一种融合基因、重组表达载体、抗原及其制备方法和应用与流程

文档序号：18458086发布日期：2019-08-17 01:46阅读：438来源：国知局

本发明涉及兽用生物制品技术领域，特别涉及融合基因、重组表达载体、抗原及其制备方法和应用。

背景技术：

禽流感病毒(avianinfluenzavirusaiv)是禽类及一些哺乳动物的呼吸系统的重要病原，在分类学上属于正粘病毒科流感病毒属。根据表面的蛋白抗原性不同，禽流感病毒被分为17种亚型血凝素(ha)和10种亚型神经氨酸酶(na)，其中，h9n2亚型禽流感病毒在世界范围内广泛流行，引起蛋鸡产蛋量显著下降，饲料报酬降低等，给养禽业造成了巨大的经济损失，并且对人类健康造成危险。流感病毒对宿主的致病性是由多个基因决定的，其中ha基因及其编码的蛋白尤为重要，在病毒吸附及穿膜过程中起着关键作用，是重要的表面抗原，它刺激机体产生中和抗体，可中和病毒的感染。

禽腺病毒(fav)呈世界性分布，血清型众多，该病毒引起的肉鸡心包积水综合症就是由禽腺病毒-c血清4型腺病毒感染引起，全国各地对于该病均有报道，3～5周龄肉鸡发病尤为危害，严重时死亡率突然上升至80％以上，严重危害我国养禽业健康发展。

目前针对以上两种对家禽养殖业危害极大的疫病，疫苗防控是最有效的方式。然而在现有技术中，利用鸡胚繁殖病毒制备禽流感疫苗的生产过程中涉及活病毒操作，会对环境的生物安全产生威胁。同时在禽流感流行时由于受到鸡胚供应的限制，疫苗生产存在生产周期长和产量低等缺点。而禽腺病毒则不易培养，难以获得高滴度的病毒，尤其是不同分离株差异较大，导致制备的疫苗往往难以提供理想的免疫效果。

基于上述问题，采用基因工程发酵的方式是克服上述问题的可选手段，申请人青岛易邦生物工程有限公司于2017年申请了一项专利申请cn201710674039.5，其公开了一种新城疫、禽流感、法氏囊和禽腺病毒四联疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原是新城疫lasota病毒株,保藏编号为cctccno:v201517的h9亚型禽流感病毒株、由法氏囊vp2蛋白和氨基酸序列为seqidno:2的禽腺病毒hexon蛋白和鸡α-干扰素蛋白。

所以基于基因工程发酵进行抗原的生产是现在广泛的、正在被本领域技术人员广泛研究的一项生物技术。

在禽流感和腺病毒二联疫苗中，现在普遍采用的方法将禽流感病毒液、腺病毒病毒液作为混合抗原生产二联疫苗，如申请人青岛易邦生物工程有限公司于2016年申请了一项专利申请cn201610099573.3，其公开了一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗，本发明的疫苗所使用的h9亚型禽流感病毒qdy株和i群4型禽腺病毒ybav-4株新毒株的tcid50/eid50效价高、免疫原性好并能抵御h9亚型及禽腺病毒病各地方分离毒的攻击。其制备的疫苗的安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，结果与同类产品的单苗相比较，二联苗无明显差异，均稳定有效；效力试验结果证明，二联苗和二种单苗抗体均保持高水平，比同类产品产生抗体快，而对照组抗体为阴性。

但是，上述的方案存在的问题在于：单独生产禽流感病毒和腺病毒，其工艺步骤多；如果基于基因工程的原理进行亚单位疫苗的制备，虽然可以简化工艺步骤，但是如何筛选得到有效的抗原决定簇，特别同时筛选出两个有效的抗原决定簇是一个难题。

更进一步的问题在于：即使筛选出了两个或多个有效的抗原决定簇，如何提高其在亚单位疫苗中的表现效果也是一个非常困难的现实性问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种融合基因，同时，本发明还公开了一种重组表达载体、抗原及其制备方法和应用；该融合基因采用禽流感h9亚型ha基因、腺病毒4型fiber2基因、特异性连接肽片段基因进行融合，该基因对应的表达蛋白抗原能够诱导家禽产生高水平的特异性抗体，保护家禽免受禽流感和禽腺病毒的感染。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种融合基因，如序列表seqidno：1所示。

