用于多肽的固相合成的设备和方法与流程

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种用于多肽的固相合成的设备和方法。

背景技术：

多肽是α-氨基酸脱水缩合后以肽键连接在一起而形成的化合物。目前，已经发展了包括固相合成在内的多肽合成技术。

在固相合成法中，选用其中相关官能团被特定的保护基保护的天然氨基酸作为原料。合成时，在固相载体上开始反应。通过反复进行去保护、激活、交联等步骤，使得氨基酸和氨基酸之间形成肽键，逐个连接到固相载体上形成多肽链。

现有的用于多肽的固相合成的设备中，典型地使用气体例如氮气作为液体转移驱动物质。在这种结构的设备中，当等待反应容器中的反应进行时，一部分原料氨基酸溶液进料后会潴留在管道内，时间过长会发生管道内的氨基酸溶液沉淀析出的问题。氨基酸析出会堵塞管道，如不及时清理，将导致反应不可预期的停止，从而大大影响多肽合成的效率。

因此，需要防止出现氨基酸析出的用于多肽的固相合成的设备。

技术实现要素：

在一个方面，本发明提供一种用于多肽的固相合成的设备，所述设备包括：

至少一个氨基酸储液器，用于储存氨基酸溶液；

至少两个缩合剂储液器，用于储存缩合剂；

多通道切换装置，所述多通道切换装置具有多个入口和一个出口，并且允许在所述多个入口中的任一个与所述出口之间形成流体通道的同时，其他入口与所述出口之间不形成流体通道；

