一种融合蛋白THG及其应用的制作方法

本发明涉及基因生物工程
技术领域：
，具体涉及一种重组融合蛋白thg的菌株，还涉及一种重组融合蛋白thg的序列信息，还涉及一种能表达重组融合蛋白thg的制备方法，以及一种重组融合蛋白thg在促进鱼类生长、提高鱼类饲料利用率等方面中应用。
背景技术：
：鱼类生长激素(growthhormone，gh)是由鱼脑垂体远端的嗜酸性细胞分泌与合成的一类单链多肽。它在鱼的生长、能量的固定、性腺的发育等方面都具有重要的调节作用，也是水产养殖中一直备受研究者关注的领域。鱼类生长激素能够促进鱼类生长发育，提高饵料利用率，减少饵料的损耗，减少化学类药物的使用，降低对水环境的污染程度，对促进水产业的发展具有重要的经济和社会意义（王伟，汪亚平，朱作言，人工合成草鱼生长激素cdna在大肠杆菌中的表达，遗传学报，2001，28(4)：306～312）。生长激素在鱼类之间具有很高的保守性，不同种鱼的gh都可促进某一种鱼类的生长，表明一种外源生长激素可以对多种鱼类起作用。早期的研究发现，将动物的脑垂体匀浆后，加入饵料中，投喂给鱼，鱼体生长加快，似乎鱼体的肠道能够吸收具有生物活性的生长激素，经研究证实，鱼体的后肠上皮细胞，通过泡饮作用，可以吸收完整的大分子蛋白，具有生物学活性的生长激素可以进入鱼体血液中，从而促进鱼体生长（王伟，孙永华，汪亚平，朱作言，草鱼生长激素在毕赤酵母中的高效分泌表达，遗传学报，2003，30(4)：301～306）。多肽生长激素具有调节和促进生长的作用，是脊椎动物（包括鱼类）体内固有的成分，并可在动物体内自动降解而不影响人类食用。现行的鱼用生长激素，常用注射的方式对鱼类有效，口服或浸泡等方式，效果有限，也就鲜有报道。原因在于，生长激素蛋白分子缺乏穿膜机制。透皮增强肽，也称为蛋白转导域，是目前最强、最快的跨膜转运分子，具有水性、低裂解性并通过非吞噬作用进入各种细胞膜等特点，具有很强的跨膜转运能力，能够携带比其相对分子质量大100倍的外源性大分子进入细胞。同时，现在研究最多、应用范围最广的细胞穿膜肽(trans-activatingtranscriptionalactivator,tat)tat蛋白中存在3个功能结构域，分别是：位于n一端的酸性区，主要起反式激活的功能；位于第22-37位氨基酸之间的dna结合区，该区域富含半胱氨酸；位于第47-60位氨基酸之间的碱性区，是主要的蛋白转导结构域，参与tat蛋白的细胞内化作用。schwarze发现位于tat蛋白中第47-57位之间的11个氨基酸ygrkkrrqrrr不仅能够独立穿过细胞膜，而且其穿膜效率比全长的tat蛋白还要高，这段多肽即是tat穿膜肽。本专利就是将透皮增强肽、鱼用生长激素和分子穿膜肽等三个基因进行柔性融合，获得有穿膜活性的生长激素蛋白，解决了生长激素口服，鱼体不能吸收，效果差的问题。而在这方面，尤其是在多基因片段之间柔性融合方面，更未见报道。技术实现要素：本发明的主要目的是提供了一种thg融合蛋白，其序列为seqidno.2所示。本发明首次将透皮增强肽(tds)、鱼生长激素(gh)、细胞穿膜肽(tat)与融合表达，获得的融合蛋白可以顺利穿过鱼体鳃部细胞和肠道膜细胞，进入鱼体循环系统中，可直接发挥其促生长作用。本发明的另一个目的在于提供了一种thg融合蛋白的制备方法，大肠杆菌escherichiacolibl21（de3）pet28a-thg，工程菌大量表达该融合蛋白。表达量大且可溶，易于工业化生产，成本低，安全性高。本发明的另一个目的是提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，escherichiacolibl21(de3)hsdsgalpet28a-thg，大肠杆菌bl21(de3)hsdsgalpet28a-thg,cctccno：m2018014。该菌株可以表达含透皮增强肽tds、鱼生长激素(gh)、细胞穿膜肽tat等融合蛋白thg，使其能顺利穿过细胞膜进入胞内产生作用，该菌株能大量表达thg蛋白，且操作简便快捷，可更好的应用于工业化生产中，为制备口服促生长制品提供良好的基础。