一种鸭腺病毒2型DNA疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明属于免疫学
技术领域：
，具体涉及一种鸭腺病毒2型dna疫苗及其制备方法和应用。
背景技术：
：鸭腺病毒2型(duckadenovirus，dav)是1977年从法国番鸭中爆发的大规模疾病中分离的一种病毒。2014年，奥地利科学家anamarek通过高通量测序技术才获得该病毒全序列，并对该序列进行分析。同年，广东地区番鸭场，番鸭出现类似该病死亡的情况。发病鸭肝脏肿大，斑驳状出血、白色点状坏死等症状。鸭2型腺病毒感染近年来在广东、广西、浙江、福建等地番鸭、樱桃谷鸭养殖场频频爆发，给我国养鸭业带来很大经济损失。目前有效预防该病的方法仍然是注射疫苗。dna疫苗是20世纪90年代发展起来的第三代疫苗，与传统疫苗相比，dna疫苗拥有成本低，可诱导机体细胞免疫反应，免疫应答持续时间长等优点，具有巨大的应用前景。鸭腺病毒2型属于i群禽腺病毒，病毒核酸为双股dna。其中六邻体(hexon)是主要的结构蛋白，含有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，是中和抗体的靶目标和主要保护性抗原基因。本研究者从死亡发病的番鸭中分离获得鸭2型腺病毒，采用pcr等分子生物学手段获得了该病毒的hexon基因组序列。然后利用真核表达系统表达hexon蛋白，制备鸭腺病毒2型dna疫苗。免疫保护实验中显示保护率能达到80％-90％，为预防鸭腺病毒2型疫病提供了方法。技术实现要素：本发明的目的在于公开了一种鸭腺病毒2型dna疫苗的制备方法。本发明第二个目的在于公开了上述制备方法制得的鸭腺病毒2型dna疫苗。本发明第三个目的在于公开了上述鸭腺病毒2型dna疫苗的应用。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种鸭腺病毒2型dna疫苗的制备方法，包括下述步骤：(1)、合成seqidno.3所示的dav-hexon序列；(2)、构建pcdna3.1-dav-hexon质粒；(3)、pcdna3.1-dav-hexon质粒转染293t细胞，在293t细胞中表达得到hexon蛋白即鸭腺病毒2型dna疫苗。上述技术方案所述的制备方法，其中，步骤(2)的具体步骤为：将seqidno.3所示dav-hexon序列克隆到真核表达载体pcdna3.1上，得到pcdna3.1-dav-hexon质粒。上述技术方案所述的制备方法，其中，步骤(3)的具体步骤为：(a)、转染前3hpbs洗涤293t细胞2次，更换不含血清培养基dmem；(b)、取0.5ug质粒dna溶于50ul无血清dmem中，轻轻混匀，室温静置5min；(c)、将1.5ul的lipohigh转染试剂溶于50ul无血清dmem中，轻轻混匀，室温静置5min；(d)、将步骤(c)制得的含有lipohigh的稀释液加入步骤(b)制得的含有质粒dna的稀释液中，轻轻混匀，室温静置20min；(e)、将步骤(d)制得的上述转染工作液，逐滴滴入步骤(a)制得的对应细胞培养液中，轻轻混匀后置于37℃，5％co2培养箱中培养；(f)、8h后更换含有血清的新鲜培养基；(g)、48h后免疫荧光染色。一种鸭腺病毒2型dna疫苗，其中，所述鸭腺病毒2型dna疫苗是通过上述技术方案所述的制备方法制得。上述技术方案所述的鸭腺病毒2型dna疫苗在制备预防鸭腺病毒2型疫病疫苗中的应用。本发明具有以下有益效果：1、本发明采用先分析hexon蛋白抗原位点的方法，再对hexon片段进行截短表达，有利于抗原蛋白的表达。2、hexon基因序列在真核细胞中进行过密码子优化，相对于从鸭腺病毒2型直接扩增hexon基因进行表达，更适应在真核细胞中表达，更能提高hexon的表达量。3、所述的dna疫苗可根据实际情况采用适宜方式和适宜剂量导入番鸭体内，所述导入方法包括注射、基因枪等方式。4、本发明所制备的dna疫苗可对番鸭提供80％-90％的攻毒保护，为预防鸭腺病毒2型疫病提供了方法。附图说明：1、图1为dav-hexon全长基因琼脂糖凝胶电泳扩增结果。2、图2为鸭腺病毒2型hexon抗原位点预测图谱。3、图3为pcdna3.1-dav-hexon载体图谱。4、图4为pcdna3.1-dav-hexon双酶切鉴定结果。5、图5为免疫荧光检测pcdna3.1-dav-hexon在293t细胞中的表达情况。6、图6为免疫攻毒保护实验解剖图。具体实施方式：为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明一种鸭腺病毒2型dna疫苗及其制备方法和应用作进一步的说明。实施例1：一种鸭腺病毒2型dna疫苗制备的方法具体包括以下步骤：1、鸭腺病毒2型hexon全长基因的获得：从发病鸭的肝脏等组织分离鸭腺病毒，用axygen病毒dna提取试剂盒提取病毒dna，采用引物对hexon全长基因进行扩增，所述引物为：dav-hexon-qc-f：5-agcggagtagcagcatcg-3dav-hexon-qc-r：5-accctggaaaggagttgtcg-3按以下组分制备50μlpcr反应体系：ddh2o10μl，rtaq酶(takara)8μl，病毒dna(100ng/μl)1μl，primer1(20nm)0.5μl,primer2(20nm)0.5μl；pcr反应程序为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性30s，55℃退火3min，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min，1个循环；1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一个2995bp左右的片段，结果见图1。