一种鸭腺病毒3型病毒株及其卵黄抗体制备和应用的制作方法

本发明属于动物抗原抗体领域，特别一种鸭腺病毒3型病毒株及其卵黄抗体制备和应用。

背景技术：

腺病毒(fowladenovirus)是一种常见的家禽和野禽传染病。近年来，鸭腺病毒3型(dadv-3)在我国广泛传播，感染了鸭腺病毒3型后，番鸭会出现肝脏肿大、苍白，脾脏肿大、淤血等症状。该病死亡率可达50％以上，给养鸭业造成了巨大损失。近几年，鸭腺病毒3型的流行呈爆发趋势，严重危害了养鸭业的发展。

鸭腺病毒3型目前尚无有效防控手段防治，但是有灭活疫苗的研究报道，不过此类疫苗在尚处于科学研究阶段，仍没有成功的报道以及生产的产品。同时，已有的研究存在以下问题：一是发病感染模型设计不合理，鸭子感染病毒后并没有出现典型的症状，各组织未检测到病毒，鸭子没有出现死亡症状，与临床数据存在差异；二是鸭子接种了灭活疫苗后，短期内不能产生有效的抗体，而且即使短期内产生了抗体，对病毒的保护率也低，不适用于2周龄以内的鸭子。

目前尚无有效的鸭腺病毒3型动物感染模型，也没有针对鸭腺病毒3型的预防、治疗手段，迫切需要一种新的鸭腺病毒3型作为动物评价模型的毒株以及其产生的安全有效的卵黄抗体。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种鸭腺病毒3型gd06病毒株及其卵黄抗体制备和应用。

本发明提供一种鸭腺病毒3型gd06株，于2019年1月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：v201905。

本发明所采取的技术方案是：

一种鸭腺病毒3型gd06病毒株，所述鸭腺病毒3型gd06病毒株于2019年1月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：v201905，分类命名为鸭腺病毒3型gd06株。

进一步的，所述病毒株的hexon基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

上述所述的鸭腺病毒3型gd06株在制备鸭腺病毒3型疫苗中的应用。

进一步的，所述鸭腺病毒3型疫苗为全病毒灭活疫苗。

一种构建腺病毒感染的动物模型的方法，包括：将如上所述的鸭腺病毒3型gd06病毒株注射到动物体内，使所述动物发病；优选的，所述动物为家禽；更优选的，所述动物为番鸭。

一种鸭腺病毒3型灭活疫苗，所述灭活疫苗为经lmh细胞培养并灭活乳化后的如上所述的鸭腺病毒3型gd06病毒株。

一种抗鸭腺病毒3型病毒的卵黄抗体，所述卵黄抗体由如上所述的鸭腺病毒3型gd06病毒株免疫家禽产生。

进一步的，所述的家禽为蛋鸡。

上述所述的卵黄抗体在制备预防/治疗鸭腺病毒3型的药剂中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种新型的鸭腺病毒3型gd06株，其保藏编号为cctccno：v201905，本发明的病毒株具有良好的特异性以及免疫原性。本发明还提供了一种使用本发明的鸭腺病毒3型gd06病毒株制备的鸭腺病毒3型卵黄抗体，本发明的鸭腺病毒3型卵黄抗体安全性好、免疫保护率高、琼扩效价大于1：32，且能够有效预防和治疗鸭腺病毒3型的感染。本发明还首次建立了鸭腺病毒3型的发病模型，且其致死率不低于50％，有助于疫苗的制备以及抗体效价评估，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为鸭腺病毒3型pcr扩增产物电泳结果，其中泳道1为接种病料后的细胞液；泳道2为未接种细胞液对照；泳道m为dna分子量标准dl2000；

图2为鸭腺病毒3型pcr扩增产物电泳结果，其中泳道1为：f1代病毒液；泳道2：f5代病毒液；泳道3：f10代病毒液；泳道4为未接种细胞液对照；m：dna分子量标准dl2000；

图3为鸭腺病毒3型攻毒鸭和对照鸭的肝脏病变比较结果，其中a为攻毒鸭，b为对照鸭，图中框表示肝脏病变区。

具体实施方式

一种鸭腺病毒3型gd06病毒株，所述鸭腺病毒3型gd06病毒株于2019年1月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：v201905，分类命名为鸭腺病毒3型gd06株。

