03、bx03、bl03菌株的crtb基因转录量；b为bd03、bx03、bl03菌株的crti基因转录量；c为bd03、bx03、bl03菌株的crte基因转录量。

图4为bl03菌株在不同限速步骤调控模式(hsp26p-ohmgr、hsp104p-ohmgr、cit1p-ohmgr)下表达番茄红素的含量和ohmgr基因转录量，其中a为bl03菌株在不同限速步骤调控模式下表达番茄红素的含量，b为bl03菌株在不同限速步骤调控模式下的ohmgr基因转录量。

图5为bl03菌株在ald6基因敲除、ypl062w基因敲除、ald6基因和ypl062w基因同时敲除这三种情况下表达番茄红素的含量。

图6为bl03菌株的erg9启动子被pdc1启动子替换，或hmg1基因启动子及其调控区域被cit1启动子替换后表达番茄红素的含量。

图7为bl03菌株的erg9启动子被pdc1启动子替换后的erg9基因转录量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。除非特别说明，下面实施例中所用的技术均为本领域内的技术人员已知的常规技术，所使用的仪器设备和试剂等，均为本领域内的技术人员可以通过公共途径如商购等获得的。

实施例1基因编辑系统的构建

为了方便酿酒酵母的基因操作，本发明首先基于phcas9-nours质粒(molecularcloudcat.no.:mc_0000293)和pyes2-grna-hyg-mcs质粒(molecularcloudcat.no.:mc_0000294)，构建了phcas9m-grna质粒(cat.no.:mc_0000739)。该质粒含有hcas9模块，grna表达模块，和g418模块，具体的，以引物hcas920170518-f/hcas920170518-r扩增得到hcas9片段，以引物g41820170518-f/g41820170518-r扩增得到g418片段，以引物2μ20170518-f/2μ20170518-r扩增得到2μ片段，以引物amp20170518-f/amp20170518-r扩增得到amp片段，然后将以上片段使用重组试剂盒(clonexpressmultisonestepcloningkit)，进行连接构建phcas9m-grna质粒，所述的phcas9m-grna质粒如图1所示。利用phcas9m-grna质粒在进行基因操作时，不同位点只需将引导序列设计在引物中，方便快捷，转化后在400μg/mlg418ypd平板上进行筛选，获得阳性克隆后，经几次划线丢失质粒后，进行下一轮的操作，具体的，使用引物对phcas9-grna-up-f/phcas9-grna-up-r和phcas9-grna-down-f/phcas9-grna-down-r将构建的phcas9m-grna质粒分成两部分，使用引物对phcas9-grna-up-f/phcas9-grna-up-r扩增含hcas9部分，使用引物对phcas9-grna-down-f/phcas9-grna-down-r扩增含grna部分，将引导序列(n20)设计在引物上，使用重组试剂盒将含hcas9部分和含grna部分连接，构建含不同引导序列的phcas9m-grna。

构建质粒使用引物为下表所示：

实施例2生长偶联动态调控菌株的构建

根据戈壁奇球菌基因组数据，经密码子优化后全基因合成番茄红素合成基因crte、crtb和crti。所述的基因crte的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述的crtb的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述的基因crti的核苷酸序列如seqidno.3所示。为了获得较好的表达形式，本发明进行了3种菌株的构建。1)将crte、crtb和crti基因置于hsp26启动子之下，分别整合于酿酒酵母基因组208a、720a和308a位点，构建菌株bd03。2)将crti、crtb和crti基因分别置于hsp26、hsp104和hsp82启动子之下，以串联的形式整合于酿酒酵母基因组yprct3位点，构建菌株bx03。3)将crtb、crti和crte基因置于hsp26启动子之下，以串联形式整合于酿酒酵母基因组gal80位点，构建菌株bl03。

