一种防治慢性牙周炎的卵黄抗体的制备方法和应用与流程

本发明属于免疫学技术领域。具体地，涉及一种防治慢性牙周炎的卵黄抗体的制备方法和应用。

背景技术：

慢性牙周炎为临床常见病，多发病，疾病患者的牙龈上皮薄，极易受到牙口腔细菌感染，进而发生炎症。患者的牙龈极易受到牙龈边缘处积存食物残渣刺激，在此同时，因为受到菌斑、牙石以及食物残渣在生理间隙跟牙周不齐位置造成刺激的影响，加上口腔清洁卫生工作未进行彻底，因此慢性牙周炎很容易发生。

卵黄抗体又称卵黄免疫球蛋白，是禽类蛋黄中存在的唯一的免疫球蛋白，目前应用较多的是鸡卵黄抗体，是用抗原免疫产蛋母鸡后，鸡血清中可产生相应的抗体，母鸡又能以产蛋的方式将血清中的抗体有效地转移至卵黄中，不同的抗原免疫就会产生针对该抗原的特异性卵黄抗体；卵黄抗体无需采血符合现代动物保护规则，产生的抗体量大，专一性强，性质稳定，无毒副作用，且不仅具有能与抗原结合的能力还对抗原菌的生长具有显著的抑制作用。

专利cn106467572a公开了一种特异性复合卵黄抗体，通过将抗牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和solobacteriummoorei三种口腔厌氧菌混合，制备复合抗原，再免疫蛋鸡，获得特异性复合卵黄抗体，所述卵黄抗体对牙周病及口臭等有一定的抑制效果；然而其针对慢性牙周炎的主要致病菌并不具备良好的防治效果。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种防治慢性牙周炎的卵黄抗体的制备方法，所述特异性复合卵黄抗体专一性强，对牙龈炎的防治效果好，而且不会影响口腔内的正常菌群，绿色安全。

本发明的第二个目的是提供上述制备方法制备得到的特异性卵黄抗体。

本发明的第三个目的是提供所述特异性卵黄抗体的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种防治慢性牙周炎的特异性卵黄抗体的制备方法，是以牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis)、福赛坦菌(tannerellaforsythia)和直肠弯曲菌(campylobacterrectus)为复合抗原并将其免疫蛋鸡后，收集免疫鸡蛋，除去蛋清，收集蛋黄，分离并纯化后制得。

本发明通过将与慢性牙周炎发生密切相关的三种细菌：牙龈卟啉单胞菌、粘福赛坦菌和直肠弯曲菌超声、混匀得到复合抗原，再将复合抗原免疫母鸡得到复合卵黄抗体，所述卵黄抗体对产生相应抗原的病原体的生长具有显著的抑制作用，对慢性牙周炎的防治有非常好的作用，且不会影响其他口腔无关菌群的生长，安全无害。

优选地，所述复合抗原由牙龈卟啉单胞菌、福赛坦菌和直肠弯曲菌的菌悬液经超声破碎后，按体积比1:1:1混匀制备得到。

优选地，所述菌悬液中的牙龈卟啉单胞菌、福赛坦菌和直肠弯曲菌的浓度分别为1×10⁷cfu/ml。

优选地，所述免疫为对蛋鸡进行初次免疫和加强免疫，共6轮；初次免疫使用弗氏完全佐剂疫苗，采用皮下多点注射的免疫方式，对每只母鸡的翅根下部及腿部注射0.5～0.8ml，初次免疫15天后进行第一次加强免疫，使用弗氏不完全佐剂疫苗，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射0.5～0.8ml，以后每隔15天进行加强免疫一次，一共加强免疫5轮。

优选地，所述弗氏完全佐剂疫苗和弗氏不完全佐剂疫苗为将复合抗原分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按体积比1:1:1混匀，充分乳化后制得。

优选地，所述分离纯化为采用peg6000进行沉淀获得特异性复合卵黄抗体。具体为收集免疫鸡蛋的蛋黄，加入3～4％的peg6000的pbs溶液，离心获得水溶性成分，再经过8～16层纱布过滤，在10000～12000r/min，3～5℃下离心10min，取上清，加入10～13％peg6000的pbs溶液，搅拌后，10000～12000r/min，低温离心，取沉淀，加入饱和硫酸钠，在10000～12000r/min，低温离心，加入pbs溶液，3～5℃下静置2h，取沉淀，使用pbs溶液溶解，经过超滤膜超滤作用，再经过冷冻干燥，获得特异性复合卵黄抗体。