融合基因序列为：

atggaagtagtatcactaataactatactactagtagcaacagtaagcaatgcagataaaatctgcatcggctatcaatcaacaaactccacagaaactgtggacacactaacagaaaacaatgtccctgtgacacatgccaaagaactgctccacacagagcataatgggatgctgtgtgcaacaagcttgggacaacctcttattttagacacctgcaccattgaagggctaatctatggcaatccttcttgtgatctatcgctggaaggaagagaatggtcctatatcgtcgagagaccatcagctgtcaacggattgtgttaccccgggaatgtagaaaatctagaagagctaaggtcactttttagttctgctaggtcttatcaaagaatccagattttcccagacacaatctggaatgtgtcttacgatgggacaagcacagcatgctcaggttcattctacagaagcatgagatggttgactcgaaagaacggcgattaccctgtccaagacgcccaatacacaaataatcaagggaagaacattcttttcatgtggggcataaatcacccacccaccgatactacgcagagaaatctgtacacgagaaacgacacaacaacgagtgtggcaacagaagaaataaataggatcttcaaaccattgataggaccaaggcctcttgtcaacggtttgatgggaagaattgattattattggtctgtattgagaccgagtcaaacactgcgaataaaatctgatgggaatctaatagctccatggtatggacacattctttcaggagagagccacggaagaattctgaagactgatttaaaaaggggtagctgcacagtgcaatgtcagacagagaaaggtggcttaaacacaacactgccattccaaaatgtaagtaagtatgcatttggaaactgctcaaaatacattggcataaagagtctcaaacttgcagttggtctgaggaatgtgccttctagatctagtagaggactattcggggccatagcagggtttatagagggaggttggtcagggctagttgctggttggtatgggttccagcattcaaatgaccaaggggttggtatggcagcagatagagactcaacccaaaaggcaattgataaaataacatccaaagtgaataatatagtcgacaaaatgaacaagcagtatgaagtcattgatcatgaattcagtgaggtagaaactagacttaacatgatcaataataagattgatgatcaaatccaggatatatgggcatataatgcagaattgctagttctgcttgaaaaccagaaaacactcgatgagcatgacgcaaatgtaaacaatctatataataaagtaaagagggcgttgggttccaacgcggtggaagatgggaaaggatgtttcgagctataccacaaatgtgatgaccaatgcatggagacaattcgaaacgggacctacaacagaaggaagtatcaagaggagtcaaaattagaaagacagaaaatagagggggtcaagctggaatctgaaggaacttacaaaatcctcaccatttattcgactgttgcctcatctcttgtgattgcaatggggtttgctgccttcttgttctgggccatgtccaatgggtcttgcagatgcaacatttgtatataacctgaagtcctgcctcctctgcctaaggaatctagaatttccgaaggtgaagctgtcgtcgtcggtatgctccgggcccctaaaagaagacattccgaaaacgggaagcccgagaccgaagcgggaccttccccggctccaatcaagcgcgccaaacgcatggtgagagcatcccagcttgacctggtttatcctttcgattacgtggccgaccccgtcggagggctcaacccgccttttttgggaggctcaggacccctagtggaccagggcggacagcttacgctcaacgtcaccgatcccatcatcatcaagaacagatcggtggacttggcccacgaccccagtctcgatgtcaacgcccaaggtcaactggcggtggccgttgaccccgaaggggccctggacatcacccccgatggactggacgtcaaggtcgacggagtgaccgtaatggtcaacgatgactgggaactggccgtaaaagtcgacccgtccggcggattggattccaccgcgggtggactgggggtcagcgtggacgacaccttgctcgtggatcagggagaactgggcgtacacctcaaccaacaaggacccatcactgccgatagcagtggtatcgacctcgagatcaatcctaacatgttcacggtcaacacctcgaccggaagcggagtgctggaactcaacctaaaagcgcagggaggcatccaagccgccagttcgggagtgggcgtttccgtggatgaaagcctacagattgtcaacaacactctggaagtgaaaccggatcccagcggaccgcttacggtctccgccaatggcctagggctgaagtacgacactaataccctagcggtgaccgcgggcgctttaaccgtggtcggaggggggagcgtctccacacccatcgctacttttgtctcgggaagtcccagcctcaacacctacaatgccacgaccgtcaattccagcgcgaacgccttctcttgcgcctactaccttcaacagtggaacatacaggggctccttgttacctccctctacttgaaattggacagcgccaccatggggaatcgccctggggacctcaactccgccaatgccaaatggttcaccttttgggtgtccgcctatctccagcaatgcaacccctccgggattcaagcgggaacggtcagcccctccaccgccaccctcacggactttgaacccatggccaataggagcgtgaccagcccatggacgtactcggccaatggatactatgaaccatccatcggggaattccaagtgttcagcccggtggtaacaggtgcctggaacccgggaaacatagggatccgcgtcctccccgtgccggtttcggcctccggagagcgatacacccttctatgctatagtctgcagtgcacgaacgcgagcatttttaatccaaacaacagcggaaccatgatcgtgggacccgtgctctacagctgtccagcggcctccctcccgtaa

