一种从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素及应用的制作方法

本发明属于化学化工技术领域，涉及一种小分子毒素及应用，尤其涉及一种从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素及应用。

背景技术：

大腹园蛛(araneusventricosus)是一种以昆虫为食的中型蜘蛛，在分类上隶属于节肢动物门，蛛形纲，蜘蛛目，圆蛛科，圆蛛属。间斑寇蛛是目前世界上分布最广的蜘蛛之一，其毒液中存在大量能麻醉或致死昆虫的毒性成分。探索这些从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素的结构与功能特点，从中筛选出可能用做神经生物学研究工具试剂和药物及杀虫剂的前体分子。目前，针对大腹园蛛毒液的研究很少，日本kawai等人发现大腹园蛛毒囊提取物能抑制龙虾神经肌肉接头兴奋性突触后电位，对抑制性突触后电位没有影响；此外该毒囊提取物能抑制谷氨酸诱导的突触后膜去极化，而对天门冬氨酸诱导的突触后模去极化没有影响。其他未见关于该蜘蛛毒素的研究报道。

迄今为止，在蜘蛛和黄蜂的毒液内发现了一类非蛋白质类小分子毒素，经结构解析，属于乙酰多胺类小分子，它们多数作用于无脊椎动物和脊椎动物的谷氨酸受体、非谷氨酸受体或乙酰胆碱受体，这些分子对受体的抑制浓度在0.01μmol/l到100μmol/l范围中，不同的分子之间差异明显。同时，未见这些乙酰多胺类小分子对昆虫钠离子通道有选择性作用的报道。

技术实现要素：

为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种对昆虫具有选择性活性、受ph影响较小、作用更强以及效果更稳定的从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素及应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素，所述从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素是季铵类小分子毒素。

作为优选，本发明所提供的从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素的相对分子量是757.5112，核磁共振结构解析从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素的分子式是c36h64o5n13。

作为优选，本发明所提供的从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素的结构式为：

如前所述的从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素在杀虫剂或在神经生物学试剂和/或药物中的应用。

如上所述的从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素以阻断或完全阻断昆虫钠离子通道的方式作为杀虫剂时的应用。

从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素完全阻断昆虫钠离子通道时，所述从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素的使用浓度不大于10μmol/l；所述从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素对昆虫钠离子通道的半数有效浓度不大于1μmol/l；从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素对昆虫钠离子通道的半数有效浓度是0.77±0.05μmol/l。

本发明的优点是：

本发明提供了一种从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素及应用，该从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素是季铵类小分子毒素，其相对分子量是757.5112，核磁共振结构解析从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素的分子式是c36h64o5n13。该从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素与已发现的多胺类分子有明显不同，且对昆虫具有选择性活性，在神经生物学研究工具试剂的研发和药物及杀虫剂的开发等方面具有一定的应用前景。本发明所涉及的小分子毒素avtx-757能低剂量快速麻醉昆虫，但是其作用过程是可逆的，比较不可逆的强致死蛋白质类小分子毒素(例如黑寡妇蜘蛛毒素latroinsectotoxin)来说，其致死剂量没有明显的优势。本发明涉及的小分子毒素avtx-757具有更强的昆虫选择性毒性，对昆虫钠通道的半数有效浓度低于1μmol/l。结构上为季铵类分子，受ph影响较小，作用更强，更稳定。本发明涉及的分离纯化技术已经过多次实验使用，证明可行；纯化出的avtx-757的结构与性质分析均用现代生物化学与电生理学等技术重复进行，结果可靠。该小分子毒素对昆虫具有毒性，而对大鼠及小鼠均无明显毒性；能抑制蜚蠊dum神经细胞膜上的电压敏感钠离子通道电流，在神经生物学研究工具试剂的研发和杀虫剂的开发等方面具有一定的应用前景。

