一株能够降解2,6-二甲基苯酚的细菌及其生产的菌剂的制作方法

本发明属于生物高技术领域，公开了一株能够高效降解2,6-二甲基苯酚的细菌及其生产的菌剂。

背景技术：

二甲基苯酚(dimethylphenol，dmp)是自然界中一类常见的芳香烃，共有6种异构体：2,3-dmp，2,4-dmp，2,5-dmp，2,6-dmp，3,4-dmp和3,5-dmp。作为一类重要的化工中间体，dmp广泛应用于合成树脂、农药、香料、染料、抗氧剂、阻聚剂和抗菌剂等化合物。例如，2,6-二甲基苯酚(2,6-dmp)可用于合成工程塑料聚苯醚、农药甲霜灵和呋酰胺等，世界五大聚苯醚生产商里中国占两家(即“蓝星”和“鑫宝”)，由此可见，我国对2,6-dmp的需求量之大可见一斑。

2,6-dmp可以从煤炭裂解产生的煤焦油、石油裂解的混合酚中提取或通过化学合成。我国煤炭资源丰富，炼焦和煤焦油提取工业发达，产生大量含有2,6-dmp的废水。由于处理这些废水的能力不足且存在泄漏和违法偷排情况，每年有大量的2,6-dmp被释放到自然环境中。进入环境中的2,6-dmp对鱼类和水生无脊椎动物具有高的毒性；对人体而言，2,6-dmp容易被皮肤、粘膜和呼吸系统吸收，造成烧伤、肠道紊乱和神经错乱等伤害。环境中残留的2,6-dmp污染问题亟待解决。

微生物降解是清除环境中残留的2,6-dmp的一种理想方法，但是还缺乏相应的降解菌株资源。目前已报道的可以将2,6-dmp彻底分解代谢的菌株只有一株细菌(ewers等，1989)，但由于该菌株分离获得至今已有40年，菌株已无从获得且其降解2,6-dmp能力的稳定性也需要进一步验证。因此，有必要继续分离筛选能降解代谢2,6-dmp的菌株并实现菌剂的大规模工业化生产，以应对修复环境中2,6-dmp的污染问题。

技术实现要素：

技术问题本发明针对以上问题，分离筛选出一株可以高效降解2,6-dmp的菌株，该菌株72h内对浓度范围在1～300mg·l^-1的2,6-dmp的降解率高达99％以上。

技术方案下面为本方案的主要内容：

本发明提供一种催化2,6-dmp的降解菌b5-4，于2019年1月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctccno:m2019088。该菌株经鉴定为一株新金分枝杆菌(mycobacteriumneoaurum)，该种属极少被报道为病原菌且其模式菌株mycobacteriumneoaurumatcc25795的生物安全等级为一级，因此我们初步认为该菌株的生物安全性较好。该菌株在lb平板上的菌落形态为金黄色、边缘光滑、不透明；无芽孢、无鞭毛、不能运动、好氧的长杆状细菌。在实验室摇瓶条件下，24h内可完全降解50mg·l^-1的2,6-dmp(ph7.0,30℃)；菌株b5-4催化2,6-dmp的浓度范围为从1mg·l^-1到500mg·l^-1，特别地，72h内对浓度在1～300mg·l^-1的2,6-dmp的降解率高达99％以上。

本发明所述的降解菌株mycobacteriumneoaurumb5-4在降解2,6-二甲基苯酚中的应用。

本发明所述的降解菌株mycobacteriumneoaurumb5-4在制备降解2,6-二甲基苯酚的菌剂中的应用。

一种用所述的降解菌株mycobacteriumneoaurumb5-4生产的降解菌剂。

2,6-dmp降解菌株b5-4生产菌剂的流程：斜面接种——摇瓶种子液——发酵菌剂生产。

本发明所用培养基：

1、lb培养基：酵母粉，5.0g；蛋白胨，10.0g；nacl，5.0g；去离子水，1l。(固体培养基加1.5％的琼脂粉)

2、发酵培养基：葡萄糖，10.0g；柠檬酸，1.5g；柠檬酸铁胺，0.1g；nh4no3，2.0g；mgso4·7h2o，0.2g；去离子水，1l。

3、基础盐培养基(msm培养基)：nh4no3,1.0g；kh2po4,0.5g；k2hpo4,1.5g；nacl,1.0g；mgso4·7h2o,0.2g；去离子水，1l。(固体培养基加1.5％的琼脂粉)