蠕动泵；

量液装置；

中转装置；

反应器；和

脱保护剂储液器，用于储存脱保护剂，

其中，

所述至少一个氨基酸储液器中的每个和所述至少两个缩合剂储液器中的每个分别与所述多通道切换装置的入口流体连通，

所述多通道切换装置的出口与所述蠕动泵的一个端口流体连通，

所述蠕动泵的另一个端口与所述量液装置的入口流体连通，

所述量液装置的出口与所述中转装置的入口流体连通，

所述中转装置的出口与所述反应器流体连通，并且

所述脱保护剂储液器与所述反应器流体连通。

可选地，所述多通道切换装置是一个多通道切换阀。

可选地，所述多通道切换装置是多个串联的多通道切换阀。

可选地，所述设备还包括至少一个清洗液储液器，所述至少一个清洗液储液器中的每个分别与所述多通道切换装置的最上游入口流体连通。

可选地，所述量液装置具有液位传感器。

可选地，所述反应器是双通道反应器。

可选地，所述设备还包括电机，所述电机配置为可使得所述反应器翻转。

可选地，所述设备还包括切割液储液器，所述切割液储液器与所述反应器流体连通。

在另一个方面，本发明提供一种使用上述设备合成多肽的方法，所述方法包括：

设置所述多通道切换装置，使得所述至少一个氨基酸储液器中的一个氨基酸储液器与所述蠕动泵之间形成流体通道；

使蠕动泵正向运行，以将所述一个氨基酸储液器中储存的氨基酸溶液输送到所述量液装置；

将所述量液装置中的氨基酸溶液输送至所述中转装置；

使所述蠕动泵反向运行，以将在所述蠕动泵与所述量液装置之间的管道中潴留的氨基酸溶液输送回所述氨基酸储液器；

设置所述多通道切换装置，使得所述至少两个缩合剂储液器中的一个缩合剂储液器与所述蠕动泵之间形成流体通道；

使蠕动泵正向运行，以将所述一个缩合剂储液器中储存的第一缩合剂输送到所述量液装置；

使所述蠕动泵反向运行，以将在所述蠕动泵与所述量液装置之间的管道中潴留的第一缩合剂输送回所述一个缩合剂储液器；

将所述量液装置中的缩合剂输送至所述中转装置；

设置所述多通道切换装置，使得所述至少两个缩合剂储液器中的另一个缩合剂储液器与所述蠕动泵之间形成流体通道；

使蠕动泵正向运行，以将所述另一个缩合剂储液器中储存的第二缩合剂输送到所述量液装置；

将所述量液装置中的第二缩合剂输送至所述中转装置；

使包含所述氨基酸溶液、所述第一缩合剂和所述第二缩合剂的混合物在所述中转装置中反应，以使氨基酸活化；

将活化的氨基酸从所述中转装置输送至所述反应器，并在放置于所述反应器中的固体载体上反应，形成肽链；以及

将所述脱保护剂储液器中储存的脱保护剂输送到所述反应器中，以对所述肽链脱保护。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。

图1示出了一种根据本发明的实施方案的用于多肽的固相合成的设备的示意图。

图2示出了一种基于图1的根据本发明的实施方案的用于多肽的固相合成的设备进行扩展得到的装置的示意图。

图3示出了一种更具体的根据本发明的实施方案的用于多肽的固相合成的设备的示意图。

具体实施方式

下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

图1示出了一种根据本发明的实施方案的用于多肽的固相合成的设备的示意图。其包括：至少一个氨基酸储液器8，至少两个缩合剂储液器6，多通道切换装置3，蠕动泵5，量液装置12，中转装置14，反应器4，和脱保护剂储液器21。

氨基酸储液器8和缩合剂储液器6用于储存多肽反应的合成原料，并且可以称为原料储液器。氨基酸储液器8至少为一个，但也可以有多个，但在图1中用一个方块表示。本发明中，对氨基酸储液器的个数不作特别的限制，其可以为1、2、3、4、5乃至更多个，例如可多至24个。多个氨基酸储液器8可以用于储存不同种类的氨基酸溶液，从而合成包括多种氨基酸单体的多肽。缩合剂储液器6至少为两个，但也可以有多个，但在图1中用一个方块表示。由于通常多肽合成中至少需要两种缩合剂，系统中至少有两个缩合剂储液器。本发明中，对缩合剂储液器的个数不作特别的限制。其可以为2个，并且分别用于储存两种不同的缩合剂，即第一缩合剂和第二缩合剂。

多肽合成通常需要依次使用两种缩合剂，来完成氨基酸缩合。一个体系中的第一缩合剂与第二缩合剂的一个实例是dic与oxyma。反应方式示意如下。

通过以上所示的过程，从氨基酸固相合成多肽。第一/第二缩合剂体系的其他实例还可以是hctu/diea、hatu/diea等。hatu和hctu结构类似，原理相同，但hatu活性更高。

上述原料储液器均通过多通道切换装置3与蠕动泵5的一端连接。多通道切换装置3具有多个入口和一个出口，并且允许在所述多个入口中的任一个与所述出口之间形成流体通道的同时，其他入口与所述出口之间不形成流体通道。多通道切换装置3可以是一个多通道切换阀，例如一个6通道切换阀。当原料储液器较多时，则可以使用多个串联连接的多通道切换阀来形成多通道切换装置3，上游的多通道切换阀的出口与其下游的多通道切换阀的一个入口连接，并且其中最下游的一个多通道切换阀的出口与蠕动泵5直接连接。在图1中，多通道切换装置3用一个方块表示。本发明中，对多通道切换阀的个数不作特别限制。多通道切换装置3保证同一时间仅有一个原料储液器与蠕动泵5流体连通。应当注意的是，当使用多个串联连接的多通道切换阀来形成多通道切换装置3时，由于串联各多通道切换阀的管道的存在，各个多通道切换阀在流路中有上下游之分。从最上游的多通道切换阀流入的液体将流过所有串联管道。对于同一个多通道切换阀来说，各个入口是等价的。