附图说明

图1是来自argiopidae属的多胺毒素的结构式；

图2是agelenopsis属及黄蜂philanthustriangulum的多胺毒素的结构式；

图3是本发明所提供的小分子毒素avtx-757的离子交换色谱峰图；

图4是本发明所提供的小分子毒素avtx-757的反相高效液相层析图；

图5是本发明所提供的小分子毒素avtx-757的质谱图；

图6是本发明所提供的小分子毒素avtx-757的核磁共振氢谱图；

图7是本发明所提供的小分子毒素avtx-757的核磁共振碳谱图；

图8是本发明所提供的小分子毒素avtx-757的核磁共振dept谱图；

图9是本发明所提供的小分子毒素avtx-757的核磁共振hsqc谱图；

图10是本发明所提供的小分子毒素avtx-757的h1-h1耦合谱图；

图11是本发明所提供的小分子毒素avtx-757的核磁共振hmbc谱图；

图12是本发明所提供的小分子毒素avtx-757的分子结构式图；

图13是本发明所提供的小分子毒素avtx-757对蜚蠊钠离子通道的阻断作用图；

图14是本发明所提供的小分子毒素avtx-757对大鼠drg钠离子通道的影响图。

具体实施方式

本发明提供了一种从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素，该从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素是从大腹园蛛粗毒中分离纯化得到的季铵类小分子毒素，相对分子量是757.5112，核磁共振结构解析从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素的分子式是c36h64o5n13，其结构式为：

本发明所提供的从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素在杀虫剂或在神经生物学试剂和/或药物中的应用，尤其是以阻断或完全阻断昆虫钠离子通道的方式作为杀虫剂时的应用。当从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素完全阻断昆虫钠离子通道时，从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素的使用浓度不大于10μmol/l；从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素对昆虫钠离子通道的半数有效浓度不大于1μmol/l；从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素对昆虫钠离子通道的半数有效浓度是0.77±0.05μmol/l。

本发明对大腹园蛛毒液中的非蛋白质类小分子毒素开展了系统的研究，建立了分离纯化出单一非蛋白质类小分子毒素的方法。并利用膜片钳技术及动物活体毒性试验，鉴定该类小分子毒素对昆虫及脊椎动物的毒性。利用质谱及核磁共振技术确定该类小分子毒素的分子式，结构式和空间结构。解析出了avtx-757毒素的分子结构。经过数据库和文献调研发现，大部分其他的非蛋白类小分子毒素为酰基多胺类毒素，有来自argiopidae属的argtx-636、argtx-659、jstx-3和nstx-3(结构式如图1所示)，来自agelenopsis属的ag505、ag489、ag468、ag452以及黄蜂philanthustriangulum的phtx-433(结构式如图2所示)。该类毒素主要对哺乳动物的受体有抑制活性。

本发明所提供的从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素的制备方法是将采集到的大腹园蛛粗毒，利用3kda的超滤膜超滤后，收集小分子部分样品；随后采用强阳离子交换柱对小分子部分样品进行分离，得到含有昆虫特异性小分子毒素的离子交换色谱峰，再选择经生物质谱检测出的目标峰进行反相-高效液相层析纯化，得到纯净的毒素分子单体，具体是：

1)avtx-757的纯化

对大腹园蛛粗毒超滤后的小分子部分进行离子交换层析，得到含有avtx-757的离子交换色谱峰(图3)。色谱条件：月旭科技(上海)股份有限公司的c18反相柱xb-scx(10mm×250mm)洗脱液a为ph6.25，20mm磷酸缓冲液；洗脱液b为含1.25mol/l氯化钠的ph6.25，20mm磷酸缓冲液。线性梯度洗脱，流速2.0ml/min，280nm检测。图3中的*号标准的成分被收集后冷冻干燥，即得含avtx-757的组分。

2)反相-高效液相层析：利用月旭科技(上海)股份有限公司的c18反相柱xb-c18(10×250mm)进行样品的脱盐和进一步分离纯化。洗脱液a为含2％乙腈和0.1％三氟乙酸的去离子水；洗脱液b为含2％去离子水和0.1％三氟乙酸的色谱纯乙腈。线性梯度洗脱，流速2.0ml/min，280nm检测。图4中的*号标准的成分被收集后冷冻干燥，即得分离纯化的小分子毒素avtx-757。

