参与调控甜瓜苦味素合成的转录因子及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及参与调控甜瓜苦味素合成的转录因子及其应用。

背景技术：

甜瓜的苦味是由一类称为葫芦素b的三萜化合物导致的。甜瓜果实中积累葫芦素b会严重影响甜瓜的口感及品质。最近利用比较基因组学和生物化学、分子生物学方法，研究发现一个由8个基因组成的基因簇参与甜瓜苦味的合成。

尽管已经基本确定了甜瓜中苦味合成的分子机制，但调控苦味形成的分子机制目前还不清楚，相关基因也未被克隆。

技术实现要素：

本发明的目的是提供参与调控甜瓜苦味素合成的转录因子cmbr和cmbt及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的参与调控甜瓜苦味素合成的转录因子cmbr，其氨基酸序列如seqidno:1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

所述转录因子cmbr基因的核苷酸序列如seqidno:3所示。

本发明的参与调控甜瓜苦味素合成的转录因子cmbt，其氨基酸序列如seqidno:2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

所述转录因子cmbt基因的核苷酸序列如seqidno:4所示。

本发明还提供含有所述转录因子cmbr和/或cmbt基因的载体、工程菌、宿主细胞及转基因细胞系。

本发明还提供所述转录因子cmbr在调控甜瓜苦味合成中的应用。

本发明还提供所述转录因子cmbr在无苦味甜瓜分子育种中的应用。

本发明还提供所述转录因子cmbt在调控甜瓜苦味合成中的应用。

本发明还提供所述转录因子cmbt在无苦味甜瓜分子育种中的应用。

本发明还提供一种在植物中瞬时表达目的基因的方法，采用农杆菌介导的方法，将携带有所述转录因子cmbr和/或cmbt基因的表达载体转入植物中，获得目的基因大量表达的转基因植株。

其中，所述植物包括甜瓜、烟草等。

在本发明的一个具体实施方式中，将所述转录因子cmbr或cmbt基因构建到双元表达载体pbin-plus上，利用化学转化导入农杆菌ea105中。用含有目的基因的农杆菌侵染植物组织，培养得到转基因植株。

本发明还提供用于pcr扩增所述转录因子cmbr基因的引物对：

cmbr上游引物：5′-ggatttgaataatgttgagtc-3′

cmbr下游引物5′-ccaaaggacaatactccaaatttgtcaacg-3′

本发明还提供用于pcr扩增所述转录因子cmbt基因的引物对：

cmbt上游引物5′-tcttcaatgttgagtccccct-3′

cmbt下游引物5′-aggataatattccaaattggctaac-3′

在前期黄瓜苦味素合成与调控的研究中，通过突变体测序发现了调控黄瓜叶片苦味合成的转录因子bl，并且还通过遗传定位，转录组分析发现了一个控制黄瓜果实合成的转录因子bt，而此基因的启动子区域的两个突变：sv(structurevariation)和snp，导致了黄瓜苦味表型发生了变化，sv变化使得黄瓜果实由野生的极苦表型变成了苦的表型，而snp的变异使得黄瓜苦味彻底消失，bt基因位于驯化区域内，故bt基因为驯化基因。在黄瓜基因组中，bl、csa5g157220和bt基因组成一个基因簇。我们通过比较基因组学方法，在甜瓜基因组(https://melonomics.net)中也发现了一个由四个basichelix-loop-helix(bhlh)型转录因子组成的基因簇。其中转录因子melo3c005610(cmbr)在甜瓜的根部特异表达，melo3c005611(cmbt)在野生果实中特异表达，这两个转录因子与苦味素合成基因呈现共表达模式，因此，我们推测melo3c005610(cmbr)调控甜瓜根中苦味素的合成，而melo3c005611(cmbt)调控野生果实中苦味素合成。

为了进一步验证，进行了酵母单杂交和凝胶阻滞实验，证明转录因子cmbr和cmbt的确能够结合到苦味素合成基因的启动子区域。此外，还将苦味合成基因的启动子连上报告基因(luc)，在烟草中检测转录因子对启动子区域的激活作用，发现这两个转录因子可以激活报告基因的表达。

由于稳定的甜瓜转基因体系还不成熟，因此，本发明建立了甜瓜子叶瞬时表达系统，利用农杆菌将cmbr和cmbt两个转录因子导入无苦味素的甜瓜子叶中，一周后检测子叶，发现转录因子和合成基因大量表达，从而导致子叶由不苦变成苦。综合上述研究结果，本发明首次发现了在甜瓜根中和野生果实中调控苦味素合成的转录因子，通过调控合成基因的表达从而进一步调控根部和野生果实中苦味的形成。

在前期黄瓜苦味素的合成与调控、驯化研究中发现，控制黄瓜果实苦味的转录因子bt是驯化基因，那么在甜瓜中控制果实苦味的基因cmbt基因是否也是驯化基因，其突变位点的具体位置等。为了解决这个问题，我们对栽培和野生甜瓜基因组中的变异位点做了核酸多样性分析，发现cmbt基因确实位于驯化区域内，由此推测葫芦科植物中存在协同驯化的现象。

