一种葛根多糖脱蛋白的方法与流程

本发明涉及葛根多糖提纯
技术领域：
，特别是指一种葛根多糖脱蛋白的方法。
背景技术：
：葛根(radixpuerariae)是多年生豆科葛属植物的块根，始载于《神农本草经》，具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻等功效。随着现代医药、食品科技的不断发展，葛根的使用价值越来越引起人们的关注，我国葛根资源极为丰富，除新疆、西藏、青海外，各省均有分布，葛根的主要组成为淀粉、纤维素、蛋白质、总黄酮和多糖等。多糖因其生物学活性而受到世界各国科学工作者的重视，大量的动物和临床实验表明其在人类健康上扮演着重要的角色，如抗氧化、抗凝血、抗辖射、抗hiv、抗癌、降低血糖、增强免疫等生物活性。多糖的结构决定了其具有广泛的生物学活性，多糖的纯化是多糖结构分析的前提。去除蛋白质是多糖纯化的重要一步，天然植物水提取液中多糖多与游离蛋白质共存。多糖提取液脱蛋白的主要方法有sevage法、三氯乙酸法和三氟三氯乙烷法。其中，sevage法条件温和，是脱蛋白的经典方法，但需要反复处理样品多次，致使多糖损失严重且方法烦琐，而且使用有机溶剂，容易造成环境污染；三氯乙酸法操作时沉淀现象比sevage法明显，但脱蛋白时易损失较多多糖，对多糖结构影响较大，脱蛋白的效果较差；三氟三氯乙烷法脱除蛋白的效率较高，但溶剂沸点较低、易挥发，不宜大量应用。“一种芒果加工副产物多糖脱蛋白及脱色方法”(申请号cn201710394098)使用tca正丁醇法，属于有机溶剂脱蛋白，易造成污染环境；“一种状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化方法”(申请号cn201710249849)，虽然没有使用有机溶剂，而是使用d113弱酸性阳离子交换树脂脱蛋白，但是优化后最高蛋白去除率为91.11％，无法满足多糖纯化的要求。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提出一种葛根多糖脱蛋白的方法，以解决现有技术中全部或者部分不足之处。基于上述目的本发明提供的一种葛根多糖脱蛋白的方法，将葛根多糖溶于去离子水中，配成葛根多糖溶液，经离心过滤后，采用聚酰胺对葛根多糖溶液进行脱蛋白处理，收集经聚酰胺处理后的多糖溶液，经旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得去除蛋白的葛根多糖。可选的，所述脱蛋白处理的方法为聚酰胺水浴静态法或聚酰胺柱洗脱动态法。可选的，所述聚酰胺水浴静态法中，葛根多糖溶液的浓度为1～3mg/ml，聚酰胺为80～100目的颗粒，添加量为1～5g/l。可选的，所述聚酰胺水浴静态法中，水浴振荡1～3h，温度为30～60℃，转速120～180r/min。可选的，所述聚酰胺柱洗脱动态法中，葛根多糖溶液的浓度为10～30mg/ml，聚酰胺柱规格600×30mm，流动相为蒸馏水。可选的，聚酰胺柱洗脱动态法中，流速为1～3ml/min，收集器2～4min转一次，并采用苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱溶液。可选的，所述脱蛋白处理中的聚酰胺均为预处理的聚酰胺，预处理方法如下：用浓度75％～85％乙醇溶液处理聚酰胺，去除溶于乙醇的杂质，用蒸馏水将聚酰胺洗脱至中性。可选的，所述旋转蒸发浓缩，采用聚酰胺水浴静态法的浓缩至原体积的1/5～1/4；采用聚酰胺柱洗脱动态法的浓缩至原体积的1/10～1/8。