本发明还有一个目的是提供了一种thg表达蛋白在促进草鱼生长中的应用，通过选取大小不同的幼鱼，用一定剂量的融合蛋白分别以剂量对其口服喂食，观察其促生长效果的差异性，可得出最优化的饲养方式。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施。a．tds-gh-tat融合基因的制备。人工合成tds基因、gh基因和tat序列，利用融合pcr技术，实现三段基因序列的柔性融合。先是tds基因和gh基因柔性融合（图1）再是；基因和gh基因，与tat序列的柔性融合（图2）。b．tds-gh-tat融合基因表达载体的构建。用bamh1对tds-gh-tat序列和质粒pet28a（+）进行酶切，并用t4连接酶连接，得到重组质粒pet28a-thg(图3)。c．大肠杆菌基因工程菌的制备。将质粒pet28a-thg转化到表达菌株escherichiacolibl21(de3)（由novagen公司购得，实验室保种）中，pcr鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达thg的大肠杆菌基因工程菌株escherichiacolibl21(de3)hsdsgalpet28a-thg。申请人于2018年1月9日将该菌送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址：中国武汉，武汉大学，分类命名：大肠杆菌bl21(de3)hsdsgalpet28a-thg,cctccno:m2018014，通过上述方法获得了一种大肠杆菌基因工程菌株escherichiacolibl21(de3)pet28a-thg。d．基因工程融合蛋白的制备。将上述基因工程菌escherichiacolibl21(de3)pet28a-thg转接到lb培养基中，经iptg诱导，融合蛋白thg以包涵体的形式表达，且表达效率和纯化的蛋白产率高，如图4，图5所示，其氨基酸序列为seqidno.2所示。e．一种thg融合蛋白促进草鱼生长中的应用，其应用过程是。将大肠杆菌基因工程菌株发酵所得目的蛋白纯化并溶于pbs（ph7.4，含1.0-2.0mm的l-精氨酸）中，并对蛋白进行定量检测，得到目的蛋白含量为1.0mg/ml的thg融合蛋白，对草鱼生长和免疫机理的检测是饲养5周后，对每一周每一组的草鱼进行测量体重、体长，根据测算的数据，求算出草鱼的增长率、增重率、肥满度和生存率，以此为依据对草鱼生长情况进行分析，实验结果表明，thg蛋白，无论是浸泡还是口服，对鱼类生长均有较好的促进作用（图6，图7）。与现有技术相比，本发明具有以下优点。a．将透皮增强肽tds、鱼生长激素(gh)和细胞穿膜肽tat进行柔性融合，获得融合蛋白，活性强，穿膜效果好，可以顺利穿过鱼体鳃部和肠道膜细胞，进入鱼体循环系统中发挥其促生长作用，比单纯的tat-gh融合效果要强。b．选取了大肠杆菌作为表达系统，比酵母表达系统或其他植物系统，其操作简单，生长周期短，产量高，成本低，适用于大规模的工业化生产中。同时，本研究中所用的融合基因序列已经过了优化，表达效率显著高于未改造前。c.本方法生产的口服型和浸泡型渔用生长激素，给药方式比传统的注射方法，省事省力。附图说明。图1为tds与gh融合图。图1中：m，dl2000分子标准；1，tds序列片段；2，gh基因片段；3，tds-gh融合片段。图2为tds与gh，和tat序列的融合图。图2中，m，dl2000分子标准；1，tds-gh融合片段；2，tat序列片段；3，thg（tds-gh-tat）基因片段。图3为融合表达载体pet28a-thg的构建。在图3中，m，dl5000分子标准；1，thg基因片段；2，pet28a-thg质粒经bamhi酶切。图4为pet28a-thg原核诱导融合示意图。在图4中，m,蛋白分子标准。1,诱导前的总蛋白；2,诱导后的总蛋白；3，菌体超声处理后上清中的总蛋白；4,菌体超声处理后下部分的蛋白。图5为westernblot验证纯化后的thg融合蛋白。在图5中，m,蛋白分子标准；1，纯化的thg融合蛋白经westernblot检测。图6为thg融合蛋白的口服拌料投喂后，草鱼的增重率。