阿魏菇中麦角甾醇过氧化物的提取方法及应用与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及阿魏菇中麦角甾醇过氧化物的提取方法及应用。

背景技术：

药用真菌是天然药物中的一个重要组成部分，因其具有突出的生物功效已成为功能食品和医学研究的热点。近年来，天然产物尤其是具有生物活性的化合物以其抗肿瘤、抗氧化及免疫调节的高效性和候选资源丰富性的优势，成为药物及保健品研发关注的热点。研究表明，一些药用真菌具有抗肿瘤潜力，如灵芝、茯苓、猴头菇及阿魏菇等。

阿魏菇(pleurotusferulae)是一种药食同源的真菌，寄居生长在戈壁沙漠的阿魏根茎上。野生阿魏菇主要分布于新疆准噶尔盆地荒漠区的伊犁、塔城和阿勒泰地区。鉴于野生阿魏菇的资源稀缺，1983年，新疆生物沙漠土壤研究所对野生阿魏菇进行了人工驯化。研究报道阿魏菇具有调节机体生理平衡、抗氧化、增强机体免疫功能、抗辐射、抗肿瘤及降血脂等功效，具有广阔的药用及保健品开发价值。

有鉴于此，本发明提出一种阿魏菇中麦角甾醇过氧化物的提取方法及应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种阿魏菇中麦角甾醇过氧化物的提取方法，该提取方法简单，可有效提取出阿魏菇中麦角甾醇过氧化物。

为了实现上述目的，所采用的技术方案为：

阿魏菇中麦角甾醇过氧化物的提取方法，包括以下步骤：

(1)将阿魏菇子实体粉末用95％乙醇提取后，浓缩至无醇味，得浓缩液a；

(2)将浓缩液a用石油醚萃取3次，合并石油醚部分，并浓缩至浸膏状，得浸膏b；

(3)将浸膏b进行硅胶柱层析，收集流分并浓缩，经薄层层析检测，合并相同流分，得粗品c；

(4)将粗品c进行sephadexlh-20葡聚糖凝胶柱层析，收集流分，经薄层层析检测，合并相同流分后，重结晶，得到所述的麦角甾醇过氧化物。

进一步的，所述的步骤(1)的具体操作步骤为：向阿魏菇子实体粉末中加入95％乙醇，在60℃水浴浸提2h，离心，得到上清液和滤渣；

所述的滤渣再反复浸提3次，合并多次浸提后的上清液，减压浓缩，得浓缩液a。

再进一步的，所述的离心转速为5000r/min，时间为15min；

所述的减压浓缩的温度为50℃。

再进一步的，所述的水浴浸提过程中，超声辅助20min，功率为300w。

进一步的，所述的步骤(3)中，所述的硅胶柱层析分离采用梯度洗脱，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯，每个配比洗脱液洗脱一个柱体积，每250ml为一个流分。

再进一步的，所述石油醚和乙酸乙酯的体积配比为：1:0、8:2、7:3、1:1、4:6、2:8、0:1。

进一步的，所述的步骤(4)中，所述的sephadexlh-20葡聚糖凝胶柱层析分离，采用甲醇进行洗脱，每10ml收集一次。

本发明的另一个目的在于提供阿魏菇中麦角甾醇过氧化物的应用，通过实验研究发现，麦角甾醇过氧化物可作为理想的抗食管癌及结肠癌候选药物。

麦角甾醇过氧化物在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步的，所述的抗肿瘤药物为抗食管癌药物。

进一步的，所述的抗肿瘤药物为抗结肠癌药物。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

本发明通过用乙醇提取、石油醚萃取、硅胶柱层析及葡聚糖凝胶柱层析分离纯化，可有效提取出栽培阿魏菇中麦角甾醇过氧化物(pleurotusferulaeerogosterolperoxide，pfep)，其结构式如图9所示。

通过实验研究发现，阿魏菇麦角甾醇过氧化物(pfep)可以抑制食管癌及结肠癌细胞生长、抑制ct26结肠癌小鼠肿瘤生长、提高ct26结肠癌小鼠的生存率。并且，提取出的pfep在体外作用于人食管癌eca-109细胞及小鼠结肠癌ct26细胞，证实pfep能抑制这两种肿瘤细胞的生长，诱导肿瘤细胞的凋亡、坏死及细胞周期阻滞；体内注射给ct26结肠癌小鼠抑制了肿瘤生长，提高了ct26结肠癌小鼠的生存率，证实栽培阿魏菇麦角甾醇过氧化物可作为理想的抗食管癌及结肠癌候选药物。