具体的，菌株bd03的构建步骤为：以实施例1构建的phcas9m-grna质粒为模板(后面实施例同)，分别使用引物phcas9-grna-down-720a-fb/phcas9-grna-down-r、phcas9-grna-down-308a-fi/phcas9-grna-down-r、phcas9-grna-down-208a-fe/phcas9-grna-down-r构建720a，308a，208a位点的基因组整合质粒；crte、crtb、crti，hmgr基因以全基因合成的基因为模板，启动子、终止子、酿酒酵母基因都以酿酒酵母基因组为模板(后面实施例同)，使用引物hsp26p-crte-cyc1t-f-2/hsp26p-crte-cyc1t-r-2、hsp26p-crte-cyc1t-f/hsp26p-crte-cyc1t-r扩增hsp26p-crte-cyc1t片段；使用引物hsp26p-crti-gpm1t-f-2/hsp26p-crti-gpm1t-r-2、hsp26p-crti-gpm1t-f/hsp26p-crti-gpm1t-r扩增hsp26p-crti-gpm1t片段；使用引物hsp26p-crtb-adh1t-f-2/hsp26p-crtb-adh1t-r-2、hsp26p-crtb-adh1t-f/hsp26p-crtb-adh1t-r扩增hsp26p-crtb-adh1t片段；使用引物208acheck-f/208acheck-r、308acheck-f/308acheck-r、720acheck-f/720acheck-r分别对208a位点、308a位点、720a位点进行鉴定。

菌株bd03的构建所用引物如下：

菌株bx03的构建步骤为：

使用引物phcas9-grna-down-yprct3-f/phcas9-grna-down-r构建yprct3位点的基因组整合质粒；使用引物hsp26p-crti-t1108-f-2/hsp26p-crti-t1108-r、hsp26p-crti-t1108-f/hsp26p-crti-t1108-r扩增hsp26p-crti-t片段；使用引物hsp104p-1108-f-2/hsp104p-1108-r、hsp104p-1108-f/hsp104p-1108-r、crtb-1108-f/crtb-1108-r扩增hsp104p-crtb-t片段；使用引物hsp82p-1108-f-2/hsp82p-1108-r、hsp82p-1108-f/hsp82p-1108-r、crte-1108-f/crte-1108-r、crte-1108-f/crte-1108-r-2、crte-1108-f/crte-1108-r-3、crte-1108-f/crte-1108-r-4扩增hsp82p-crte-t片段，由于是一次整合完整的番茄红素合成代谢途径，整合完成，正确的菌株就会变成红色。

菌株bx03的构建所用引物如下：

菌株bl03的构建步骤为：

使用引物phcas9-grna-down-gal80-f/phcas9-grna-down-r构建gal80位点的基因组整合质粒；使用引物gal80up1205-f/gal80up1205-r扩增gal80上游同源臂；使用引物hsp26p0708-f/hsp26p0708-r、crtb-0708-f/crtb-0708-r、adh1t-0708-f/adh1t-0708-r扩增hsp26p-crtb-adh1t片段；使用引物hsp26p-i0708-f/hsp26p0708-r、crti-0708-f/crti-0708-r、gpm1t0708-f/gpm1t0708-r、hsp26p-i0708-f/gpm1t0708-r扩增hsp26p-crti-gpm1t片段；使用同源臂引物hsp26p-e0708-f/hsp26p0708-r、crte-0708-f/crte-0708-r、cyc1t-0708-f/cyc1t-0708-r、hsp26p-e0708-f/cyc1t-0708-r扩增hsp26p-crte-cyc1t片段；使用引物gal80down1205-f/gal80down1205-r扩增gal80下游同源臂，整合完成，正确的菌株就会变成红色。

菌株bl03的构建所用引物如下：

按标准的番茄红素测定方法，对上述构建的bd03、bx03、bl03菌株表达番茄红素的含量进行测定。各菌株番茄红素的产量及构建的菌株示意图见图2所示。图2a为bd03、bx03、bl03菌株表达番茄红素的含量测定结果，由图2a可知，bl03菌株表达番茄红素的含量最高，优于bd03和bx03菌株。图2b为构建的bd03、bx03、bl03菌株示意图。

