一种提取谷子种子总RNA的方法与流程

本发明涉及生物化学技术领域，具体涉及一种提取谷子种子总rna的方法。

背景技术：

谷子是中国北方的一种小杂粮，谷粒的营养价值很高，含丰富的蛋白质、脂肪和维生素，随着人们生活方式的变化，市场上对谷子的需求不断增加，种子活力的保持和萌发成苗决定着植物种类的繁衍和和生存能力以及生态系统的建成，更直接影响作物的产量。由于种子萌发，特别是小粒种子（如谷子）的萌发更容易受到环境胁迫、机械伤害和病虫害的影响，种子萌发被认为是植物生活周期中最重要和最脆弱的阶段，因此研究种子萌发的分子机制有助于提高作物的产量，具有重要的经济和生态意义。

从植物种子中提取纯度高、完整性好的rna是进行基因动态表达、cdna合成、rna序列分析、基因克隆、构建cdna文库、体外翻译等分子生物学试验的前提。但谷子中含有较多的蛋白质、多糖和脂质，这些物质会干扰或降解rna，从而影响rna的产量和质量。多糖表现出与rna相似的物理化学性质，并与rna提取物共沉淀和污染。蛋白质和脂类也会干扰rna分离提取，干扰rt-pcr，从而影响基因表达研究。目前常用的谷子rna提取法主要为rnaisoplus法和ctab法，rnaisoplus法中提取的rna中含有蛋白质或苯酚，ctab法提取的rna有轻微的降解或是有高盐等杂质的污染，二者均影响rna的质量和浓度，提取的rna质量差，而且步骤繁琐。

技术实现要素：

针对上述情况，本发明的目的是提供一种提取谷子种子总rna的方法，提高了rna的质量和浓度，减少了蛋白质和盐离子污染，解决了谷子rna提取质量差的问题。

本发明的一种提取谷子种子总rna的方法，包括以下步骤；

（1）将0.1g液氮研磨的谷子种子细粉中加入0.7ml的rna提取缓冲液，所述提取缓冲液为tris-hcl、pvp、β-巯基乙醇依次加入水配制而成，上述组分的体积比为：1mtris-hcl：10%w/vpvp：β-巯基乙醇：水=5：5：1：39，混匀静置15min，12000g，4℃离心10min；

（2）取上清加1ml的rnaisoplus，混匀室温静置10min，12000g，4℃离心5min；

（3）取上清再加入步骤2中rnaisoplus1/5体积的氯仿并混合均匀，室温静置5min，12000g，4℃离心15min；

（4）取上层液转移至另一新离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀后在室温静置10min，12000g，4℃离心10min；

（5）弃上清，加1ml75％乙醇洗涤沉淀后室温干燥，加入30μlrnase-free水溶解，得到rna提取液，-80℃保存。

进一步的，所述步骤1的液氮研磨的谷子种子为成熟饱满的谷子种子。

进一步的，所述步骤1的tris-hcl选用ph9.0的tris-hcl。

本方法所述rna提取缓冲液中的tris-hcl做为溶解核酸将谷子种子成分溶解后，通过pvp较强的结合酚类化合物的能力，与多酚形成稳定的复合物，将酚从核酸中游离，pvp和β-巯基乙醇结合进一步防止酚类化合物氧化，有效的降低了酚类物质的影响，同时β-巯基乙醇促进核蛋白复合体的解离，将rna释放到溶液中，且pvp和β-巯基乙醇作为还原剂一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。

本实验方法操作简单、时间短、重复性好，提取的谷子种子总rna纯度好、质量高，od260/od280均在1.8以上，没有明显的降解现象，也没有其他杂质如蛋白、盐离子的污染，符合建cdna文库和转录组测序等后续实验。

说明书附图

图1为不同提取方法的总rna凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例，将同一批次的谷子种子，选取晋谷42和晋谷45分别用三种不同方法提取rna，将结果进行对比，对本发明的技术方案进行详细描述：

实施例1

采用本发明的方法提取rna，具体操作如下：

（1）配制rna提取缓冲液成分：所述提取缓冲液为tris-hcl、pvp、β-巯基乙醇依次加入水配制而成，上述组分的体积比为：1mtris-hcl：10%pvp：β-巯基乙醇：水=5：5：1：39，所述tris-hcl选用ph9.0的tris-hcl；

配制方法以配100ml提取缓冲液为例：取ph9.0的tris-hcl10ml，加入10ml10％w/vpvp，2mlβ-巯基乙醇，再加入78ml水；

（2）取成熟饱满的谷子种子在液氮中进行研磨，研磨成细粉，每0.1g谷子种子细粉加0.7ml的上述rna提取缓冲液，混匀静置15min，12000g4℃离心10min；

（3）取上清加1ml的rnaisoplus，混匀室温静置10min，12000g，4℃离心5min；

（4）取上清再加入0.2ml氯仿并混合均匀，室温静置5min，12000g，4℃离心15min；

（5）取上层液转移至另一新离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀后在室温静置10min，12000g，4℃离心10min；

（6）弃上清，加1ml75％乙醇洗涤沉淀后室温干燥，加入30μlrnase-free水溶解，得到rna提取液，-80℃保存。

对比实施例2

rnaisoplus法提取谷子种子总rna，包括以下操作：

（1）每0.1g液氮研磨的材料加1ml的rnaisoplus，混匀室温静置5min，12000g，4℃离心5min；

（2）取上清至新管中再加入0.2ml氯仿并混合均匀，室温静置5min，12000g,4℃离心15min；

（3）取上层液转移至另一新离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀后在室温静置10min，12000g,4℃离心10min；

（4）弃上清，加1ml75％乙醇洗涤沉淀后室温干燥，加入30μlrnase-free水溶解，-80℃保存。

对比实施例3

ctab法提取谷子种子总rna，包括以下操作：

（1）每0.1g液氮研磨的材料加1ml的ctab提取液(65℃提前预热)，65℃下保温10min。每3min上下颠倒一次；

（2）冷却样品到室温，加入200μlv氯仿:v异戊醇=24:1，混匀，12000g，4℃离心10min；

（3）吸取水相到另一个新管中，加入1/4体积的10mlicl，轻轻混匀，-20℃储存过夜；

（4）12000g，4℃离心20min，弃水相，0.5%sds（m/v）溶解沉淀，加入等体积的v氯仿:v异戊醇=24:1上下颠倒混匀；

（5）静置5min，12000g，4℃离心10min使沉淀充分溶解，将上相吸取到新管中，加入2倍体积的乙醇，置于-20℃，30min，然后12000g，4℃离心10min；

（6）弃上清，加1ml75％乙醇洗涤沉淀后室温干燥，加入30μlrnase-free水溶解，-80℃保存。

下表为本发明方法和现有技术rnaisoplus法、ctab法提取谷子总rna的实验结果：

由表1可知，rnaisoplus法提取的rna的a260/a280低于1.8说明rna中含有蛋白质或苯酚，用ctab法提取的rna的a260/a280都大于2.0说明有轻微的降解或是有高盐等杂质的污染，而本发明的方法的rna没有明显的降解和污染，rna浓度和a260/a280明显优于另外两种方法所提取的rna。

从附图1中可以看出，28s和18s条带的亮度和清晰度明显比另外两种方法高，且28s的亮度大约为18s的两倍，本发明的方法提取的rna纯度更高，质量更好。