蠕动泵5的一个端口与多通道切换装置3的出口流体连通，并且其另一个端口流体连通至量液装置12。典型地，所述另一个端口流体连通至量液装置12的顶部或上部，从而液体可以受重力作用落入量液装置并在底部聚集。众所周知，蠕动泵可以实现流体的双向递送。因此，蠕动泵5既可以将液体从储液器泵送至量液装置12，也可以将量液装置12与蠕动泵5之间的管线中潴留的反应液体泵送回其储液器中。在本文中，将蠕动泵5向量液装置12递送液体的方向称为正向，并且将蠕动泵5向原料储液器递送液体的方向称为反向。

在本发明中，流体连通表示存在流体通路，并且在流体通路上可以设置阀门、泵等流体控制部件。

量液装置12用于定量地量取所需的原料液体。其可以是常规的容器。量液装置12可以任选地配备有液位传感器。例如，其可以配备有光电传感器13，并且在量液装置12中的液面到达所需高度时，发出信号指示液体量已足够。进而，可以利用该信号作为触发，使得蠕动泵5停止正向运行并开始反向运行，从而自动化地控制进料过程。

量液装置12的出口与中转装置14流体连通。典型地，量液装置12的水平位置比中转装置14的水平位置高，并且与中转装置14的顶部或上部流体连通，从而液体可以受重力作用从量液装置12流入中转装置14。中转装置14用于将反应原料液体在进入反应器中之前进行充分预混合，从而使氨基酸活化。

中转装置14与反应器4流体连通，从而可以将混合后的反应液进料至反应器4，并进行反应。典型地，利用蠕动泵运行的管道压力，将混合后的反应液从中转装置14转移至反应器4。

反应器4可以是任何适合用于多肽的固相合成的反应器。反应时向其中放入多肽的固体载体。而且，反应器4还可以通过机械运动帮助反应进行。例如，反应器4可以安装在电机上，并且在反应过程中借助该电机连续发生上下翻转，从而使活化后的氨基酸和树脂进行充分的混合和反应。

本发明的用于多肽的固相合成的设备还可以包含其他在多肽合成中所需的常规部件。

用于多肽的固相合成的设备还应包含脱保护剂的储存和进料系统。设备至少包括与反应器流体连通的脱保护剂储液器。脱保护剂可以是例如哌啶。脱保护剂的储存和进料系统可以类似于原料储存和进料系统使用蠕动泵。

用于多肽的固相合成的设备还可以包括连接至反应器的废液处理系统。废液处理系统可以包括泵和废液收集器等。用于多肽的固相合成的设备还可以包括连接至反应器的产物收集系统。产物收集系统可以包括泵和产物收集器等。废液处理系统和产物收集系统可以共用管道。

用于多肽的固相合成的设备还可以包括所需的自动化反馈和控制装置。

本发明的用于多肽的固相合成的设备可以包括任意适当的阀门、泵、传感器和流路设计。本发明中的泵均优选为蠕动泵，从而完全不包含使用气体驱动液流的装置。

本发明的用于多肽的固相合成的设备的特征在于，通过采用蠕动泵和多通道阀的组合进行进料，可以将潴留在泵和量液装置之间的管道中的反应液特别是氨基酸反应液输送回其储液器中，从而避免氨基酸溶液停留在管道中发生析出并进而引起管道阻塞。此外，相比于现有技术中使用气体驱动流体的方式，本发明的进料方式设计紧凑、节约成本、占用空间体积大大降低。

可选地，本发明的用于多肽的固相合成的设备还包括与多通道切换装置3的最上游入口连接的清洗液储液器9。当在本发明中使用多种氨基酸合成多肽时，在附接每种氨基酸后，需要对蠕动泵5、量液装置12、中转装置14、反应器4以及其中的树脂载体进行清洗，以进行下一步合成或切割。此时，通过设置多通道切换装置3，使清洗液流过整个流路，以进行清洗。设置在最上游是为了能够清洗整个流路。当多通道切换装置3是仅仅一个多通道切换阀时，任一入口均为最上游入口。当多通道切换装置3是串联连接的多通道切换阀时，最上游入口是最上游的多通道切换阀的任一入口。用于为下一步合成做准备的清洗液和用于为切割做准备的清洗液可以是不同的清洗液。清洗液储液器9至少为一个，但也可以有多个，但在图1中用一个方块表示。