分别对bd03、bx03、bl03菌株中crti、crtb和crte基因进行荧光定量pcr，测定菌株中各基因的转录量，其中荧光定量pcr的引物如下所示，pcr的反应体系为：chamquniversalsybrqpcrmastermix10μl，正向引物和反向引物各0.4μl，templatecdna1μl，水补加至20μl；两步法反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性10s、60℃退火、延伸30s，以上循环40次，溶解曲线：95℃15s；95℃60s、60℃15s。各菌株中crti、crtb和crte基因的转录量结果见图3所示。图3a为bd03、bx03、bl03菌株的crtb基因的转录量，图3b为bd03、bx03、bl03菌株的crti基因的转录量，图3c为bd03、bx03、bl03菌株的crte基因的转录量。

crti、crtb和crte基因荧光定量pcr引物为：

实施例3限速步骤的动态调控

酿酒酵母的hmg1基因被认为是整个mva途径的限速步骤，因为hmg1基因前面有一段跨膜区域，受到严格的代谢调控。为了克服这一问题，本发明过表达来源于粘细菌的hmgr，和hmg1具有同样的功能，但其没有调控区域。经密码子优化全基因合成hmgr(ohmgr)，所述的hmgr基因的核苷酸序列如seqidno.4所示。为了获得较好的调控模式，本发明选择cit1、hsp26和hsp104三个启动子进行筛选，发现cit1启动子效果最好，可以达到hsp104启动子的2倍，并对它们的转录特性进行了测定。

具体的，以实施例2构建的bl03菌株为基础，使用引物phcas9-grna-down-416d-f/phcas9-grna-down-r构建416d位点的基因组整合质粒；使用引物cit1p180109-f/cit1p180109-r、ohmgr180118-f/ohmgr180118-r分别扩增cit1和ohmgr，重叠pcr连接构建模块，最后以cit1p180109-f-2/ohmgr180118-r-2引物扩增添加同源臂，获得cit1p-ohmgr-t片段；使用引物hsp104p-0126f/hsp104p-0126r、ohmgr180326-f/ohmgr180118-r扩增hsp104p-ohmgr-t片段；使用引物hsp26p0329-f/hsp26p0329-r、ohmgr180329-f/ohmgr180118-r扩增hsp26p-ohmgr-t片段。使用引物416dcheck-f/416dcheck-r对416d位点进行鉴定。

所用引物如下：

按标准的番茄红素测定方法，对上述bl03菌株在不同限速步骤调控模式(hsp26p-ohmgr、hsp104p-ohmgr、cit1p-ohmgr)下表达番茄红素的含量进行测定，并测定在不同限速步骤调控模式下ohmgr基因转录量，结果见图4所示。图4a为bl03菌株在不同限速步骤调控模式下表达番茄红素的含量，图4b为bl03菌株在不同限速步骤调控模式下的ohmgr基因转录量。由图4a可知，限速步骤动态调控hger基因置于生长偶联动态调控元件cit1启动子之下，其促进bl03菌株表达番茄红素的效果优于置于hsp26启动子或hsp104启动子之下。由图4b可知，cit1启动子可减少hmgr(ohmgr)基因转录量，效果优于hsp26启动子或hsp104启动子。

以实施例2构建的bl03菌株为基础，过表达限速步骤动态调控hmgr基因，并将所述的hmgr基因置于生长偶联动态调控元件cit1启动子之下，获得bl03，cit1-ohmgr菌株。

实施例4ald6基因的敲除

ald6基因是负责乙酸合成的基因，其敲除会导致乙酸含量的减少，对萜类物质合成有益。有文献报道ypl062w基因敲除会促进类胡萝卜素的合成，常常被用于类胡萝卜素合成的代谢工程改造。本发明比较了两种基因的不同敲除方式，发现ypl062w的敲除会导致细胞生长缺陷，相比之下敲除ald6效果是最好的。