制备得到本发明所提及的从大腹园蛛粗毒中分离纯化的小分子毒素后，对其进行纯度以及结构鉴定，具体是：

1)分离后的avtx-757的质谱分析

利用maldi-tof测定纯化毒素蛋白的分子量。如图5所示，avtx-757带1个正电荷，根据电荷数和荷质比可以计算出该小分子毒素的分子量为757.5112。同时可以看出，纯化后的avtx-757杂质含量极低，为高纯品。

2)avtx-757的核磁共振分析及结构解析

①avtx-757的氢谱和碳谱分析：利用布鲁克vns-600核磁共振仪上进行了氢谱和碳谱分析(结果请参见图6以及图7)。500和600mhz用来进行1hnmr分析，125和150mhz用来进行13cnmr分析。化学位移(δ)单位为ppm，耦合常数单位为赫兹(hz)。

②二维核磁共振谱采集及谱图分析：所有的二维谱图在相敏感模式下采用时间相递增法加标准脉冲排序和相循坏的方法采集。溶剂峰抑制采用预饱和的方法获得。二维核磁共振谱在室温下记录，包括cosy谱，利用37和73ms的混合时间，cosy的记录数据点为t1和t2是512和2048。利用软件xwinnmr(bruker)进行被操作和观察。所有的数据被零填充去产生2k和4k实际基质的cosy.傅里叶转换前，采用具有一个1/2的相漂移的正弦波或正弦波平方窗口功能。

根据hresimsm/z758.5129[m]⁺calcdfor758.5129，c36h64o5n13确定该化合物化学式是：c36h64o5n13，其¹³c-nmr(图7)和dept(图8)谱显示有33个碳信号，包括3个甲基碳信号(δc40.2，40.2，20.4)，14个亚甲基碳(δc56.5，55.1，54.6，41.7，41.7，37.5，36.6，31.4，29.7，25.5，25.5，25.5，25.4，22.2)，9个次甲基碳(δc125.1，122.5，119.9，119.9，112.4，73.3，67.9，60.1，54.1)，7个季碳(δc177.3，173.7，170.5，158.7，137.8，129.2，111.3)，通过¹h-nmr(图6)，¹³c-nmr(图7)，dept(图8)，¹h-¹hcosy(图10)，hmbc(图11)和hsqc(图9)波谱数据对所有的h和c进行了归属。(注：119.9是2个碳，41.7是2个碳，40.2是2个碳，25.5-25.4是4个碳)。

¹h-nmr谱中存在一组吲哚基团的信号7.64，7.03，7.12，7.37和7.23ppm，并且在hmbc谱中，h-3(δ7.64)与c-1(δ111.3)，c-2(δ129.2)，c-5(δ122.5)，c-6(δ112.4)，c-7(δ137.8)存在相关信号，确定该化合物含有一个吲哚基团，在hmbc谱中h-11(δ4.49)与c-1(δ111.3)，c-10(δ31.4)，c-12(δ177.3)存在相关信号，¹h-¹hcosy谱中h-11(δ4.49)与h-10(δ3.22)相关，确定该基团是c-11位羟基取代的indole-3-lactyl基团(indlac)。h-11(4.49，1h，t，j＝5.3hz)的偶合常数与化合物mg30(nahokoyamaji，manabuhorikawa，gerardocorzo，etal.structureandenantioselectivesynthesisofpolyaminetoxinmg30fromthevenomofthespidermacrothelegigas[j].tetrahedronletters，2004，45：5371-5373.)的相对应的h(4.53，t，j＝5.5hz)的偶合常数相一致，故确定h-11为β构型。