上述带下划线的部分：cctgaagtcctgcctcctctgcctaaggaatctagaatttccgaaggtgaagctgtcgtcgtcgg为特异性连接肽片段基因位置。

禽流感h9亚型ha基因序列为(如序列表seqidno：4所示)：

腺病毒4型fiber2基因序列为(如序列表seqidno：5所示)：

atgctccgggcccctaaaagaagacattccgaaaacgggaagcccgagaccgaagcgggaccttccccggctccaatcaagcgcgccaaacgcatggtgagagcatcccagcttgacctggtttatcctttcgattacgtggccgaccccgtcggagggctcaacccgccttttttgggaggctcaggacccctagtggaccagggcggacagcttacgctcaacgtcaccgatcccatcatcatcaagaacagatcggtggacttggcccacgaccccagtctcgatgtcaacgcccaaggtcaactggcggtggccgttgaccccgaaggggccctggacatcacccccgatggactggacgtcaaggtcgacggagtgaccgtaatggtcaacgatgactgggaactggccgtaaaagtcgacccgtccggcggattggattccaccgcgggtggactgggggtcagcgtggacgacaccttgctcgtggatcagggagaactgggcgtacacctcaaccaacaaggacccatcactgccgatagcagtggtatcgacctcgagatcaatcctaacatgttcacggtcaacacctcgaccggaagcggagtgctggaactcaacctaaaagcgcagggaggcatccaagccgccagttcgggagtgggcgtttccgtggatgaaagcctacagattgtcaacaacactctggaagtgaaaccggatcccagcggaccgcttacggtctccgccaatggcctagggctgaagtacgacactaataccctagcggtgaccgcgggcgctttaaccgtggtcggaggggggagcgtctccacacccatcgctacttttgtctcgggaagtcccagcctcaacacctacaatgccacgaccgtcaattccagcgcgaacgccttctcttgcgcctactaccttcaacagtggaacatacaggggctccttgttacctccctctacttgaaattggacagcgccaccatggggaatcgccctggggacctcaactccgccaatgccaaatggttcaccttttgggtgtccgcctatctccagcaatgcaacccctccgggattcaagcgggaacggtcagcccctccaccgccaccctcacggactttgaacccatggccaataggagcgtgaccagcccatggacgtactcggccaatggatactatgaaccatccatcggggaattccaagtgttcagcccggtggtaacaggtgcctggaacccgggaaacatagggatccgcgtcctccccgtgccggtttcggcctccggagagcgatacacccttctatgctatagtctgcagtgcacgaacgcgagcatttttaatccaaacaacagcggaaccatgatcgtgggacccgtgctctacagctgtccagcggcctccctcccgtaa