具体的，使用引物phcas9-grna-down-ald6-f/phcas9-grna-down-r构建ald6位点的grna质粒；将ald6敲除引物(ald6-delete1115)和ald6位点的grna质粒一起转入bl03，cit1-ohmgr菌株即可完成ald6基因敲除。使用引物phcas9-grna-down-ypl062w-f/phcas9-grna-down-r构建ypl062w位点的grna质粒；使用引物ypl062w+ald6-up-f/ypl062w+ald6-up-r扩增ypl062w+ald6上游同源臂，使用引物ypl062w+ald6-down-f/ypl062w+ald6-down-r扩增ypl062w+ald6下游同源臂，重叠pcr将上、下游同源臂连接构建ypl062w+ald6同时敲除模块，ypl062w+ald6同时敲除片段与ald6位点的grna质粒、ypl062w位点的grna质粒一同导入bl03，cit1-ohmgr菌株，即可完成ypl062w+ald6基因同时敲除。使用ypl062w-down-f/ypl062w-down-r扩增ypl062w下游同源臂，重叠pcr将其与ypl062w+ald6上游同源臂构建ypl062w敲除模块，将ypl062w敲除模块与ypl062w位点的grna质粒一同导入bl03，cit1-ohmgr菌株，即可完成ypl062w基因敲除。使用ald6敲除鉴定引物ald6-delete-check-f/ald6-delete-check-r、ypl062w+ald6敲除鉴定引物ypl062w+ald6-delete-check-f/ypl062w+ald6-delete-check-r、ypl062w敲除鉴定引物ypl062w-delete-check-f/ypl062w-delete-check-r分别对ald6基因敲除、ypl062w+ald6基因敲除、ypl062w基因敲除进行鉴定。

所用引物如下：

按标准的番茄红素测定方法，对上述bl03，cit1-ohmgr菌株在ald6敲除、ypl062w+ald6敲除、ypl062w敲除三种情况下表达番茄红素的含量进行测定，结果见图5。由图5可知，敲除ald6可促进bl03,cit1-ohmgr菌株表达番茄红素，其效果优于单独敲除ypl062w(ypl062w基因)以及同时敲除ypl062w+ald6(ypl062w基因和ald6基因)。

以实施例3获得bl03，cit1-ohmgr菌株为基础，敲除ald6基因，获得bl03，cit1-ohmgr，δald6菌株。

实施例5竞争性代谢途径的动态调控

erg9基因是催化角鲨烯合成的关键基因，与mva途径竞争fpp，但由于其是脂肪酸合成的必需基因，对细胞生长至关重要。erg9基因敲除会导致细胞死亡，而其降低表达，会导致菌株生长缓慢，本发明提供一种方法，利用动态下调元件pdc1控制erg9基因，使其在对数期处于较高表达，满足细胞生长，进入稳定期，转录处于低表达，使代谢流更多进入mva途径。

具体的，使用引物phcas9-grna-down-hmg1-f/phcas9-grna-down–r构建hmg1位点的grna质粒。使用引物cit1p180629-f-2/cit1p180629-r-2、cit1p180629-f/cit1p180629-r扩增带有同源臂的cit1p启动子，将带有同源臂的cit1p启动子和hmg1位点的grna质粒一同导入bl03,cit1-ohmgr,δald6菌株即可完成hmg1→cit1p启动子替换。使用引物phcas9-grna-down-egr9-f/phcas9-grna-down–r构建egr9位点的grna质粒。使用引物pdc1p-f-2/pdc1p-r-2、pdc1p-f/pdc1p-r扩增带有同源臂的pdc1p启动子，将带有同源臂的pdc1p启动子和egr9位点的grna质粒一同导入bl03,cit1-ohmgr,δald6菌株即可完成egr9→pdc1p启动子替换。使用引物cit1pcheck-f/cit1pcheck-f对hmg1位点进行鉴定，使用引物pdc1pcheck-f/pdc1pcheck-r对egr9位点进行鉴定。

所用引物如下：

按标准的番茄红素测定方法，对上述bl03,cit1-ohmgr,δald6菌株在hmg1→cit1p启动子替换、egr9→pdc1p启动子替换两种情况下表达番茄红素的含量进行测定，结果见图6。由图6可知，hmg1启动子被cit1p启动子替换，以及egr9启动子被pdc1p启动子替换均可促进bl03,cit1-ohmgr,δald6菌株表达番茄红素。