本发明的详细实施步骤为：

1、将降解菌株b5-4划线lb试管斜面并置于30℃条件下培养；

2、挑取上述培养好的菌株单菌落至液体lb摇瓶中在30℃,180rpm条件下振荡培养至对数生长期作为种子液；

3、将培养好的种子液按5％的接种量接种至25l的发酵罐中扩大培养种子液，培养至对数生长期后再以5％的接种量接种至500l的发酵罐中继续发酵培养，所用培养基为发酵培养基，培养温度为30℃，通入无菌空气的通气量体积比为1:0.8-1.2，搅拌速度为180-200转/分钟，整个菌剂的生产流程耗时5-7天。发酵结束后，将发酵菌液出罐用塑料包装桶分装成液体菌剂。

4、本发明所述的菌剂在降解2,6-二甲基苯酚中的应用；优选在降解土壤中残留的2,6-二甲基苯酚中的应用。

有益效果

本发明提供一种能够高效快速降解2,6-dmp的菌株b5-4。在24h内可完全降解50mg·l^-1的2,6-dmp，特别是在72h内对浓度在1～300mg·l^-1的2,6-dmp的降解率高达99％以上，适用于2,6-dmp污染较轻、严重或非常严重的地区，因此该菌株具有广泛的应用潜力和价值。

该菌剂的生产具有成本低、使用方便、去除效果好等优点，适合在全国2,6-dmp污染区域，特别是煤矿开采行业地区大面积推广使用。本发明对于保护生态环境和保护人民身体健康都具有重要的意义。

附图说明

图1菌株b5-4的菌落形态(a)和透射电镜(b)照片

图2菌株b5-4的16srrna基因进化树分析

图3菌株b5-4对2,6-dmp的降解及生长曲线

图4菌株b5-4降解2,6-dmp的中间代谢物lc-ms分析

图5菌株b5-4降解2,6-dmp的代谢物途径

图6温度对菌株b5-4降解2,6-dmp的影响

图7ph对菌株b5-4降解2,6-dmp的影响

图82,6-dmp的初始浓度对菌株b5-4降解的影响

生物材料保藏信息

菌株b5-4，分类命名为分枝杆菌b5-4mycobacteriumsp.b5-4，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，菌株的保藏编号为cctccno:m2019088，保藏日期为2019年1月28日，保藏地址为中国武汉武汉大学。

具体实施方式

实施例1菌株的分离与鉴定

本发明提供一种高效降解2,6-dmp的菌株b5-4，分离自江苏省某长期受二甲基苯酚污染的土壤中。具体的菌株筛选方法为：取1g土样加入到含有50mg·l^-12,6-dmp的100mlmsm培养基中，于30℃、180rpm条件下振荡富集培养，5天后以5％的接种量转移到含有50mg·l^-12,6-dmp的100mlmsm新鲜培养基中继续振荡富集培养，以此方式连续进行四次传代富集培养。将第四次传代的富集液稀释涂布于含有50mg·l^-12,6-dmp的msm固体培养基上，30℃条件下培养5天后挑取单菌落于含有50mg·l^-12,6-dmp的液体msm试管中振荡培养，一周后取1ml培养液并加入等体积的二氯甲烷萃取，采用紫外分光光度计分析检测降解效果。将有降解效果的菌株经进一步纯化后保存于-80℃冰箱中待用。

经分离培养，筛选到一株可以高效降解2,6-dmp的菌株，命名为b5-4。该菌株经鉴定属于mycobacteriumneoaurum,并于2019年1月28日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2019088。菌株b5-4在lb平板上的菌落形态为金黄色、边缘光滑、不透明(图1a)；主要生物学特征为无芽孢、无鞭毛、不能运动、好氧的长杆状细菌(图1b)。菌株b5-4的16srrna基因序列经构建系统进化树比对分析，结果表明该菌株与mycobacteriumneoaurum模式株atcc25795进化关系最近，二者的16srrna基因序列完全一致(图2)。根据以上形态、生理和16srrna基因序列分析结果，最终将菌株b5-4鉴定为mycobacteriumneoaurum。

实施例2实验室降解实验

2.1降解菌液制备

挑取单菌落接种至lb培养基中振荡培养至对数生长期(30℃,180rpm)；离心收集菌体(4℃，6000rpm离心10min)，经msm培养基洗涤两次后重悬于液体msm培养基中，加入50mg·l^-12,6-dmp诱导培养细胞，12h后，6000rpm离心10min收集菌体，经msm培养基洗涤两次后重悬于液体msm培养基中作为降解菌液。