特异性连接肽片段基因序列为(如序列表seqidno：6所示)：

cctgaagtcctgcctcctctgcctaaggaatctagaatttccgaaggtgaagctgtcgtcgtcggt。

同时，本发明还公开了一种融合抗原，所述的融合抗原具有：

a)禽流感病毒ha蛋白；

b)禽腺病毒fiber2蛋白；

c)位于所述的禽流感病毒ha蛋白和禽腺病毒fiber2蛋白之间的特异性连接肽；所述的特异性连接肽的氨基酸序列如序列表seqidno：2所示，具体为：

pevlpplpkesrisegeavvvg。

在上述的融合抗原中，所述的融合抗原的氨基酸序列表如序列表seqidno：3所示，具体为：

mevvslitillvatvsnadkicigyqstnstetvdtltennvpvthakellhtehngmlcatslgqplildtctiegliygnpscdlslegrewsyiverpsavnglcypgnvenleelrslfssarsyqriqifpdtiwnvsydgtstacsgsfyrsmrwltrkngdypvqdaqytnnqgknilfmwginhpptdttqrnlytrndtttsvateeinrifkpligprplvnglmgridyywsvlrpsqtlriksdgnliapwyghilsgeshgrilktdlkrgsctvqcqtekgglnttlpfqnvskyafgncskyigikslklavglrnvpsrssrglfgaiagfieggwsglvagwygfqhsndqgvgmaadrdstqkaidkitskvnnivdkmnkqyevidhefsevetrlnminnkiddqiqdiwaynaellvllenqktldehdanvnnlynkvkralgsnavedgkgcfelyhkcddqcmetirngtynrrkyqeesklerqkiegvklesegtykiltiystvasslviamgfaaflfwamsngscrcnicipevlpplpkesrisegeavvvgmlrapkrrhsengkpeteagpspapikrakrmvrasqldlvypfdyvadpvgglnppflggsgplvdqggqltlnvtdpiiiknrsvdlahdpsldvnaqgqlavavdpegalditpdgldvkvdgvtvmvnddwelavkvdpsggldstagglgvsvddtllvdqgelgvhlnqqgpitadssgidleinpnmftvntstgsgvlelnlkaqggiqaassgvgvsvdeslqivnntlevkpdpsgpltvsanglglkydtntlavtagaltvvgggsvstpiatfvsgspslntynattvnssanafscayylqqwniqgllvtslylkldsatmgnrpgdlnsanakwftfwvsaylqqcnpsgiqagtvspstatltdfepmanrsvtspwtysangyyepsigefqvfspvvtgawnpgnigirvlpvpvsasgerytllcyslqctnasifnpnnsgtmivgpvlyscpaaslp。

此外，本发明还公开了一种重组表达载体，所述的重组表达载体含有如上所述的融合基因。

在上述的重组表达载体中，所述的重组表达载体为：将如上所述的融合基因通过内切酶ecorⅰ和notⅰ采用双酶切反应连接于巴斯德毕赤酵母表达载体ppic9k上而得到的重组表达载体。

此外，本发明还公开了一种如上所述的融合抗原的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：合成重组表达载体；合成含禽流感h9亚型ha基因和腺病毒4型fiber2基因的融合基因，序列表seqidno：1所示，并且在融合基因序列两端加上限制性酶切位点ecorⅰ和notⅰ，同时采用限制性内切酶ecorⅰ和notⅰ对巴斯德毕赤酵母表达载体ppic9k进行双酶切，得到9263bp大小的片段，将合成的融合基因序列和双酶切回收的巴斯德毕赤酵母表达载体ppic9k片段用t4dnaligase进行连接得到连接产物；