图7为thg融合蛋白的浸泡草鱼后，草鱼的增重率情况。具体实施方式本实验中所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的请参见《分子克隆实验指南》j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔等主编。实施例一：融合基因thg的制备。1）tat核苷酸片段的生成。上游引物tdf1一条，下游引物tdr一条，一次聚合合成。tdf1:ggatccatggcctgcagctcgaagaaatccaagcactgcggcggcagcggcagcggc。tdr:gatgactgcgttgttgaagagccgctggttctctgacatgctgccgctgccgctgcc。先将两条引物分别配成10μm/l混合后，95℃加热10min后，室温冷却l.0h后，生成tds核苷酸片段，4℃保存备用。其生成的细胞穿膜肽tds及柔性联系序列为：ggatccatggcctgcagctcgaagaaatccaagcactgcggcggcag。2）tat与tds和gh的柔性融合。以tat和人工合成的tds和gh为模板，经pcr扩增得thg融合基因，在引物中加入bamh1酶切位点，以利于后续的重组质粒构建工作，设计的特异引物序列如下。tatf:ctgggcggctccggcagcggcggctccggcagcggcggctccggcagctacgcgcgcgc。tatr:gctcatctttctcagacgcgcgggcctggcgggccgcggcgcgcgcgtagctgcc。pcr反应的总体积为50μl，pcr扩增条件为：热启动（94℃，5min），继续进行35个循环，每一循环的程序为94℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30sec，最后一个延伸反应（72℃，5.0min)取扩增产物5.0μl在1.2％琼脂糖凝胶上电泳，eb染色后，紫外灯下观察，拍照，扩增产物用pcr纯化试剂盒纯化。实施例二：thg融合基因的表达载体构建和工程菌株的获得。用bamh1酶切pet28a并进行末端磷酸化处理，纯化并回收pet28a载体，同时用bamh1酶切thg片段，将目的片段thg与开环pet28a载体，在16℃连接过夜，转化大肠杆菌tp10感受态细胞；其步骤和方法，按照《分子克隆实验指南》进行；选取5个克隆进行测序，鉴定方向和序列信息正确的菌株，提取质粒，并和escherichiacolibl21(de3)感受态细胞冰浴30min。42℃水浴中热激90sec，速移至冰水中2-3min，无菌下，加入600μ1液体lb培养基，37℃，100rpm轻摇，温浴45min使细胞复苏。取上述菌液150ul,用无菌三角玻棒均匀涂布在50μg/mlkan的lb平板上，正向放置1-2h，直至液体被全部吸收，倒置于37℃培养箱中培养过夜。选取5个克隆进行测序，鉴定thg插入到pet-28a载体中的方向和序列信息，分析编码框的完整性。由此法可得到escherichiacolibl21(de3)hsdsgalpet28a-thg菌落。实施例三：基因工程融合蛋白thg的诱导表达和纯化。重组基因工程菌株escherichiacolibl21(de3)pet-28a-thg的单菌落接种到10ml新鲜液体lb(含终浓度为50ug/ml卡那霉素)培养基中。37℃150rpm摇床培养过夜。无菌条件下，从培养过夜的菌中，取出0.5ml菌液接种到50ml的新鲜液体lb中，37℃培养箱中200rpm摇床培养4.0h，再从培养液中，取出2.0ml菌液接种到200ml的新鲜液体lb中，37℃，200rpm摇床培养4.0h，取至od600为0.8时（约4h）加入终浓度为0.5mmiptg，37℃诱导4h后，离心6000g,4℃,10min收集菌体，用10mmpbs（ph8.0）重悬超声波破壁，离心收集上清和沉淀并用sds-page电泳检测目的蛋白的表达。以优化后的条件扩大培养，超声波破壁后，离心12000g,4℃,20min收集沉淀，并用尿素变性液在4℃冰箱中溶解处理过夜，4℃离心12000g,30min收集上清。