将扩增结果正确的样品送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。2、鸭腺病毒2型hexon基因的截短：因hexon基因长度比较长不利于表达，根据抗原表位预测分析(见图2，图2为鸭腺病毒2型hexon抗原位点预测图谱)，对hexon基因进行截断表达，采用hexon1bp-1500bp片段进行表达研究。3、pcdna3.1-dav-hexon表达载体的构建：对截短的dav-hexon序列进行密码子优化，并在在两端添加hindiii和noti酶切位点，并在c端添加6xhistag有利于检测。优化后的dav-hexon序列见seqidno.3。委托生工生物工程(上海)股份有限公司化学合成seqidno.3序列，并由生工生物工程(上海)股份有限公司将合成的seqidno.3序列克隆到真核表达载体pcdna3.1上，得到pcdna3.1-dav-hexon表达载体，pcdna3.1-dav-hexon表达载体图谱见图3。4、pcdna3.1-dav-hexon的双酶切鉴定：将上述pcdna3.1-dav-hexon重组表达载体分别用hindⅲ+noti在37℃恒温箱中双酶切2h；双酶切体系为：pcdna3.1-dav-hexon质粒1μg，10×mbuffer(takara)2μl，hindⅲ限制性内切酶(takara)1μl，noti限制性内切酶(takara)1μl，ddh20upto20μl；上述双酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图4，图4为pcdna3.1-dav-hexon双酶切鉴定结果，其中泳道m:10000bpdnamarker，泳道1：重组质粒pcdna3.1-dav-hexon用hindiii和noti双酶切鉴定结果。图4结果表明pcdna3.1-dav-hexon载体构建成功。5、pcdna3.1-dav-hexon质粒转染293t细胞：将实验进行分组，分组情况见表1：表1质粒转染及免疫荧光分组情况表组1细胞(不转染)anti-his一抗，fict标记二抗。细胞核dapi染色证明细胞没有非特异表达组2细胞+转染空质粒anti-his一抗，fict标记二抗。细胞核dapi染色证明没有载体污染组3细胞+转染表达质粒anti-his一抗，fict标记二抗。细胞核dapi染色证明是外源基因表达组4细胞+转染表达质粒pbs一抗，fict标记二抗。细胞核dapi染色证明抗体特异a.转染前3hpbs洗涤细胞2次，更换不含血清培养基；b.根据质粒浓度取0.5ug质粒dna溶于50ul无血清dmem中，轻轻混匀，室温静置5min；c.将1.5ul的lipohigh转染试剂(生工生物工程(上海)股份有限公司)溶于50ul无血清dmem中，轻轻混匀，室温静置5min；d.将含有lipohigh的稀释液加入含有质粒dna的稀释液中，轻轻混匀，室温静置20min；e.将上述转染工作液，逐滴滴入对应细胞培养液中，轻轻混匀后置于37℃，5％co2培养箱中培养；f.8h后更换含有血清的新鲜培养基；g.48h后免疫荧光染色。6、间接免疫荧光实验鉴定hexon蛋白表达：a.细胞培养结束后pbs洗三遍，每次5min；b.4％多聚甲醛室温固定30min；c.pbs洗3次，每次5min；d.0.5％tritonx-100处理15min后pbs洗三次，每次5min；e.3％bsa室温封闭30min；f.加一抗：anti-6×hisrabbitpolyclonalantibody(abcam)按1:500比例用含3％bsa的pbs混合液稀释，4℃摇床过夜；g.第二天室温复温1小时；h.pbs洗三次，每次5min；i.二抗：fitc-conjugateddonkeyanti-rabbitigg(abcam)按1:100比例用含3％bsa的pbs混合液稀释，二抗室温孵育1h；j.pbs洗三次，每次5min；k.dapi染色，室温，避光染色10min；l.pbs洗三次，每次5min；m.荧光倒置显微镜观察拍照。实验结果见图5，图5为免疫荧光检测pcdna3.1-dav-hexon在293t细胞中的表达情况。实验结果表明，hexon在293t细胞中特异性表达。7、免疫攻毒保护实验：取10日龄番鸭50只，随机分成5组，每组10只，其中e组不免疫作对照。接种后14天进行同样处理加强免疫。每天观察各组鸭的变化情况(采食活动、精神状态等)，二免后14天所有免疫鸭和对照鸭，肌肉注射鸭腺病毒2型病毒液(105tcid50/0.2ml)，每只0.2ml。观察14天，记录发病情况。结果如表2所示。