步骤2：将步骤1中的连接产物转化大肠杆菌dh5α，挑菌落采用pcr的方法进行阳性克隆验证，并且对目的片段进行测序验证；

上述的目的片段是指连接产物，对目的片段进行测序验证是论证连接产物是否成功转化大肠杆菌dh5α；

步骤3：步骤2测序成功之后对菌落提质粒得到重组质粒，采用电转化法，将重组质粒导入毕赤酵母gs11中得到菌体；

上述的重组质粒是指连接产物。

步骤4：将步骤3中的菌体收集并挑取能够在抗性平板上正常生长的转化子，对转化子提取基因组，对目的片段进行pcr扩增；

上述的转化子是步骤3所转化得到的菌体经过含g418抗生素的ypd固体培养基平板上进行筛选得到的能够正常生长的菌。

步骤4所述的目的片段是指连接产物，对基因组所含的目的片段进行pcr扩增、验证目标片段是否存在，如果存在则进行步骤5。

步骤5：确定有目的片段后，再次活化转化子，进行发酵诱导培养，得到含融合抗原的蛋白液；

步骤6：对蛋白液体进行纯化沉淀得到融合抗原。

在上述的融合抗原的制备方法中，所述的步骤2具体为：将步骤1中的连接产物转化大肠杆菌dh5α,取100μl在冰上融化的dh5α细胞于圆底5mlep管中，加入步骤1中的连接产物，冰上30秒，42℃热激45秒，冰上1-2分钟，添加soc培养基至终体积1ml，37℃振荡培养1h，取适量涂布于lb琼脂板，37℃过夜培养；挑菌落采用pcr的方法进行阳性克隆验证，并且对目的片段进行测序验证；

所述的步骤3具体为：测序成功之后对菌落提质粒得到重组质粒，采用电转化法，将重组质粒导入毕赤酵母gs11中，电转化条件为：制备的重组质粒分别加到含有80μl毕赤酵母gs115感受态细胞的1.5ml离心管中冰浴15min得到质粒感受态混合液，吸取质粒感受态混合液加入预冷过的0.2cm电转化杯中并置于电转仪上进行电击转化；在1500v、4.5ms电转条件下进行电击；电击完成立即加入500μl预冷的1m山梨醇溶液混匀，将混合液转至1.5ml离心管中，于恒温摇床30℃，180rpm培养2h；复苏后的菌液低速离心5min保留150-200μl悬浮菌体，涂在含1m山梨醇的ypd平板上，在30℃恒温培养箱中培养48h；

在上述的融合抗原的制备方法中，所述的步骤4具体为：将步骤3中ypd平板上菌体收集并稀释相应倍数吸取150-200μl菌液涂于含浓度为0.4g/mlg418抗生素的ypd固体培养基上，30℃恒温培养箱中静置培养2-4天，挑取能够在抗性平板上正常生长的转化子，提取转化子基因组，对目的片段进行pcr扩增。

在上述的融合抗原的制备方法中，所述的步骤5具体为：挑取验证过的转化子接种于bmgy培养液中，于30℃振荡培养48h，之后于4000rpm低温离心10min去上清液，再加入bmmy培养液悬浮菌体，之后继续诱导72h，每24h加入甲醇诱导；将培养液4000rpm低温离心10min，收集上清得到蛋白液，进行sds-page鉴定是否存在融合抗原；

所述的步骤6具体为：加入蛋白液体积两倍的无水乙醇过夜进行沉降，8000rpm/min低温离心5min，去除上清液，收集沉淀得到禽流感h9亚型ha和腺病毒4型fiber2融合抗原。

最后，本发明公开了一种如上所述的融合抗原的应用，用作禽流感与禽腺病毒4型二联基因工程亚单位疫苗中的抗原。

本发明的有益效果是：

本发明的融合基因采用禽流感h9亚型ha基因、腺病毒4型fiber2基因、特异性连接肽片段基因进行融合，该基因对应的表达蛋白抗原能够诱导家禽产生高水平的特异性抗体，保护家禽免受禽流感和禽腺病毒的感染。

本发明的融合抗原的优点在于：

1、首次将禽流感病毒ha蛋白和禽腺病毒fiber2蛋白串联融合表达，减少实际生产中的重复性工作，增加劳动效率；

2、禽流感病毒ha和禽腺病毒fiber2之间加入了特异性连接肽，辅助禽流感病毒ha和禽腺病毒fiber2融合表达，优化融合蛋白分子的折叠；

3、其可诱导家禽产生高水平的特异性抗体，保护家禽免受禽流感和禽腺病毒的感染。

本发明的融合抗原的制备方法采用基因工程发酵的方式制备，具有成本低、抗原纯度高、免疫原性好以及安全性高优点。

附图说明

图1为本发明的实施例一的融合基因序列结构图示。

具体实施方式

下面结合具体实施方式说明本发明：但是可以理解这些具体的实施方式只是用于说明本发明，而不是对本发明的限制。本领域的技术人员完全可以在本发明的启示下，对本发明的的具体实施方式或者技术特征进行改进，但这些经过改进或替换的技术方案，仍属于本发明的保护范围。