可选地，本发明的用于多肽的固相合成的设备还包括切割液储存和进料系统。切割液用于将最终合成好的多肽从固体载体上切割下来。切割液的储存和进料系统可以类似于原料储存和进料系统使用蠕动泵。不过，由于切割液不存在堵塞管道的问题，因此也可以考虑使用其他进料方式。

可选地，本发明的用于多肽的固相合成的设备还包括产物清洗液储液器，用于储存产物清洗液。在切割完成后，含有产物的切割液从反应器排出，但反应器中仍残留一些包含多肽的反应产物。产物清洗液用于对反应器和树脂进行清洗，以避免产物浪费。

图2示出了一种基于图1的根据本发明的实施方案的用于多肽的固相合成的设备进行扩展得到的装置的示意图。

其中，包括三个氨基酸储液器81、82、83；两个缩合剂储液器61、62；与多通道阀3连接的清洗液储液器9；设置在量液装置12中的光电液位传感器13；流体连通至反应器4的脱保护剂储液器21；可以使反应器4上下翻转的电机17；储存废液的废液收集器23；和储存切割液的切割液储液器25。

在本文中，部件的数字标记的下标用于区别同种类的部件。例如，81、82、83用于表示第一、第二和第三氨基酸储液器。

该装置运行方式为：首先将多通道阀3切换至与储存第一氨基酸的氨基酸储液器81连通，使蠕动泵5正向运行，从而将第一氨基酸向量液装置12输送。当量液装置12中的第一氨基酸的量达到预定值时，被光电液位传感器检测到，并控制蠕动泵反向运行，将蠕动泵5与量液装置12之间潴留的氨基酸溶液送回氨基酸储液器81中。将计量量的氨基酸溶液从量液装置12输送至中转装置14。随后，将多通道阀3切换至与储存第一缩合剂的缩合剂储液器61连通，使蠕动泵5正向运行，从而将第一缩合剂向量液装置12输送。当量液装置12中的第一缩合剂的量达到预定值时，被光电液位传感器检测到，并控制蠕动泵反向运行，将蠕动泵5与量液装置12之间潴留的第一缩合剂送回缩合剂储液器61中。将计量量的第一缩合剂从量液装置12输送至中转装置14。随后，将多通道阀3切换至与储存第二缩合剂的缩合剂储液器62连通，使蠕动泵5正向运行，从而将第二缩合剂向量液装置12输送。当量液装置12中的第二缩合剂的量达到预定值时，被光电液位传感器检测到，并控制蠕动泵反向运行，将蠕动泵5与量液装置12之间潴留的第二缩合剂送回缩合剂储液器62中。在此，也可以不反向运行蠕动泵，即不将潴留的第二缩合剂送回缩合剂储液器62中，而是直接等待进行后述的流路清洗。不过，从节约试剂的角度看，选择将潴留的第二缩合剂送回缩合剂储液器62中。将计量量的第二缩合剂从量液装置12输送至中转装置14。应当注意，在上述过程中，各次反向运行蠕动泵的步骤与将液体从量液装置12输送至中转装置14的步骤的先后顺序可以是任意的。也就是说，可以在将潴留的液体送回原料储液器之前、之后或同时，将量液完成的液体从量液装置输送至中转装置。本发明对此次序不作限制。在中转装置14中将第一氨基酸、第一缩合剂和第二缩合剂充分混合形成混合物，反应以使氨基酸活化。将混合物从中转装置14输送至反应器4中。开动电机17使反应器4上下翻动，使混合物与其中的固体载体反应。反应后，将废液排出至废液收集器23。随后，将多通道阀3切换至与清洗液储液器9连通，使蠕动泵5正向运行，对流路进行充分清洗。清洗后的废液排出至废液收集器23。至此，完成多肽中第一氨基酸的合成。随后，从脱保护剂储液器21向反应器输入脱保护剂，使已有的多肽链的羧基脱保护。之后重复清洗过程。