可选的，离心过滤的转速，采用聚酰胺水浴静态法离心转速为3000～4000r/min，时间为15～25min；采用聚酰胺柱洗脱动态法离心转速为8000～10000r/min，时间为10～15min。可选的，所述冷冻干燥的温度为-85℃。从上面所述可以看出，本发明提供的一种葛根多糖脱蛋白的方法，采用聚酰胺水浴静态法或聚酰胺柱洗脱动态法，去除葛根粗多糖游离蛋白方法，解决葛根粗多糖纯化过程中的脱蛋白问题，本发明葛根多糖蛋白去除率高；同时多糖保留率高；操作简便，处理条件温和，洗脱液为蒸馏水，避免了大量有机溶剂的使用，绿色环保，聚酰胺可以反复利用，同时还可以根据葛根多糖溶液的量选择聚酰胺水浴静态法或聚酰胺柱洗脱动态法，具有节约原料，提高提高蛋白去除率和多糖保留率，测试数据显示采用聚酰胺水浴静态法的蛋白去除率为93％时，多糖保留率为90％，采用聚酰胺柱洗脱动态法蛋白去除率为96％时，多糖保留率为80％。附图说明图1为本发明实施例聚酰胺提纯原理示意图。具体实施方式为下面通过对实施例的描述，本发明的具体实施方式如所涉及的制造工艺及操作使用方法等，作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。本发明实施例提供的一种葛根多糖脱蛋白的方法，将葛根多糖溶于去离子水中，配成葛根多糖溶液，经离心过滤后，采用聚酰胺对葛根多糖溶液进行脱蛋白处理，收集经聚酰胺处理后的多糖溶液，经旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得去除蛋白的葛根多糖。聚酰胺结构中主链节含有极性重复单位酰胺键-co-nh-和非极性的脂肪键，是一个相对弱极性的化合物，当移动相为极性强的溶剂，如水、乙醇、丙醇时，聚酰胺作为非极性固定相，其吸附行为类似反向分配层析，极性较大的蛋白质吸附物易被洗脱，从而保留葛根多糖。本发明实施例提供的一种葛根多糖脱蛋白的方法，采用聚酰胺水浴静态法。将葛根多糖溶于去离子水中，配成浓度为1mg/ml的葛根多糖溶液，在转速为4000r/min下离心20min，去除不溶于水的杂质，然后每升多糖溶液加入80～100目预处理聚酰胺5g，水浴振荡2h，温度为30℃，转速160r/min，而后抽滤得经聚酰胺处理过后的葛根多糖溶液，经旋转蒸发浓缩至原体积的1/5后，-85℃冷冻干燥得去除蛋白的葛根多糖样品1，其中，预处理聚酰胺是用体积分数为75％～85％的乙醇，去除溶于乙醇的杂质，用去离子水洗脱至中性。将葛根多糖溶于去离子水中，配成浓度为3mg/ml的葛根多糖溶液，在转速为3000r/min下离心15min，去除不溶于水的杂质，然后每升多糖溶液加入80～100目预处理聚酰胺1g，水浴振荡1h，温度为40℃，转速120r/min，而后抽滤得经聚酰胺处理过后的葛根多糖溶液，经旋转蒸发浓缩至原体积的1/4后-85℃冷冻干燥得去除蛋白的葛根多糖样品2。其中，预处理聚酰胺是用体积分数为75％～85％的乙醇，去除溶于乙醇的杂质，用去离子水洗脱至中性。将葛根多糖溶于去离子水中，配成浓度为2mg/ml的葛根多糖溶液，在转速为3500r/min下离心25min，去除不溶于水的杂质，然后每升多糖溶液加入80～100目预处理聚酰胺2g，水浴振荡3h，温度为60℃，转速160r/min，而后抽滤得经聚酰胺处理过后的葛根多糖溶液，经旋转蒸发浓缩至原体积的1/5后-85℃冷冻干燥得去除蛋白的葛根多糖样品3。其中，预处理聚酰胺是用体积分数为75％～85％的乙醇，去除溶于乙醇的杂质，用去离子水洗脱至中性。本发明实施例提供的一种葛根多糖脱蛋白的方法，采用聚酰胺柱洗脱动态法。