优选的，所述病毒株的hexon基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

上述所述的鸭腺病毒3型gd06株在制备鸭腺病毒3型疫苗中的应用。

优选的，所述鸭腺病毒3型疫苗为全病毒灭活疫苗。

一种构建腺病毒感染的动物模型的方法，包括：将如上所述的鸭腺病毒3型gd06病毒株注射到动物体内，使所述动物发病；优选的，所述动物为家禽；更优选的，所述动物为番鸭。

一种鸭腺病毒3型灭活疫苗，所述灭活疫苗为经lmh细胞培养并灭活乳化后的如上所述的鸭腺病毒3型gd06病毒株。

一种抗鸭腺病毒3型病毒的卵黄抗体，所述卵黄抗体由如上所述的鸭腺病毒3型gd06病毒株免疫家禽产生。

优选的，所述的家禽为蛋鸡。

上述所述的卵黄抗体在制备预防/治疗鸭腺病毒3型的药剂中的应用。

病毒的分离

无菌采集江门地区某疑似感染鸭腺病毒3型鸭场的发病鸭的肝脏和脾脏，经研钵匀浆，按照1：5(w/v)比例加入无菌pbs。-20℃反复冻融3次后，在6000r/min条件下离心10分钟后。取上清，用0.45μm滤器过滤取滤液，将滤液接种于细胞密度80％～90％的lmh细胞(atcc：crl-2117)。于37℃的co2培养箱培养，观察细胞病变，72小时后无论是否出现细胞病变，均收获细胞液(含上清液和细胞)，反复冻融3次后备用。

病毒的鉴定

设计了一对检测鸭腺病毒3型中目的基因fiber2(高度保守)的引物，核苷酸序列如表1所示。扩增的基因fiber2在腺病毒中高度保守，预期扩增的基因长度为739bp。取收获的细胞液，提取dna(takaraminibestviralrna/dnaextractionkitver.5.0抽提试剂盒)。反应体系如下所示：反应体积50μl，水21μl，2×extaqmix25μl，鸭腺病毒3-f(seqidno.1)、鸭腺病毒3-r(seqidno.2)各1μl，dna模板2μl。pcr反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒，52℃30秒，72℃30秒，35个循环；最后72℃延伸10分钟。用含goldenview(天泽基因公司)的1％琼脂糖凝胶电泳分析pcr产物。

结果：阴性对照未见任何条带，本发明病毒培养物出现了预期大小的dna片段(如图1所示)，片段大小为739bp。因此初步确定所分离的病毒为鸭腺病毒3型。

表1检测的引物序列

病毒株六邻体的序列分析

扩增鸭腺病毒3型六邻体hexon基因的引物鸭腺病毒3-2814-f、鸭腺病毒3-2814-r(seqidno：3、seqidno：4)如表2所示。利用pcr扩增目的基因hexon，并进行基因测序。hexon全长的核苷酸序列如seqidno：5所示，预期扩增hexon目的基因产物长度为2814bp。通过ncbiblast基因比对分析发现(表3)，gd06分离株hexon基因与鸭腺病毒3型属于同一分支，与鸭腺病毒3型gdmm10分离株(登录号：mh777398.1)和fjgt01(登录号：mh777395.1)比对发现，gd06株与它们的核苷酸相似性均为99.96％；与genbank数据库中zjjh07鸭腺病毒3型分离株(登录号：mh777397.1)和ahaq13(登录号：mh777396.1)核苷酸相似性为99.89％；与genbank数据库中鸭腺病毒2型gr分离株(登录号：nc_024486.1)核苷酸相似性为77.08％。

基于上述结果，可以确定gd06分离株为鸭腺病毒3型，并命名为gd06株。

本发明的鸭腺病毒3型gd06株，于2019年1月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccno：v201905。

表2全长扩增hexon基因的引物序列

表3本发明的gd06株与鸭腺病毒2型和3型参考毒株核苷酸序列相似性比较

本发明鸭腺病毒3型gd06株hexon全长的核苷酸序列为：

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病毒的滴度测定

于96孔板中接种lmh细胞，待细胞密度达到80％～90％时，取经鉴定的gd06株f3代病毒悬液，用无菌生理盐水以10倍递次稀释成10^-1～10^-8共8个不同稀释度。每个稀释度分别接种经生理盐水洗3次的lmh细胞10孔，每孔0.1ml。其他作为不接毒对照。放置37℃吸附1小时后，加入维持液，置37℃的co2培养箱中培养，观察24～168小时后细胞病变孔数并记录，按reed-muench法计算tcid50。

