一种灵芝孢子粉的破壁方法与流程

本发明涉及一种灵芝孢子粉的破壁方法，属于细胞生物技术领域。

技术背景

灵芝孢子粉的表面有两层壁，主要成分是葡萄糖和几丁质，在细胞壁的表面有均匀分布的孔洞。灵芝孢子粉的壁十分坚硬且极难被氧化分解，未经处理的孢子粉会限制机体对它的利用，所以通常会对孢子粉做破壁处理以便充分利用孢子内的有效物质。目前常用的孢子粉破壁方法有研磨法、酶解法、超声波法、超音速气流法等，这些方法各有优缺点。例如利用溶壁酶进行酶解法破壁，过程比较亲和且有效成分不易损失，但是溶壁酶价格昂贵造成成本较高；利用机械法破壁时，由于孢子粉极其微小，会造成破壁不充分甚至无法破壁的现象，所以只能在干燥下直接用外力对孢子粉破壁，如研磨法，但是研磨法会完全破坏孢子结构，严重损失孢子有效物质；利用超音速气流法破壁最初的破壁效率会很高，但是随着越来越多的孢子被破壁，内容物流出，使外力强度降低而造成破壁效率变小。

此外，金属离子的残留是机械破壁方法的重要弊端，尤其是重金属的残留会直接对人体造成危害。《中国药典》中常用酸值、过氧化值和羰基值3个指标来衡量油脂的酸败度。灵芝孢子粉内含有大量的不饱和脂肪酸，经破壁处理后，孢子粉如果暴露在有氧的环境下，一方面其含有的不饱和脂肪酸会发生自动氧化，产生过氧化物继而降解成挥发性醛、酮和酸的复杂混合物，另一方面是微生物可把油脂分解为游离脂肪酸和甘油，这些脂肪酸经系列酶促反应会产生挥发性的低级酮，甘油则可被氧化成1，2－环氧丙醛，也即人们常说的酸败。这些有害物质会破坏孢子粉中的其它有效成分，严重影响孢子粉的质量，进而对人的健康产生危害。

技术实现要素：

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种灵芝孢子粉的破壁方法，所述方法可以精准破壁，最大程度保留孢子粉的细胞结构，且所得孢子粉金属离子残留少、酸败度低、保存时间较长。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种灵芝孢子粉的破壁方法，其特征在于，具体步骤如下：

将灵芝孢子粉与水混合，在液氮中冷冻后，于50℃下水浴溶解；反复冻融数次；去除水，加入羧基化四氧化三铁纳米磁珠，超声破壁，得破壁后的灵芝孢子粉。

按上述方案，优选地，所述灵芝孢子粉与所述水的用量比为0.1-0.5g：3-15ml。

按上述方案，优选地，所述冷冻的时间为3-10min，所述水浴的时间为3-10min。

按上述方案，优选地，所述羧基化四氧化三铁纳米磁珠的粒径为80-100nm。

按上述方案，优选地，所述羧基化四氧化三铁纳米磁珠的用量与所述孢子粉的用量比为1～3ml：0.1g。

按上述方案，优选地，所述超声破壁的方法具体为：超声开3s，关1s；依次循环，共计超声时间40min。

本发明技术原理在于：

本发明首先利用反复冻融的方法使灵芝孢子粉细胞壁变脆，容易被破开，再向破壁体系中加入羧基化四氧化三铁纳米磁珠作为破壁工具，最后用超声波作外力加以破壁，处理完成后再用磁铁把纳米磁性氧化铁吸出。

相比于现有技术，本发明具有的有益效果如下：

1、本发明所用原材料价格便宜，所得破壁后的灵芝孢子粉中金属离子残留少、酸败度低。

2、本发明采用的技术方案可以做到精准破壁，在孢子粉上破出小洞，对细胞结构的破坏小，既可以极大程度保留内容物，又克服了常规方法因破坏细胞结构造成的孢子粉保质期短的缺陷。