优选地，所述分离纯化为采用水对蛋黄进行稀释，离心取上清液，用饱和硫酸钠盐析沉淀获得特异性复合卵黄抗体。具体为向免疫鸡蛋的蛋黄中加入8～10倍蛋黄液体积的去离子水，搅拌20～30min。搅匀后4℃过夜。蛋黄液在10000～12000r/min，4℃条件下离心15min，收集上清液然后将上清液用滤纸过滤，即为水溶性组分。加入饱和硫酸铵，在10000～12000r/min，低温离心，加入pbs溶液，3～5℃下静置2h，取沉淀，使用pbs溶液溶解，经过透析袋透析3～4天，再经过冷冻干燥，获得特异性复合卵黄抗体。

本发明还请求保护上述任一所述制备方法制备得到的防治慢性牙周炎的特异性卵黄抗体。所述特异性卵黄抗体对龈卟啉单胞菌、粘福赛坦菌和直肠弯曲菌的生长具有显著的抑制作用，对慢性牙周炎的防治有非常好的作用，且不会影响其他口腔无关菌群的生长，安全无害，可进一步将所述特异性卵黄抗体制备成具体的用于防治慢性牙周炎的产品/药物等。因此，本发明还请求保护所述防治慢性牙周炎的特异性卵黄抗体在制备防治慢性牙周炎的产品/药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以龈卟啉单胞菌、粘福赛坦菌和直肠弯曲菌三种混合菌作为复合抗原，将该复合抗原免疫母鸡后制备得到特异性复合卵黄抗体，所述特异性复合卵黄抗体效价高，免疫效果好，可有效抑制牙龈卟啉单胞菌、福赛坦菌和直肠弯曲菌的生长，对治疗与预防慢性牙周炎明显的效果，且不会影响其他口腔无关菌群的生长，安全无害。

附图说明

图1为实施例1特异性卵黄抗体的间接竞争抑制elisa检测结果。

图2为实施例1提取的卵黄抗体的电泳图。图2中，1：marker；2：水提取抗体；3：硫酸铵盐析。

图3为实施例2提取的卵黄抗体的电泳图。图3中，1：marker；2：聚乙二醇提取的抗体粗提取物；3：聚乙二醇提取后二次抗体粗提取物；4：硫酸钠盐析。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

菌株来源：本发明下述菌株为：卟啉单胞菌atcc3277、福赛坦菌atcc43037、直肠弯曲菌atcc3228标准株，均由四川大学华西口腔医学院实验中心提供。

特异性卵黄抗体的效价、分子量以及纯度检测采用以下检测方法：

1、特异性卵黄抗体的效价检测

采用酶联免疫分析法(elisa)检测特异性卵黄抗体的效价。

(1)包被：用包被缓冲液(cbs，ph＝9.6，0.05mol/l)将牙龈卟啉单胞菌、福赛坦菌和直肠弯曲菌及其复合抗原分别稀释至10⁸cfu/ml，包被于96孔酶标板，100μl/孔，4℃包被12h，用洗板机洗板三次并用吸水纸拍干。

(2)封闭：用含30％脱脂奶粉的pbs(0.01mol/l)进行封闭(270μl/孔)，在水浴锅中37℃下孵育1h，如上步骤1洗涤操作。

(3)加一抗：分别将特异性igy用pbs(0.01mol/l)进行倍比稀释后，用移液枪加入到96孔酶标板(100μl/孔)中，同时加入pbs作为空白对照，在水浴锅中37℃下孵育1h，如上步骤1洗涤操作。

(4)加酶标二抗：每孔加入1:5000稀释过的hrp标记的兔抗鸡的igy抗体100μl，在水浴锅中37℃下孵育1h，如上步骤1洗涤操作，再使用pbst手洗3次，使用吸水纸吸干酶标板。

(5)显色和终止反应：加入新鲜配制的tmb显色液，100μl/孔，在水浴锅中37℃下孵育15min，然后加入2m硫酸终止液，50μl/孔。

(6)检测吸光值：立即检测酶标板各孔在450nm处的吸光值。以阳性孔od值≧2.1倍阴性孔od值时的最高稀释倍数作为特异性卵黄抗体的效价。

2、特异性卵黄抗体的分子量以及纯度

采用sds-page测定特异性卵黄抗体的纯度

用sds-page电泳检测得到的特异性卵黄抗体的纯度。具体如下：使用5ml的10％(质量分数)分离胶，2ml的5％(质量分数)浓缩胶，电泳结束后用考马斯亮蓝染色30min，最后脱色液(甲醇-乙酸水溶液)脱色5次至分离胶脱色到透明为止，使用计算机和拍照软件得到电泳图。