实施例一

基于禽流感病毒ha蛋白和禽腺病毒fiber2蛋白的融合抗原制备：

原材料：毕赤酵母gs115、ppic9k质粒由云南师范大学生命科学学院韩楠玉老师课题组提供；上述原料也为市场可购商品，如：毕赤酵母gs115(出品公司：invitrogen^tm；菌株类型：毕赤酵母；产品目录号：c181-00；培养基：ypd培养基；生长条件：28-30℃，有氧；基因型：his4；表型：mut+；质粒转化条件：电转；应用：蛋白表达；诱导方法:

甲醇)；ppic9k质粒(出品公司：invitrogen^tm；产品名称：ppic9kpichiavector；货号：v17520)

大肠杆菌dh5α、质粒提取试剂盒和限制性内切酶ecorⅰ和notⅰ购自takara-宝生物工程(大连)有限公司；t4dnaligase为t4dna连接酶，为市售产品。

细菌/真菌培养基成分与遗传霉素g-418等抗生素购自生工生物工程上海(股份)有限公司，融合基因全长由生工生物工程上海(股份)有限公司合成；

包括如下步骤：

步骤1：合成融合表达基因序列，构建重组表达载体；将融合基因序列进行合成(由生工生物工程上海(股份)有限公司合成)，并且在融合基因序列两端加上限制性酶切位点ecorⅰ和notⅰ，同时采用限制性内切酶ecorⅰ和notⅰ对巴斯德毕赤酵母表达载体ppic9k进行双酶切，得到9263bp大小的片段，将合成的融合基因序列和双酶切回收的巴斯德毕赤酵母表达载体ppic9k片段用t4dnaligase进行连接得到连接产物。融合基因序列如图1所示，图1中两端为禽流感h9亚型ha基因和腺病毒4型fiber2基因，采用特异性连接肽片段基因连接。

步骤2：将步骤1中的连接产物转化大肠杆菌dh5α,具体步骤为：取100μl在冰上融化的大肠杆菌dh5α细胞于圆底5mlep管中，加入步骤1中的连接产物(≤10ng)，冰上30秒，42℃热激45秒，冰上1-2分钟，添加soc培养基至终体积1ml，37℃振荡培养1h，取适量涂布于lb琼脂板，37℃过夜培养；挑菌落采用pcr的方法进行阳性克隆验证，并且对目的片段进行测序验证；

步骤3：测序成功之后提质粒得到重组质粒，采用电转化法，将重组质粒导入毕赤酵母gs11中，电转化条件为：制备的重组质粒分别加到含有80μl毕赤酵母gs115感受态细胞的1.5ml离心管中冰浴15min得到质粒感受态混合液，吸取质粒感受态混合液加入预冷过的0.2cm电转化杯中并置于电转仪上进行电击转化；在1500v、4.5ms电转条件下进行电击；电击完成立即加入500μl预冷的1m山梨醇溶液混匀，将混合液转至1.5ml离心管中，于恒温摇床30℃，180rpm培养2h；复苏后的菌液低速离心5min保留150-200μl悬浮菌体，涂在含1m山梨醇的ypd平板上，在30℃恒温培养箱中培养48h；

步骤4：利用抗性浓度梯度筛选转化子；

将步骤3中导入了重组质粒的毕赤酵母gs11利用抗性浓度梯度筛选转化子，将含有重组质粒的转化子在遗传霉素g-418抗性浓度分别为0、2和4mg/ml的ypd平板上实现筛选，挑取能够在高浓度抗性平板上正常生长的转化子，提取转化子基因组，对目的片段进行pcr扩增；