结果：以10^-1～10^-4稀释度接种的细胞孔全部出现病变(10/10)；10^-5稀释度接种的细胞出现5孔病变(5/10)；10^-6稀释度接种的细胞出现3孔病变(3/10)；10^-7和10^-8稀释度接种的细胞孔没有病变。经reed-muench法计算，gd06株f3代病毒液的tcid50为10^-5.3/0.1ml。

鸭腺病毒3型gd06株的稳定性

将gd06株在lmh细胞上连续传代，第1代鸭腺病毒3型病毒液命名为f1，第2代鸭腺病毒3型病毒液命名为f2，第10代鸭腺病毒3型病毒液命名为f10。细胞传代过程中发现，每个代次病毒液均能在细胞上形成病变，且72小时左右病变越来越明显。

结果：经过pcr扩增检测，鸭腺病毒3型f1、f5和f10代均能检测到病毒核酸(图2)，证明本发明鸭腺病毒3型gd06株能够稳定传代。

鸭腺病毒3型gd06株的致病性

取30只5日龄健康番鸭随机分成3组，每组10只。第一组经腿部肌肉注射gd06株f3代病毒液，0.5ml/只，病毒含量为10^6.0tcid50。第二组经腿部肌肉注射f5代病毒液，0.5ml/只，病毒含量为10^6.0tcid50。第三组经腿部肌肉注射生理盐水，0.5ml/只。

结果：注射后观察14日。发现第一组出现5/10死亡，第二组出现4/10死亡(表4)，感染后的死亡时间集中在注射后的第3至第7日。第三组(对照组)在整个观察期内未出现死亡(表4)。将本发明的病毒株注射到番鸭后，进行攻毒实验，如图3的a为攻毒后的番鸭，发现本发明的病毒株可以使番鸭出现肝脏肿大、苍白病变直至死亡，b为对照鸭。

表4gd06株不同代次的致病性

注：“/”表示无。

gd06株f3代发病模型的建立

取40只20日龄健康番鸭随机分成4组，每组10只。第一、二、三组分别经腿部肌肉注射gd06株f3代病毒液，0.5ml/只，病毒含量为10^6.0tcid50。第四组经腿部肌肉注射生理盐水，0.5ml/只，观察7日。

结果：第一组出现6/10死亡，第二组和第三组出现5/10死亡(表5)，感染后的死亡时间集中在3～6日。但是第四组(对照组)在整个观察期内未出现死亡。从上述发病死亡结果可以看出，本发明的鸭腺病毒3型gd06株能够致死番鸭，致病性强，免疫原性好。本发明首次建立了鸭腺病毒3型的发病模型，且其致死率不低于50％。该发病模型的建立有助于疫苗制备、抗体效价评估。

表5gd06株f3代的发病模型

注：“/”表示无。

疫苗的制备

取本发明gd06株病毒液接种于lmh细胞，逐日观察细胞病变，待培养至72小时后，收获病毒液，反复冻融3次。取病毒液2l，缓缓加入甲醛溶液，使病毒液的终浓度为0.2％，随后置37℃振荡灭活24小时。取本发明制备的灭活病毒液(抗原液)，利用鸭腺病毒3-f/r引物进行pcr检测，其pcr检测结果为阴性，证明检测不到鸭腺病毒，病毒彻底灭活。取制备好的彻底灭活的抗原液，按照1：2(v/v)加入montanideisa71vg佐剂(法国seppic公司)，8000r/min乳化10分钟即可制备成灭活疫苗，全病毒灭活疫苗，以作后续实验使用。

免疫

将上述步骤制备的灭活疫苗肌肉注射80日龄蛋鸡2000只，1ml/只。至蛋鸡94日龄时，再次免疫，剂量为1ml/只。至蛋鸡108日龄时，再次加强免疫一次，剂量为1ml/只。14日后，随机抽取3枚鸡蛋，利用琼扩监测蛋黄中的抗体效价，当抗体平均效价大于1：32时，收集所有鸡蛋。若琼扩抗体效价低于1：32则加强免疫1次。若当前抗体效价大于1：32，则每1个月监测1次抗体，当抗体效价低于1：32时，则立即加强免疫1次。