附图说明

图1是本发明实施例1的步骤1)得到的无处理灵芝孢子粉的扫描电镜图。

图2是本发明实施例1的步骤2)得到的反复冻融3次后的灵芝孢子粉的扫描电镜图。

图3是本发明实施例1的步骤3)最终得到的破壁后的灵芝孢子粉的扫描电镜图。

图4是本发明对比实施例1最终得到的破壁后的灵芝孢子粉的扫描电镜图。

图5是本发明对比实施例2最终得到的破壁后的灵芝孢子粉的扫描电镜图。

具体实施方式

如无特别说明，下述实施例中所用原料均为市售可得。

实施例1

对灵芝孢子粉进行破壁，具体步骤如下：

(1)将0.1g灵芝孢子粉装入10ml离心管中，加3mlddh2o。

(2)将装有孢子粉和ddh2o的离心管在液氮中冷冻5min，然后在50℃恒温水浴锅中溶解5min；该步骤反复进行3次。

(3)利用低温冷冻离心机，8000r/min离心5min，去除水，加入3ml羧基四氧化三铁纳米磁珠(粒径为100nm)，然后用超声波细胞粉碎仪(功率：540w)破壁，具体程序为：超声开3s，关1s；依次循环，共计超声时间40min。

步骤(1)中仅加入ddh2o未作进一步处理的灵芝孢子粉、步骤(2)中反复冻融3次后得到的灵芝孢子粉以及步骤(3)中最终得到的破壁后的灵芝孢子粉的扫描电镜图分别如图1、图2和图3所示。从图3可见，灵芝孢子粉的细胞壁表面出现不规则形状的孔洞，与灵芝孢子粉细胞壁表面自带的孔洞相比更大且不规则。

破壁率的统计，方法如下：

在电镜下，选取3个1000x视野，分别统计视野内孢子总数和破壁孢子数，计算平均破壁率。

经统计，本发明最终得到的的破壁灵芝孢子粉的破壁率为43％。

对本实施例制得的金属离子残留量与酸败度采用下述方法进行测定，结果见表1：

1、铬含量的测定：石墨炉原子吸收光谱测定。

2、酸值的测定：依据中华人民共和国国家标准中gb/t5530-2005的热乙醇测定法，要求≤6.0(koh)mg/g。

3、过氧化值的测定：依据中华人民共和国国家标准中gb/t5538-2005的方法，要求≤7.5mmol/kg

4、羰基值的测定：依据中华人民共和国国家标准gb/t5009.37-2003的方法。

表1

实施例2

对灵芝孢子粉进行破壁，具体步骤如下：

(1)将0.1g灵芝孢子粉装入10ml离心管中，加5mlddh2o。

(2)将装有孢子粉和ddh2o的离心管在液氮中冷冻8min，然后在50℃恒温水浴锅中溶解8min；该步骤反复进行4次。

(3)利用低温冷冻离心机，8000r/min离心5min，去除水，加入1ml羧基四氧化三铁纳米磁珠(粒径为100nm)和2mlddh2o，然后用超声波细胞粉碎仪(功率：540w)破壁，具体程序为：超声开3s，关1s；依次循环，共计超声时间40min。

经统计，本发明最终得到的的破壁灵芝孢子粉的破壁率为35％。

对比实施例1

对灵芝孢子粉进行破壁，具体步骤同实施例1，仅将步骤(3)中加入的羧基化四氧化三铁纳米磁珠调整为ddh2o。

本对比实施例最终得到的破壁后的灵芝孢子粉的扫描电镜图如图4所示。

经统计，本发明最终得到的的破壁灵芝孢子粉的破壁率为35％。

对比实施例2

对灵芝孢子粉进行破壁，具体步骤同实施例2，仅将步骤(3)中加入的羧基化四氧化三铁纳米磁珠调整为ddh2o(即该步骤加入共计3ml的ddh2o)。

本对比实施例最终得到的破壁后的灵芝孢子粉的扫描电镜图如图5所示。

经统计，本发明最终得到的的破壁灵芝孢子粉的破壁率为34％。

对比实施例3

采用机械法对灵芝孢子粉进行破壁，具体步骤为：将灵芝孢子粉60℃烘干至恒重后，放入超微粉碎机得破壁的灵芝孢子粉。

对本对比实施例制得的金属离子残留量与酸败度进行测定，方法同实施例1，结果如表1所示。

从结果可见，相比于实施例1，本对比实施例制得的破壁灵芝孢子粉酸败度明显更高，且金属离子的残留量增加了8倍。