实施例1

一、方法

一种用于防治慢性牙周炎的特异性卵黄抗体的制备，采用水提取法，具体过程如下所述：

1、免疫原制备：分别取浓度为1×10⁷cfu/ml牙龈卟啉单胞菌、福赛坦菌和直肠弯曲菌悬浮液，经超声破碎后，按体积比1：1：1混合成复合抗原，经处理后的复合抗原分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按体积比1:1:1混合，充分乳化，制成弗式完全佐剂疫苗和弗式不完全佐剂疫苗。

2、免疫：选取20周龄产蛋母鸡，初次免疫使用弗氏完全佐剂疫苗，采用皮下多点注射的免疫方式，对每只母鸡的翅根下部及腿部注射0.5～0.8ml，初次免疫15天后进行第一次加强免疫，使用弗氏不完全佐剂疫苗，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射0.5～0.8ml，以后每隔15天进行加强免疫一次，一共加强免疫5轮。

3、从第一轮免疫开始，每14～15天收集免疫鸡蛋，用75～85％酒精消毒，利用蛋清蛋黄分离器，除去蛋清，收集蛋黄。

4、特异性卵黄抗体分离纯化：向蛋黄中加入10倍蛋黄液体积的去离子水，搅拌30min。搅匀后4℃过夜。蛋黄液在10000r/min，4℃条件下离心15min，收集上清液然后将上清液用滤纸过滤，即为水溶性组分。加入饱和硫酸铵溶液，在10000r/min，低温离心，加入pbs溶液，3℃下静置2h，取沉淀，使用pbs溶液溶解，经过透析袋透析作用3天后，再经过冷冻干燥，获得特异性复合卵黄抗体。

二、结果

将制备得到的特异性复合卵黄抗体进行效价检测，其检测结果如图1和如表1所示，上述所制备的卵黄抗体为复合牙龈卟啉单胞菌、福赛坦菌和直肠弯曲菌特异性抗体，效价高且稳定。

表1效价检测结果

上述卵黄抗体的电泳图如图2所示，结果表明，使用饱和硫酸铵法提纯的特异性抗体的纯度较高，除去杂质蛋白效果好。

实施例2

一、方法

一种用于防治慢性牙周炎的特异性卵黄抗体的制备，采用聚乙二醇提取法，具体过程如下所述：

1、免疫原制备：分别取浓度为1×10⁷cfu/ml牙龈卟啉单胞菌、福赛坦菌和直肠弯曲菌悬浮液，经超声破碎后，按体积比1：1：1混合成复合抗原，经处理后的复合抗原分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按体积比1:1:1混合，充分乳化，制成弗式完全佐剂疫苗和弗式不完全佐剂疫苗。

2、免疫：选取20周龄产蛋母鸡，初次免疫使用弗氏完全佐剂疫苗，采用皮下多点注射的免疫方式，对每只母鸡的翅根下部及腿部注射0.5～0.8ml，初次免疫15天后进行第一次加强免疫，使用弗氏不完全佐剂疫苗，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射0.5～0.8ml，以后每隔15天进行加强免疫一次，一共加强免疫5轮。

3、从第一轮免疫开始，每14～15天收集免疫鸡蛋，用75～85％酒精消毒，利用蛋清蛋黄分离器，除去蛋清，收集蛋黄。

4、特异性卵黄抗体分离纯化：向蛋黄中加入3.5％的peg6000的pbs溶液，离心获得水溶性成分，再经过8层纱布过滤，在10000r/min，3℃下离心10min，取上清，加入10％peg6000的pbs溶液，搅拌后，10000r/min，低温离心，取沉淀，加入饱和硫酸钠溶液，在10000r/min，低温离心，加入pbs溶液，3℃下静置2h，取沉淀，使用pbs溶液溶解，经过超滤膜超滤作用后，再经过冷冻干燥，获得特异性复合卵黄抗体。

二、结果

将制备得到的特异性复合卵黄抗体进行效价检测，其结果如表2所示，上述所制备的卵黄抗体为复合牙龈卟啉单胞菌、福赛坦菌和直肠弯曲菌特异性抗体，效价高且稳定。

表2效价检测结果

上述卵黄抗体的电泳图如图3所示，结果表明，使用饱和硫酸钠法提纯的卵黄抗体杂质蛋白条带基本不存在，提纯效果较佳。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。