将葛根多糖溶于蒸馏水中，配成浓度为20mg/ml的葛根多糖溶液，在转速为10000r/min下离心15min，去除不溶于水的杂质，然后将葛根多糖溶液采用恒流泵从经预处理的聚酰胺柱(600×30mm)上端加入到聚酰胺柱，流动相为蒸馏水，恒流泵的速度设置保持为2ml/min，部分收集器4min转一次，采用苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱溶液，收集葛根多糖溶液，经旋转蒸发浓缩至原体积的1/10后，-85℃冷冻干燥得去除蛋白的葛根多糖样品4；其中，聚酰胺柱预处理是用75％～85％乙醇为流动相，流速为1～3ml/min去除溶于乙醇的杂质，用蒸馏水洗脱至中性。将葛根多糖溶于蒸馏水中，配成浓度为10mg/ml的葛根多糖溶液，在转速为8000r/min下离心10min，去除不溶于水的杂质，然后将葛根多糖溶液采用恒流泵从经预处理的聚酰胺柱(600×30mm)上端加入到聚酰胺柱，流动相为蒸馏水，恒流泵的速度设置保持为3ml/min，部分收集器2min转一次，采用苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱溶液，收集葛根多糖溶液，经旋转蒸发浓缩至原体积的1/8后，-85℃冷冻干燥得去除蛋白的葛根多糖样品5；其中，聚酰胺柱预处理是用75％～85％乙醇为流动相，流速为1～3ml/min去除溶于乙醇的杂质，用蒸馏水洗脱至中性。将葛根多糖溶于蒸馏水中，配成浓度为30mg/ml的葛根多糖溶液，在转速为10000r/min下离心12min，去除不溶于水的杂质，然后将葛根多糖溶液采用恒流泵从经预处理的聚酰胺柱(600×30mm)上端加入到聚酰胺柱，流动相为蒸馏水，恒流泵的速度设置保持为1ml/min，部分收集器4min转一次，采用苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱溶液，收集葛根多糖溶液，经旋转蒸发浓缩至原体积的1/9后，-85℃冷冻干燥得去除蛋白的葛根多糖样品6；其中，聚酰胺柱预处理是用75％～85％乙醇为流动相，流速为1～3ml/min去除溶于乙醇的杂质，用蒸馏水洗脱至中性。采用考马斯亮蓝g-250法测量葛根多糖的蛋白质含量，苯酚-硫酸法测葛根多糖的多糖含量。其中，蛋白去除率(％)＝(w1-w2)/w1×100％，w1、w2分别是脱蛋白前后蛋白质的含量；多糖保留率(％)＝m2/m1×100％，m1、m2分别是脱蛋白前后的多糖含量。对本发明实施例制备的葛根多糖样品1～6采用上述方法进行测试，测试结果如下。项目蛋白去除率多糖保留率样品195％89％样品290％93％样品393％90％样品494％82％样品591％85％样品696％80％采用聚酰胺水浴静态法或聚酰胺柱洗脱动态法，去除葛根粗多糖游离蛋白方法，解决葛根粗多糖纯化过程中的脱蛋白问题，本发明葛根多糖蛋白去除率高；同时多糖保留率高；操作简便，处理条件温和，洗脱液为蒸馏水，避免了大量有机溶剂的使用，绿色环保，聚酰胺可以反复利用，同时还可以根据葛根多糖溶液的量选择聚酰胺水浴静态法或聚酰胺柱洗脱动态法，具有节约原料，提高提高蛋白去除率和多糖保留率，测试数据显示采用聚酰胺水浴静态法的蛋白去除率为93％时，多糖保留率为90％，采用聚酰胺柱洗脱动态法蛋白去除率为96％时，多糖保留率为80％。聚酰胺结构中主链节含有极性重复单位酰胺键-co-nh-和非极性的脂肪键，是一个相对弱极性的化合物，当移动相为极性强的溶剂，如水、乙醇、丙醇时，聚酰胺作为非极性固定相，其吸附行为类似反向分配层析，极性较大的蛋白质吸附物易被洗脱，从而保留葛根多糖。所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12