附图说明

图1为实施例1中石油醚相硅胶柱层析的薄层层析检测；

图2为实施例1中sephadexlh-20葡聚糖凝胶柱层析的薄层层析检测；

图3为实施例1中化合物电喷雾电离质谱(esi-ms)图谱；

图4为实施例1中化合物核磁共振氢谱(¹h-nmr)及碳-13核磁共振(¹³c-nmr)图谱；

图5为pfep在体外对eca-109及ct26细胞生长的抑制作用，其中a为不同浓度pfep处理24h后的eca-109及ct26细胞的形态学变化；b为pfep处理eca-109，ct26及nctc1469细胞24、48和72h后，mtt法检测细胞活性，数据进行单因素方差分析，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，处理组与对照组比较得出。

图6为pfep诱导eca-109细胞染色体凝聚和细胞凋亡，为不同浓度pfep处理24h后，流式细胞仪分析eca-109细胞的凋亡和坏死，数据进行单因素方差分析，**p<0.01,***p<0.001，处理组与对照组比较得出。

图7为pfep诱导eca-109细胞周期阻滞。不同浓度pfep处理eca-109细胞24h后，采用pi染色，流式细胞仪分析细胞周期，数据进行单因素方差分析，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，处理组与对照组比较得出。

图8为pfep对体内肿瘤生长的抑制作用。通过注射ct26细胞诱导小鼠肿瘤模型。3天后，采用二甲基亚砜(dmso)、pfep及顺铂对肿瘤小鼠(每组8只)进行治疗。在所指示的时间点对小鼠体重(a)、肿瘤生长(b)和生存率(c)进行监测。数据进行单因素方差分析，**p<0.01,***p<0.001，治疗组与对照组比较得出。

图9为阿魏菇麦角甾醇过氧化物(pfep)的结构式。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明阿魏菇中麦角甾醇过氧化物的提取方法及应用，达到预期发明目的，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的阿魏菇中麦角甾醇过氧化物的提取方法及应用，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。

下面将结合具体实施例对本发明阿魏菇中麦角甾醇过氧化物的提取方法及应用做进一步的详细介绍：

实施例1.

具体操作步骤如下：

(1)将栽培阿魏菇子实体洗净，切片，待其完全干燥后粉碎，过60目筛备用。

准确称量1kg，加入95％乙醇(料液比为1：20g/ml)，在60℃水浴浸提2h，并超声辅助20min(60℃，300w)。

再在5000r/min离心15min，得到上清液和滤渣；将滤渣再反复浸提3次，合并多次浸提后的上清液，用真空旋转蒸发仪在50℃下，水浴浓缩至无醇味，得到浓缩液a。

(2)将浓缩液a用石油醚进行萃取3次，合并石油醚相，旋转蒸发溶剂，获得石油醚相浸膏b。

(3)将浸膏b用甲醇完全溶解，然后拌入2倍质量硅胶。将拌好的样品水浴蒸发溶剂至拌样硅胶干燥，颗粒分散均匀。

用于分离的硅胶填料浸泡于石油醚中搅拌均匀，装柱至适当高度，然后平整加入拌好样的硅胶，进行硅胶柱层析。

硅胶柱层析采用的洗脱体系为石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，石油醚和乙酸乙酯的体积配比为：1:0、8:2、7:3、1:1、4:6、2:8、0:1。每个配比洗脱液洗脱一个柱体积，每250ml为一个流分(收集一次)，单独旋蒸后(单独旋蒸的目的是：通过浓缩使每个流分达到可以检测的浓度)，薄层层析检测，合并相同流分(如图1所示)。合并20-25号流分，得到的为粗品c。

(4)将粗品c进行sephadexlh-20葡聚糖凝胶柱层析。

用于分离的sephadexlh-20葡聚糖凝胶填料置于甲醇中浸泡24h，充分溶胀后装柱至适当高度，称取100mg粗品c充分溶解于少量甲醇溶液，纯甲醇进行洗脱。每10ml收集一次，薄层层析检测，合并单一流分(图2)，经甲醇重结晶后，获得目标化合物，即麦角甾醇过氧化物。

(5)对目标化合物其进行esi-ms及nmr检测。esi-ms图谱包括[m+h]⁺429(图3a)、[m+na]⁺451(图3b)及[m+k]⁺467(图3c)，表明该化合物分子量为428d。根据目标化合物的¹h-nmr图谱(图4a)和¹³c-nmr图谱(图4b)所示，目标化合物为阿魏菇麦角甾醇过氧化物。

实施例2.