重复上述步骤，不同之处在于使用来自氨基酸储液器82中的第二氨基酸，以完成多肽中第二氨基酸的合成。再次重复上述步骤，不同之处在于使用来自氨基酸储液器83中的第三氨基酸，以完成多肽中第三氨基酸的合成。

最后，使用来自切割液储液器25的切割液，将多肽从固体载体上切割下来，得到粗肽溶液。将粗肽从反应器4中取出并进行后续处理。

如上所述，本发明的用于多肽的固相合成的设备组合利用蠕动泵与多通道切换阀，解决了现有固相合成多肽的装置中氨基酸潴留阻塞管道的问题。此外，本发明的装置设计紧凑，不必使用气体驱动系统，大大节约了空间和成本。同时，蠕动泵还可以提供更高的进料精度。

图3示出了一种更具体的根据本发明的实施方案的用于多肽的固相合成的设备的示意图。

在图3中，设置有24个氨基酸储液器81至824，它们分批连接到多通道切换阀32至36。此处的多通道切换阀36至32依次串联。即多通道切换阀36的出口连接至多通道切换阀35的一个入口，多通道切换阀35的出口连接至多通道切换阀34的一个入口，依次类推。多通道切换阀32的出口进而连接至多通道切换阀31的一个入口。多通道切换阀31至36均为6通道切换阀，它们共同形成多通道切换装置。还设置有两个清洗液储液器91和92，分别用于储存dmf和dcm，并连接至最上游多通道切换阀36。此外，五个缩合剂储液器61至65连接至多通道切换阀31，分别可用于储存dic、oxyma、hatu、hctu、diea。可以理解，上述储液器与多通道切换阀的连接关系可以改变。由于六个六通道切换阀的串联关系，可以通过它们的切换档位，使得同一时间仅有一个储液器与蠕动泵5流体连通。

多通道切换阀31的出口与蠕动泵5流体的一个端口连通，并且蠕动泵5的另一端口与量液装置12流体连通。

图3中的脱保护剂储液器21、废液收集器23和切割液储液器25等在前文中已有描述。图3中在它们的流路中设置了适当的阀门v和泵p，以输送液流。

图3中存在两个反应器41和42，也称为双通道反应器。双反应器的优点在于可以在一个反应器进行反应时，另一个反应器进行清洗等步骤。等进行反应的反应器反应完毕进行清洗等步骤时，另一个反应器可以进行反应。这种交叉反应的方式减少待机时间，提高反应效率。也可以设置更多的反应器。

图3中还示出了用于储存粗肽的反应物收集器27。其与废液收集器23共用同一反应器出口，并且根据需要用切换阀切换流路。

图3中还示出了产物清洗液储液器29。

以下以一个多肽反应单次缩合-脱保护以及切割为例，说明图3的装置的工作过程。

将蠕动泵5开启，将六个6通道切换阀切换到使蠕动泵5与容纳甘氨酸(gly)的氨基酸储液器81连通的状态，形成氨基酸传输通路。氨基酸储液器81中的甘氨酸由于蠕动泵5的作用输送到量液装置12中。当液面位置到达预先设定的光电传感器13位置，传感器13响应后发送指令到蠕动泵5，使蠕动泵5中电机发生反向转动。蠕动泵5反转后将管道中潴留的甘氨酸液体退回到甘氨酸储瓶中。同时，发送信号到量液装置12下方的阀门。该阀门开启，使得量液装置12中的液体通过重力的作用落入到中转装置14中。接着将多通道切换阀31切换，使缩合剂储液器61与蠕动泵5连通。蠕动泵5开启，将第一缩合剂dic(n，n′-二异丙基碳二亚胺)输送到量液装置12中，量取定量的体积之后的反馈类似之前的甘氨酸。蠕动泵5反转排出管道多余的液体。同时阀门开启，将第一缩合剂转移到中转装置14中。接着将多通道切换阀31切换，使缩合剂储液器62与蠕动泵5连通。重复上述相同的过程，量取定量的体积的第二缩合剂oxyma(2-肟氰乙酸乙酯)到中转装置14中。在中转装置14中形成甘氨酸与缩合剂的混合物。