步骤5：确定有目的片段后，再次活化转化子，进行发酵诱导培养，得到含融合抗原的蛋白液；

挑取验证过的转化子接种于bmgy培养液中，于30℃振荡培养48h，之后于4000rpm低温离心10min去上清液，再加入bmmy培养液悬浮菌体，之后继续诱导72h，每24h加入甲醇诱导；将培养液4000rpm低温离心10min，收集上清得到蛋白液，进行sds-page鉴定；

步骤6：对蛋白液体进行纯化沉淀得到融合抗原。加入蛋白液体积两倍的无水乙醇过夜进行沉降，8000rpm/min低温离心5min，去除上清液，收集沉淀得到禽流感h9亚型ha和腺病毒4型fiber2融合抗原。

实施例二

禽流感与禽腺病毒4型二联基因工程亚单位疫苗的制备，包括如下步骤：

(1)油相制备：将94重量份注射白油与6重量份司本-80混合配制油相，经121℃灭菌30min，冷至室温备用。

(2)水相制备：取实施例一制备的融合抗原稀释成为96重量份使疫苗中融合抗原的含量为75μg/ml，加入灭菌冷却后的吐温-804重量份，充分搅拌至完全溶解。

(3)乳化：取油相3重量份倾入乳化罐内搅拌，再缓慢加入水相2份，2000r/min的乳化转速乳化60min。

(4)分装：无菌定量分装，加盖密封，2-8℃保存。

实施例三

疫苗免疫效力实验

(1)对禽流感(h9亚型)的免疫保护

用28日龄spf鸡15只，其中10只颈部皮下注射禽流感与禽腺病毒4型二联基因工程亚单位疫苗0.3ml(实施例二)，另5只作禽流感攻毒对照。接种后21日，每只鸡各静脉注射h9亚型禽流感病毒da株鸡胚毒0.2ml(含2×10^7.0eid50)。攻毒后第5日，采集每只鸡喉头和泄殖腔棉拭子，并将两者上清液混合后经尿囊腔接种9～11日龄spf鸡胚5枚，每胚0.2ml，孵育观察72小时，测定所有鸡胚液ha效价。每份混合拭子样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚的鸡胚液ha效价不低于1∶16，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1代后再进行判定。

结果表明，免疫鸡10只病毒分离阴性，对照鸡病毒分离5只全为阳性。

(2)对禽腺病毒4型的免疫保护

用21日龄spf鸡15只，其中10只颈部皮下注射禽流感与禽腺病毒4型二联基因工程亚单位疫苗0.3ml(实施例二)，另5只作禽腺病毒4型攻毒对照。接种后21日，免疫组和对照组均肌肉注射禽腺病毒4型分离株gx-1株(ncbi登录号：mh454598)，病毒含量不低于10^6.0tcid50/ml，每只0.3ml，攻毒后观察动物发病死亡情况。

结果表明，免疫鸡10只均能抵抗禽腺病毒4型分离株gx-1株的攻击，无发病及死亡情况，全部存活；而对照组5只全部发病死亡。

本发明首次将禽流感病毒ha蛋白和禽腺病毒fiber2蛋白串联融合表达，减少实际生产中的重复性工作，增加劳动效率；

禽流感病毒ha和禽腺病毒fiber2之间加入了特异性连接肽，辅助禽流感病毒ha和禽腺病毒fiber2融合表达，优化融合蛋白分子的折叠；其可诱导家禽产生高水平的特异性抗体，保护家禽免受禽流感和禽腺病毒的感染。

本发明的融合抗原的制备方法采用基因工程发酵的方式制备，具有成本低、抗原纯度高、免疫原性好以及安全性高优点。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>肇庆大华农生物药品有限公司

华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司

<120>一种融合基因、重组表达载体、抗原及其制备方法和应用

<141>2019-04-22

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3189

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

atggaagtagtatcactaataactatactactagtagcaacagtaagcaatgcagataaa60

atctgcatcggctatcaatcaacaaactccacagaaactgtggacacactaacagaaaac120

aatgtccctgtgacacatgccaaagaactgctccacacagagcataatgggatgctgtgt180

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