同时测定egr9启动子被pdc1p启动子替换后bl03,cit1-ohmgr,δald6,egr9→pdc1p菌株的erg9基因转录量，结果见图7。由图7可知，egr9启动子被pdc1p启动子替换后，bl03,cit1-ohmgr,δald6,egr9→pdc1p菌株的erg9基因转录量明显呈现先高表达，后进入低表达的趋势。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)

<120>一种重组酵母菌株及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>990

<212>dna

<213>基因(crte)

<400>1

atgcgtccggaactgctggaacgtgttctgtctctgctgccggaagctggtccgcacccg60

gaactggctcgtttctacgaaatgctgcgtgactacccgcgtcgtggtggtaaaggtctg120

cgttctgaactgctgctggctggtgctcgtgcttacggtgttcgtgaaggtaccccgcag180

tgggaatctgctctgtggctggctgctggtgttgaactgttccagaactgggttctgatc240

cacgacgacatcgaagacgactctgaagaacgtcgtggtcgtccggctctgcaccgtctg300

cacggtgttgctctggctatcaacgctggtgacgctctgcacgcttacatgtgggctgct360

gttgctcgtgctggtgttccgggtgctcacgaagaattcctggctatggttcaccgtacc420

gctgaaggtcagcacctggacctggcttgggttgctggtcgtgaatggggtctgaccgaa480

cacgactacctgcagatggttggtctgaaaaccgcttactacaccgttatcgttccgctg540

cgtctgggtgctctggttgctggtgctcagccgccggaaaccctgaccccggctggtctg600

gctctgggtaccgctttccagatccgtgacgacgttctgaacctggctggtgacgctgct660

aaatacggtaaagaaatcgctggtgacctgctggaaggtaaacgtaccctgatcgttctg720

cactggctgggtcaggctccggaagaccagatcgctgttttcctggaccagatgcgtcgt780

gaacgtccggacaaagacccggaagttgttgctcagatccacggttggctgctggaatct840

ggttctgttgactacgctcagcgtgctgctcaggctcaggctgaaaccggtctgaaactg900

ctgggtgacgttctgggtgctgctccggaacgtgaagctgctcgtgctctgctgggtcgt960

gttcgtgaactggctacccgtgaagcttaa990

<210>2

<211>900

<212>dna

<213>基因(crtb)

<400>2

atgaccgactgcgctccgccggctccgtcttctaccgttgacccgggtctgaaccgtgct60

ctgcgtcactgccaggctgttacccgtgaacactctaaaaccttctacctgggttctcgt120

tgcttcccgggtcgtcagcgtgctgctgtttgggctgtttacgctgcttgccgtgaaggt180

gacgacatcgctgacggtggtggtccggacgttgacgctcgtctgggtgactggtggtct240

cgtgttcagggtgctttcgctggtcgtccgggtgaacacccgaccgaccgtgctctggct300

tgggctgctcgtgaatacccgatcccgctgggtgctttcgctgaactgcacgaaggtctg360

cgtatggacctgcgtggtcacaactacgcttctatggacgacctgaccctgtactgccgt420

cgtgttgctggtgttgttggtttcatgatcgctccgatctctggttacgaaggtggtgaa480

gctaccctggacaaagctctgcgtctgggtcaggctatgcagctgaccaacatcctgcgt540

gacgttggtgaagacctgtctctgggtcgtgtttacctgccggctgaagttctggaccgt600

tacggtctgtgccgtgctgacctggaacgtggtgttgttaccccggaatactgcgctatg660

ctgcgtgacctgaccgctcaggctcgtgcttggtacgctgaaggtcgtgctggtatcccg720

ctgctgcgtggtcgtgctcgtctggctgttgctaccgctgctcgtgcttacgaaggtatc780

ctggacgacctggaagctgctggttacgacaacttcaaccgtcgtgcttacgtttctggt840

cgtcgtaaactgatgatgctgccgcaggcttggtgggaactgcgttctttctctgcttaa900

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