表2免疫攻毒保护实验结果组别免疫剂量/每只数量(只)免疫方式攻毒保护a200ul含pcdna3.1-dav-hexon质粒200ug10肌肉注射9/10不发病b200ul含pcdna3.1-dav-hexon质粒100ug10肌肉注射8/10不发病c200ul含pcdna3.1-dav-hexon质粒50ug10肌肉注射8/10不发病d200ul含空载体pcdna3.1质粒100ug10肌肉注射10/10发病e200ulpbs10肌肉注射10/10发病免疫组番鸭观察14日，攻毒保护率为80％-90％；空载体组和对照组番鸭攻毒后14日内发病率为100％。分别解剖攻毒的对照攻毒组和免疫攻毒组番鸭发现，对照攻毒组番鸭出现肝脏淤血，些许心包积液情况，免疫攻毒组番鸭正常(图6)，说明构建的鸭腺病毒2型dna疫苗保护效果良好。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。序列表<110>肇庆大华农生物药品有限公司<120>一种鸭腺病毒2型dna疫苗及其制备方法和应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>duckadenovirus<220><221>misc_feature<222>(1)..(18)<400>1agcggagtagcagcatcg18<210>2<211>20<212>dna<213>duckadenovirus<220><221>misc_feature<222>(1)..(20)<400>2accctggaaaggagttgtcg20<210>3<211>1514<212>dna<213>duckadenovirus<220><221>misc_feature<222>(1)..(1514)<400>3aagcttatggccgccctgacccccgatctgaccacagccacacccaggctgagctacttt60cacatcgccggcccctccacaagggagtacctgagcgaggacctgcagcagttcatgagc120gccacaagcagctacttcgagctgaggaacaagttcaggcagacagtggccgcccccaca180aggaacgtgaccaccgagaaggcccagaggctgcagatcaggtactaccccatccagacc240gatgagacaagcaacacccaccgggtccggttcagcatgaacgtgggggatagctgggtg300ctggacatggggagcacctactttgacattaagggggtgctggacaggggcagcagcttt360aagccctacagcggcacagcctacaaccccctggcccccaaggagtccgtgttcaacttc420tggtacacccacaccgatagcaagaactacatcggggcccagctgagcaccctgtacgag480aacaccgatccagggacaggcacccccacacagaacgtggtgaaggccatgagcggggtg540aaccccgaccccaaccaggggagctccatcagcgtgcccgagctgctgatcggggacaca600aacgataacaagttctccggggtggccaaggtggccaaggccgagctgatgctggcccac660ggcgcctacgtgaagccagtcgcccccacaggcagccagtccctgagccagaccggctac720gtgctgagctccgatgggagcaccaagtacaacggggccatctccgtggaggactacaca780agcagcctgcagtaccccgattccctgtacatcccacccaacagcaccgccgtggataac840tttggggtgacaaagggcctgaggcccaactacatcggcttccgggacaacttcattaac900atcctgtaccacgatagcggggtgtgcagcggcaccctcaacagcgagcggagcgggatg960aacgtggtggtcgccctgcaggataggaacaccgagctgagctaccagtacatgctggcc1020gatatgatgagccggcaccactacttcgccctgtggaaccaggccgtggatcagtacgac1080cacgacgtgagggtgtttaacaacgacggctacgaggacgtgagctccagctacgccttt1140taccccaactgcctggggttccagcccggcggcgagctgtacaccaagctgaaggtggtg1200aagaccgattcctccagcggcgccatgagcgggggcgaggtggccaacaccagctccgcc1260ttcggggtgggcaacatccccgcctacgagatcaacatccccgcctccatgaagaggatt1320ttcatcatgagtaacatagctgactacctgcctgataaatataaggtgagtattgatagc1380actgacggcgtggaccagaactcctacgagtacatgaacaagcgggtgcccctgactaac1440atcgtggatctgttcacaaacatcggggcccggtggtccgtcgatcagatggataacgtg1500aaccccgcggccgc1514当前第1页12