2.2菌株b5-4对2,6-dmp的降解

将降解菌液的od600调节至0.25左右接种至加了50mg·l^-12,6-dmp的新鲜msm培养基中，30℃，180rpm条件下培养24h，定时取样，测定相应的od600值，同时采用高效液相色谱(hplc)检测培养基中残留的2,6-dmp浓度，绘制菌株b5-4对2,6-dmp的降解及生长曲线。如图3所示，菌株b5-4能以2,6-dmp作为唯一碳源生长，24h内可完全降解50mg·l^-1的2,6-dmp。与此同时，采用高效液相色谱质谱联用仪(lc-ms)鉴定菌株b5-4降解2,6-dmp的代谢中间产物(图4)，并由此推测了一条2,6-dmp的微生物代谢途径(图5)。

2.3温度对菌株b5-4降解2,6-dmp的影响

将降解菌液的od600调节至0.5接种到加了50mg·l^-12,6-dmp的新鲜msm培养基中，在180rpm条件下振荡培养12h，温度分别设定为10℃、20℃、30℃、40℃和50℃，hplc检测培养基中的2,6-dmp残留量并计算出相应的降解率。如图6所示，菌株b5-4在30℃时对2,6-dmp的降解率最高，高温(大于40℃)对降解效率的影响较为显著。

2.4ph对菌株b5-4降解2,6-dmp的影响

向ph为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的msm培养基中分别加入终浓度为50mg·l^-1的2,6-dmp，再向其中分别加入od600为0.5的降解菌液，在30℃、180rpm条件下振荡培养12h，hplc检测培养基中的2,6-dmp残留量并计算出相应的降解率。如图7所示，菌株b5-4在ph为7.0时对2,6-dmp的降解率最高；在ph在5.0到11.0范围内，菌株b5-4对2,6-dmp均表现出较高的降解活性，这表明菌株b5-4对催化环境的酸碱度具有极强的适应能力，特别是在碱性环境中仍然表现出很高的降解活性。

2.52,6-dmp的初始浓度对菌株b5-4降解的影响

在自然环境中，2,6-dmp的浓度很低。因此，菌株降解低浓度2,6-dmp具有非常重要的意义。相反，菌株对高浓度2,6-dmp污染物的耐受性和降解能力也需要进一步测定。本发明将od600为0.5的降解菌液分别加入含有不同2,6-dmp初始浓度的msm中，2,6-dmp浓度分别设定为1mg·l^-1、2mg·l^-1、5mg·l^-1、10mg·l^-1、50mg·l^-1、100mg·l^-1、200mg·l^-1、300mg·l^-1和500mg·l^-1；定时取样，hplc检测培养基中的2,6-dmp残留量。如图8所示，菌株b5-4在72h内对浓度在1～300mg·l^-1的2,6-dmp的降解率高达99％以上，特别是对1mg·l^-1或300mg·l^-1的2,6-dmp的降解率达到了99％以上，这表明菌株b5-4是修复环境中2,6-dmp污染物的良好候选菌株。

实施例3土壤降解实验

供试土样采自江苏南京紫金山下田园土，经磨碎过2mm筛，按20mg·kg^-1的终浓度将水溶的2,6-dmp母液均匀地喷洒到土壤中，置于通风橱中挥干搅拌均匀待用。每份土壤样品的质量为1kg，含水量维持在35％；调节降解菌液的od600为1，按5％(v/m)的接种量向土壤样品接种50ml菌液，混匀后置于30℃黑暗条件下恒温培养，并以不接菌的土壤作为对照。15天后，通过hplc检测土壤样品中2,6-dmp的残留量并计算降解效率。结果表明菌株b5-4对土壤中残留的2,6-dmp降解效率达到99％。

实施例4菌剂制备

将本发明的2,6-dmp降解菌株b5-4经试管斜面活化测定其降解性能后，接种于lb培养基中振荡培养至对数生长期作为种子液；将培养好的种子液准备接种至25l的发酵罐中扩大培养种子液，所用的培养基为发酵培养基，投料量20l，投料完成后121℃高压湿热灭菌，经冷却至30℃后，将lb中培养的种子液按5％的接种量接种至该25l的发酵罐中，培养至对数生长期，培养温度设定为30℃，通入无菌空气的通气量体积比为1:0.8-1.2，搅拌速度为180-200转/分钟；将培养好的25l的发酵罐中的菌液按5％的接种量接种至500l的发酵罐中扩大发酵培养，投料量400l，所用培养基、灭菌过程及发酵过程中条件参数与25l发酵罐相同，整个菌剂的生产流程耗时5-7天。发酵结束后，将发酵菌液出罐用塑料包装桶分装成液体菌剂。