融合蛋白thg的纯化按ni-nta说明书进行，用sds-page检测蛋白纯化结果。得到纯化的thg蛋白，其序列为seqidno.2所示。实施例四：融合蛋白thg的抗体制备和westernblot鉴定。纯化的thg融合蛋白与弗氏不完全佐剂等量混合，腹腔注射bal/c小白鼠5只，间隔2周免疫1次，共三次，最后1次免疫后第7天，从小白鼠眼眶取少量的血，37℃温箱中作用2h后，4℃放置过夜，取上清采用elisa检测效价。如达到1:10000，就可大量取血，同上制备血清。thg的鼠源抗血清，4℃保存备用。纯化后的融合蛋白thg，经sds-page电泳，转膜，利用thg的鼠源抗血清进行westernblot鉴定，证明纯化后的融合蛋白thg是所需要的蛋白，且特异性好。实施例五：分光光度法测定蛋白含量。a．试剂准备。1）将样品用蒸馏水做适当倍数的稀释。2）取1.5ml离心管，按照下表的比例分别加入各溶液，其中0号管为空白对照。溶液管号12345双蒸水(μl)10009008007507001mg/mlbsa(μl)0100200250300bsa浓度(μg/ml)0100200250300b．具体步骤。1）选取酶标板上7个孔，分为标准组和样品组。标准组：5个孔，每个标准品设置1个重复，各孔分别加入150μl相应浓度的标准蛋白质溶液；对应管编号为0、1、2、3、4、5。样品组：剩余2孔，分为2个重复组，同一重复组编号相同。其中编号不同的两孔分别加入浓度不同的150μl样品稀释液。2）各酶标孔加入150μlbradord工作液，迅速混匀。3）室温25-30℃，反应5min后，以0号管为空白对照，在酶标仪上测各孔的a595值。4）以标准组各孔a595平均值为纵坐标，对应的蛋白质浓度为横坐标，在microsoftexcel软件中绘制标准曲线。5）根据两个相同样品稀释液a595值的平均值，在标准曲线上计算出该样品经过稀释后的蛋白质浓度，选择合适稀释度的样品计算最终的样品蛋白浓度，再由稀释倍数计算原样品蛋白质浓度。c．最终将目的蛋白溶于pbs（ph7.4，含1.0—2.0mm的l-精氨酸）中，并根据标准曲线，将thg融合蛋白浓度调整到1.0mg/ml。实施例六：鱼类口服thg蛋白促生长实验。选取规格整齐的草鱼作为实验对象，先对实验鱼进行训养3周后，随机对鱼进行分组实验。对草鱼生长和免疫机理的检测是饲养5周后，对每一周每一组的草鱼进行测量体重、体长，根据测算的数据，求算出草鱼的增长率、增重率、肥满度和生存率，以此为依据对草鱼生长情况进行分析。实验分组、投喂添加剂量及投喂方式如下。（1）对照组：a组、d组、f组，投喂普通饲料添加pet28a（载体）蛋白的0.02%。（2）实验组，b组、c组、e组，thg拌喂组，thg蛋白先和少量饲料颗粒混匀，后再和大量饲料混合，最后，thg蛋白占饲料的0.02%。a、b、c、d、e、f、g、h等6箱，每箱15尾鱼，充氧。每天上午9点投喂，投喂鱼体总重的3%，每天下午16点30分换水，每次换水量约为总水位的三分之一。每周测量一次鱼的体长和体重，并记录。结果如图6。实施例七：鱼类浸泡thg融合蛋白后的生长实验。选取规格整齐的草鱼作为实验对象，先对实验鱼进行训养3周后，随机对鱼进行分组实验。对草鱼生长和免疫机理的检测是饲养5周后，对每一周每一组的草鱼进行测量体重、体长，根据测算的数据，求算出草鱼的增长率、增重率、肥满度和生存率，以此为依据对草鱼生长情况进行分析。实验分组、投喂添加剂量及投喂方式如下。（1）对照组：a组、d组、f组，浸泡pet28a（载体）蛋白占水体体积量的0.05%，浸泡时间30min。（2）实验组，b组、c组、e组，thg浸泡组，thg蛋白占水体体积量的0.05%，浸泡时间30min。a、b、c、d、e、f、g、h等6箱，每箱15尾鱼，充氧。每天上午9点投喂，投喂鱼体总重的3%，每天下午16点30分换水，每次换水量约为总水位的三分之一。每周测量一次鱼的体长和体重，并记录。结果如图7。