在hmbc谱中h-17(δ1.11)与c-16(δ67.9)，c-14(δ60.1)存在相关信号，h-14(δ4.09)与c-16(δ67.9)，c-15(δ173.7)，c-17(δ20.4)存在相关信号，¹h-¹hcosy谱中h-17(δ1.11)与h-16(δ4.19)相关，表明存在一个thr基团；h-35(δ3.89)与c-34(δ170.5)，c-36(δ29.7)，c-37(δ25.5)存在相关信号，h-38(δ3.23)与c-36(δ29.7)，c-37(δ25.5)，c-40(δ158.7)存在相关信号，表明存在一个arg基团；在hmbc谱中h-24(δ2.78)和h-25(δ2.78)与c-22(δ56.5)，c-26(δ54.6)存在相关信号，表明在一个季铵n上连有2个甲基和2个亚甲基。

hmbc谱中存在h-14(δ4.09)与c-12(δ177.3)，h-32(δ3.40，3.22)与c-34(δ170.5)相关，确定indlac，thr和arg基团的连接方式。

在hmbc谱中h-19(δ3.07)与c-21(δ22.2)，h-20(δ1.74)与c-21(δ22.2)，h-22(δ3.05)与c-21(δ22.2)存在相关信号，确定c19-c22的碳链，即n18和n23之间通过4个ch2相连；h-28(δ3.23)与c-27(δ25.5)，h-27(δ1.72)与c-28(δ41.7)和c-26(δ54.6)存在hmbc相关信号，确定c26-c28的碳链，即n23和n29之间通过3个ch2相连，h-32(δ3.40，3.22)与c-30(δ55.1)，c-31(δ25.5)，c-34(δ170.5)存在hmbc相关信号，确定c30-c32的碳链，即n29和n33之间通过3个ch2相连，并与化合物argtx-623(即之前的化合物1)的相关波谱数据比对确定n15和n33之间的连接。综合1dnmr和2dnmr的解析确定该化合物的结构。

经鉴定，avtx-757是首次发现具有含有一个indlac(吲哚乳酸)，thr(苏氨酸)和arg(精氨酸)的季铵类化合物，该化合物的分子式为c36h64o5n13，结构式如图12。

3)avtx-757的功能分析

①avtx-757对昆虫的麻醉和致死作用

经膜片钳分析，毒素avtx-757在浓度为10μmol/l时能完全阻断蜚蠊的钠离子通道(图13)，通过不同浓度的avtx-757对蜚蠊钠离子通道的作用分析，得出了毒素avtx-757对昆虫dum细胞钠通道的半数有效浓度。其中半数有效浓度为0.77±0.05μmol/l。毒素avtx-757在浓度100μmol/l时对大鼠钠离子通道没有表现出明显的影响(图14)。研究结果表明，avtx-757能在10μmol/l浓度下完全阻断昆虫的钠离子通道，而在高达100μmol/l浓度下对脊椎动物钠离子通道没有明显作用。avtx-757在神经生物学研究工具试剂的研发和药物及杀虫剂的开发等方面的可能应用；作为一种选择性作用于昆虫的钠离子通道却对哺乳类动物的钠离子通道无明显作用，显示出avtx-757作为一种绿色农药研发先导分子的可能性。

本发明涉及的小分子毒素avtx-757具有更强的昆虫选择性毒性，对昆虫钠离子通道的半数有效浓度低于1μmol/l。结构上为季铵类分子，受ph影响较小，作用更强，更稳定。本发明涉及的分离纯化技术已经过多次实验使用，证明可行。能从大腹园蛛毒液中有效分离纯化出具有生物学活性的avtx-757及其他非蛋白质类小分子毒素。纯化出的avtx-757的结构与性质分析均用现代生物化学与电生理学等技术重复进行，结果可靠。研究结果表明，本发明涉及到的小分子毒素avtx-757是一类季铵类分子，与以往发现得多胺类毒素结构上有明显差异，对昆虫钠离子通道的阻断活性较强，半数有效浓度低于1μmol/l。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。