本发明进一步揭示了甜瓜苦味形成的分子机制，为无苦味甜瓜育种提供了理论依据和分子辅助育种目标。

附图说明

图1为本发明实施例1中涉及黄瓜苦味素葫芦素c和甜瓜苦味素葫芦素b的化学结构式。

图2为本发明实施例1中用比较基因组学方法来分析调控甜瓜苦味素合成的转录因子。

图3为本发明实施例1中用实时荧光定量pcr，来分析候选转录因子在各个组织中的表达量情况。

图4显示出本发明实施例1中两个转录因子cmbr和cmbt能够直接激活葫芦素b合成基因的表达。

图5为本发明实施例1中用酵母单杂交系统和烟草瞬时表达系统证明cmbr和cmbt可以结合到葫芦素b合成基因的启动子上(a)，并激活下游报告基因转录(b)。

图6为本发明实施例1中用凝胶阻滞系统证明cmbr和cmbt可以结合到葫芦素b合成基因的启动子上；其中，a:cm160(melo3c022377),b:cm170(melo3c022376),c:cm180(melo3c022375),d:cmbi(melo3c022374),e:cmact(melo3c022373),f:cm710(melo3c022372),g:cm490(melo3c023960),h:cm890(melo3c002192),i:cm510(melo3c003387)。

图7为本发明实施例2中用甜瓜子叶瞬时表达系统来证明cmbr和cmbt的生物学功能，当cmbr或cmbt表达后导致苦味合成基因表达升高，最终使苦味物质葫芦素b的含量升高。

图8为本发明实施例3中通过对野生和栽培甜瓜材料核酸多样性分析，发现甜瓜的cmbt基因也位于驯化区域内，故在葫芦科植物中苦味存在协同驯化现象。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1调控甜瓜葫芦素e合成的转录因子挖掘与获得

1、候补基因的挖掘

通过比较发现甜瓜中苦味素葫芦素b和黄瓜中苦味素葫芦素c结构非常相似(图1)，故推测其合成机制应该比较相似，因此我们利用比较基因组学，在甜瓜基因组上发现了存在一个类似于调控黄瓜苦味合成的基因簇(图2)，该基因簇有4个bhlh型转录因子构成，通过荧光定量pcr，进行基因表达量分析，发现基因cmbr在根中特异表达，cmbt基因在野生果实中特异表达，并且两个基因的表达趋势与甜瓜各个组织中的苦味素含量保持一致(图3)，我们根据黄瓜苦味调控的经验，推测cmbr基因应该控制着甜瓜根部苦味素的合成，cmbt控制着果实中苦味素的合成，为了进一步研究cmbt基因的差异，我们比较了栽培甜瓜和野生甜瓜中该基因的序列，但在基因的cds区没有发现变异位点，我们推测应该是启动子区域发生了变异，由于甜瓜基因组拼接错误，没有能够克隆启动子序列。

2、cmbr和cmbt基因的功能验证

首先制备甜瓜根和果实的cdna文库，然后利用正向引物和反向引物进行pcr扩增(引物序列见表1)。

表1引物序列(5′-3′)

pcr反应体系以20μl计为：10-20ng/μl模板1μl，10pmol/μl正向、反向引物各1μl，10mmol/ldntpmix0.4μl，0.5u/μl高保真taqdna聚合酶1μl，10×pcr反应缓冲液2μl，余量为水。

pcr反应条件为：94℃5分钟；94℃20秒，55℃20秒，72℃1分，35个循环；72℃10分钟。

将扩增得到的片段与t-载体(takara)连接，测序确认没有突变。cmbr基因的核苷酸序列seqidno.3所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示，cmbt基因的核苷酸序列seqidno.4所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。

图4表明两个转录因子cmbr和cmbt能够直接激活葫芦素b合成基因的表达。采用酵母单杂交证明cmbr、cmbt能够结合到苦味合成基因cm160(melo3c022377)、cm170(melo3c022376)、cm180(melo3c022375)、cmbi(melo3c022374)、cmact(melo3c022373)、cm710(melo3c022372)、cm490(melo3c023960)、cm890(melo3c002192)和cm510(melo3c003387)的启动子区域(图5a)。此外，还将苦味合成基因的启动子连上报告基因(luc)，在烟草中检测转录因子对启动子区域的激活作用，发现它可以激活报告基因的表达(图5b)。随后，通过凝胶阻滞实验也证明了clbr、clbt与合成基因启动子的互作(图6)。

实施例2利用农杆菌介导的瞬时表达方法验证控制甜瓜苦味合成转录因子的功能

由于稳定的甜瓜转基因体系还不成熟，因此在本实施例中建立了甜瓜子叶瞬时表达系统，进一步验证cmbr和cmbt的功能。

将cmbr和cmbt基因构建到双元载体pbin-plus上。利用化学转化分别导入农杆菌ea105中。将含有目的基因的农杆菌培养至od600约1.0，然后用注射缓冲液稀释到od600约0.4左右，用不带针头的注射器将农杆菌注入10天左右的甜瓜幼苗子叶。一周后收集叶片，用甲醇提取叶片中的化合物，然后进行uplc-q-tof(agilent)检测及相关表达量分析，结果如图7所示。cmbr、cmbt基因在子叶中的表达导致cmbi的基因的表达，从而促使葫芦素b的合成。

实施例3甜瓜cmbt基因属于驯化基因

在前期黄瓜苦味素的合成与调控、驯化研究中发现，控制黄瓜果实苦味的转录因子bt是驯化基因。通过对野生和栽培甜瓜材料核酸多样性分析，发现甜瓜的cmbt基因位于驯化区域内，故在葫芦科植物中苦味存在协同驯化现象(图8)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120>参与调控甜瓜苦味素合成的转录因子及其应用

<130>khp191113962.3d

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>259

<212>prt

<213>甜瓜(cucumismelo)

<400>1

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