制备的栽培阿魏菇麦角甾醇过氧化物体外抑制肿瘤细胞生长的筛选：

筛选方法：以不同浓度pfep(10、20、30、40μg/ml)处理eca-109和ct26细胞，24h后显微镜下观察细胞形态，pfep浓度依赖性的改变了eca-109和ct26细胞的形态，细胞变圆并且数量减少(图5a)。不同浓度pfep处理eca-109和ct26细胞24、48、72h后，采用mtt法检测细胞活性。结果发现，pfep浓度和时间依赖性地显著抑制了eca-109和ct26细胞的增殖(图5b)。同时，不同浓度pfep处理小鼠正常肝细胞nctc1469，24h后mtt法检测细胞活性，发现pfep对正常细胞的毒性较小(图5b)。

进一步检测pfep是否通过诱导细胞凋亡抑制eca-109细胞生长，采用20μg/ml和40μg/mlpfep处理eca-109细胞，24h后，采用annexinv/pi对细胞进行染色，流式细胞术检测细胞凋亡。结果显示，与对照组相比，pfep能够显著诱导eca-109细胞的凋亡和坏死(图6)。同时采用hoechst33342对处理后的细胞进行染色，荧光倒置显微镜观察细胞核形态。发现对照组的细胞核染色质分布均匀，而pfep处理的细胞核染色质呈现固缩和断裂，显示出典型的细胞凋亡形态学特征。

采用20μg/ml和40μg/mlpfep处理eca-109细胞24h，采用pi染色，流式细胞仪分析细胞周期。结果显示，pfep显著增加了g0/g1期细胞的比例，显著减少了s期细胞的比例(图7)，表明pfep将eca-109细胞周期阻滞在g0/g1期从而抑制eca-109细胞的增殖。

实施例3：

制备的栽培阿魏菇麦角甾醇过氧化物体内抑制结肠癌细胞生长的筛选：

为了评价pfep在体内抗肿瘤作用，将ct26细胞皮下注射到雌性balb/c小鼠右后侧，3天后，将小鼠随机分为5组，分别为：模型组，顺铂治疗组(5mg/kg)，pfep治疗组(20、40mg/kg)和dmso组(二甲基亚砜，pfep溶剂)。顺铂每7天腹腔注射一次，共3次，pfep及dmso每4天注射一次，共7次。结果表明，顺铂治疗组显著抑制ct26模型小鼠肿瘤生长，但与对照组相比体重显著下降，表明对小鼠具有一定毒性；同时，pfep显著抑制ct26模型小鼠肿瘤生长并且对小鼠体重没有影响(图8a&b)。ct26细胞接种52天后，模型组8只小鼠全部死亡，dmso组存活1只，顺铂组存活5只，20mg/kgpfep组存活5只，40mg/kgpfep组存活6只，生存率分别为：0％，12.5％，62.5％，62.5％和75％(图8c)。结果说明，pfep治疗组能抑制结肠癌小鼠肿瘤生长，提高肿瘤小鼠的生存率，并且无毒副作用。

以上采用不同的方法检测了栽培阿魏菇麦角甾醇过氧化物对食管癌及结肠癌的抑制作用，包括体外及体内实验进行了详细验证，并阐明了其作用机理。发现栽培阿魏菇麦角甾醇过氧化物具有良好的抗食管癌及结肠癌作用。

本发明采用95％乙醇提取栽培阿魏菇子实体粉末，旋蒸浓缩至提取液无乙醇味，得浓缩液a；浓缩液a用石油醚萃取，旋蒸浓缩，得浸膏b；首先采用硅胶柱层析分离浸膏b，经薄层层析检测，收集流分，得粗品c；对粗品c进行葡聚糖凝胶柱层析分离，经薄层层析检测，收集流分，旋蒸浓缩，重结晶，得到目标化合物；目标化合物进行esi-ms及nmr检测，解析目标化合物结构为麦角甾醇过氧化物。抗肿瘤实验表明，栽培阿魏菇麦角甾醇过氧化物在体外对食管癌和结肠癌细胞的抑制率分别达到了90％和75％以上。对体内的肿瘤生长抑制率达到了50％以上，使结肠癌小鼠生存率提高了62.5％，具有良好的抗肿瘤作用。

以上所述，仅是本发明实施例的较佳实施例而已，并非对本发明实施例作任何形式上的限制，依据本发明实施例的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明实施例技术方案的范围内。