序列表<110>鲁东大学<120>一种融合蛋白thg及其应用<141>2019-06-17<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>723<212>dna<213>口服型草鱼生长激素基因(escherichiacoli)<400>1ggatccatggcctgcagctcgaagaaatccaagcactgcggcggcagcggcagcggcagc60atgtcagagaaccagcggctcttcaacaacgcagtcatccgtgtccagcacctgcaccag120ctggctgcagagatgatcaacgacttcgaggacaacctgttgcctgaggaacgcagacag180ctgagcaagatcttccctctgtccttctgcaactccgactccatcgaggcgcccactggc240aaggacgagacgcagaagagctccatgctgaagctccttcgcatctcgttccgcctcatc300gagtcctgggagttccccagccagaccctgagcggagccgtctcgaacagtctgaccgtc360ggaaaccccaaccagatcaccgagaagctggccgacctgaaggtgggcatcagcgtgctc420atcaagggatgcctggacggtcagccaaacatggatgacaacgactccctgccactgccg480ttcgaggacttctacctgaccatgggggagagcagcctcagagagagcttccgtcttctg540gcttgcttcaagaaggacatgcacaaggtggagacctacctgagggtagcgaactgcagg600agatccctggactcaaactgcaccctgggcggctccggcagcggcggctccggcagcggc660ggctccggcagctacgcgcgcgccgcggcccgccaggcccgcgcgtctgagaaagatgag720cta723<210>2<211>241<212>prt<213>口服型草鱼生长激素基因(escherichiacoli)<400>2glysermetalacysserserlyslysserlyshiscysglyglyser151015glyserglysermetsergluasnglnargleupheasnasnalaval202530ileargvalglnhisleuhisglnleualaalaglumetileasnasp354045phegluaspasnleuleuproglugluargargglnleuserlysile505560pheproleuserphecysasnseraspserileglualaprothrgly65707580lysaspgluthrglnlyssersermetleulysleuleuargileser859095pheargleuileglusertrpglupheproserglnthrleusergly100105110alavalserasnserleuthrvalglyasnproasnglnilethrglu115120125lysleualaaspleulysvalglyileservalleuilelysglycys130135140leuaspglyglnproasnmetaspaspasnaspserleuproleupro145150155160phegluaspphetyrleuthrmetglygluserserleuarggluser165170175pheargleuleualacysphelyslysaspmethislysvalgluthr180185190tyrleuargvalalaasncysargargserleuaspserasncysthr195200205leuglyglyserglyserglyglyserglyserglyglyserglyser210215220tyralaargalaalaalaargglnalaargalaserglulysaspglu225230235240leu当前第1页12