卵黄抗体的制备

将鸡蛋用0.1％新洁尔灭水溶液浸泡30分钟消毒后，采用无菌注射水将鸡蛋清洗2次后，取出，晾干。使用蛋黄分离机将鸡蛋分离取蛋黄，将蛋黄加入4倍无菌注射用水，混匀后缓缓加入辛酸，边加边搅拌，使辛酸终浓度为1％，随后静置30分钟。取上述混合液过滤，取澄清液体经100kda切向流超滤机超滤浓缩2～3倍。取样测定超滤后样品的琼扩效价，当抗体效价大于1：32时才能使用，将符合要求的超滤浓缩液置2～8℃保存1～2天。

结果：取2～8℃保存后的超滤浓缩液，经0.22μm滤膜过滤除菌，加入0.01％甲醛溶液，无菌分装，即可制成本发明的鸭腺病毒3型卵黄抗体。

对本发明制备的鸭腺病毒3型卵黄抗体再进一步的效果检测。

1.卵黄抗体的安全性

取30只5日龄的健康番鸭，随机分成3组，每组10只。第一组经腿部肌肉注射本发明的鸭腺病毒3型卵黄抗体(批号为201801)，2ml/只，卵黄抗体效价大于1:32。第二组腿部肌肉注射本发明的鸭腺病毒3型卵黄抗体(批号为201802)，2ml/只，卵黄抗体效价大于1:32。第三组腿部肌肉生理盐水，2ml/只，隔离饲养，观察15天。批号为201801以及201802均为本发明制备的鸭腺病毒3型卵黄抗体，为不同时间制备的两批产品。

结果：三组接种的番鸭未见不良反应，表明本发明所制备的鸭腺病毒3型卵黄抗体具有良好的安全性。

2.卵黄抗体的预防效果

取30只5日龄的健康番鸭随机分成3组，每组10只。第一组经腿部肌肉注射本发明制备的鸭腺病毒3型卵黄抗体(批号：201801)，0.2ml/只，卵黄抗体效价大于1:32。第二组经腿部肌肉注射本发明制备的鸭腺病毒3型卵黄抗体(批号：201801)，0.5ml/只，卵黄抗体效价大于1:32。第三组经腿部肌肉注射生理盐水，0.5ml/只。2日后，所有番鸭均肌肉注射本发明制备的gd06株f3病毒液0.5ml，病毒含量为10^6.0tcid50。

结果：对番鸭观察14日，发现第一组和第二组番鸭注射了本发明制备的卵黄抗体进行预防，未出现死亡个数；而第三组(对照组)死亡比例为5/10(表6)。上述结果表明，本发明制备的鸭腺病毒3型卵黄抗体能够有效预防鸭腺病毒3型的感染，免疫保护率为100％，效果显著。

表6本发明鸭腺病毒3型卵黄抗体的预防效果

注：“/”表示未使用抗体。

3.卵黄抗体的治疗效果

取30只5日龄健康番鸭随机分成3组，每组10只。三组番鸭均经腿部肌肉注射gd06株f3病毒液0.5ml，病毒含量为10^6.0tcid50。感染后，发现番鸭出现缩头，发育迟缓等症状时，即进行治疗。第一组经腿部肌肉注射201801批抗体，0.5ml/只，卵黄抗体效价大于1:32。第二组经腿部肌肉注射201801批抗体，1ml/只，卵黄抗体效价大于1:32。第三组经腿部肌肉注射生理盐水，0.5ml/只。

结果：注射后继续观察14日，发现第一组经治疗后，死亡率为1/10；第二组经治疗后，未出现死亡；第三组(对照组)则死亡率为6/10(表7)。上述结果表明，本申请制备的鸭腺病毒3型卵黄抗体能够有效治疗鸭腺病毒3型的感染，免疫治疗效果高于90％。

表7本发明鸭腺病毒3型卵黄抗体的治疗效果

注：“/”表示未使用抗体。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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<110>广东迈科特生物科技有限公司

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