静置30s将氨基酸活化后，打开中转装置14下方的阀门和泵，将活化后的甘氨酸和缩合剂的混合物按需转入到反应器41和42中的任意一个中。反应器41和42可以是双通道反应器的两个反应瓶。转入混合物后，后部的电机发生连续上下翻转动作，将活化后的氨基酸和树脂进行充分的混合反应。反应完成后，打开反应器下方的阀门和泵，使多余反应液进入废液桶。随后将多通道切换阀切换到使清洗液储液器91与蠕动泵5流体连通，输送清洗液n，n-二甲基-甲酰胺(dmf)进入到量液装置12，再进入中转装置14，再到反应瓶中。电机启动，上下反转清洗树脂和反应瓶。一段时间后，在通过开启阀门和泵，将废液导入到废液收集器中。

偶合完成后要进行脱保护过程。将脱保护剂哌啶转移到反应瓶中。此处的流路上也可以设置蠕动泵、量液装置、传感器等。转移后，电机启动，上下翻转混合一段时间后，将反应后的液体排出到废液收集器中，接着重复上面dmf的清洗步骤，将反应瓶和其中的树脂清洗干净。

随后，可以重复上述整个步骤，从氨基酸储液器82中输送下一种氨基酸用于多肽合成。氨基酸储液器中例如还可以储存丙氨酸(ala)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、缬氨酸(val)、脯氨酸(pro)、苯丙氨酸(phe)、蛋(甲硫)氨酸(met)、色氨酸(trp)、丝氨酸(ser)、谷氨酰胺(gln)、苏氨酸(thr)、半胱氨酸(cys)、天冬酰胺(asn)、酪氨酸(tyr)、天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)、赖氨酸(lys)、精氨酸(arg)、组氨酸(his)等。可以使用所需的其他缩合剂。例如2-(7-氧化苯并三氮唑)-n，n，n′，n′-四甲基脲六氟磷酸盐(hatu)、6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(hctu)、二异丙基乙胺(diea)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(hoat)等。

在多肽合成完成后，进行切割之前，将多通道切换阀切换到使得容纳二氯甲烷(dcm)的清洗液储液器92与蠕动泵5连通。蠕动泵5开启后，将清洗液输送至反应器。上下翻转清洗后，废液转移到废液中。重复3-4次，保证除尽反应器中多余的dmf。针对不同的清洗对象，可以使用两种或更多种清洗液，例如可以基于对清洗对象的溶解性进行选择。随后，将切割试剂从切割液储液器中转移到反应瓶中，启动翻转，开始进行多肽的在线切割。2h后，开启阀门和泵，将反应物转移到反应物收集器27中。最后，从产物清洗液储液器29中向反应瓶输送三氯乙酸(tfa)进行清洗。清洗树脂后，将清洗液也收集到反应物收集器27中。对收集的产物进行后处理，即得到多肽的粗产物。

以上描述了本发明的具体实施方案。本发明通过采用蠕动泵和多通道阀的组合进行进料，可以将潴留在泵和量液装置之间的管道中的反应液特别是氨基酸反应液输送回其储液器中，从而避免氨基酸溶液停留在管道中发生析出并进而引起管道阻塞。此外，相比于现有技术中使用气体驱动流体的方式，本发明的进料方式设计紧凑、节约成本、占用空间体积大大降低。

所属领域的技术人员可以清楚地了解到，为描述的方便和简洁，仅以上述各功能模块的划分进行举例说明，实际应用中，可以根据需要而将上述功能分配由不同的功能模块完成，即将装置的内部结构划分成不同的功能模块，以完成以上描述的全部或者部分功能。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。