本发明涉及功能微生物的筛选与应用
技术领域：
，具体涉及一种提高土壤肥力的复合微生物菌剂及其应用。
背景技术：
：化学肥料为农业发展做出了重大贡献，但是化学肥料也有二大缺点：一是由于大量使用化学肥料，造成了土壤板结、酸化、有机质缺乏、微生物减少、生产力下降等问题。二是普通化学肥料利用率低。据统计，中国当季氮肥利用率仅为20％～35％,磷肥的利用率为10％～20％,钾肥的利用率为30％～60％。肥料利用率低不仅造成资源浪费，还给环境带来严重污染。微生物肥与常规化肥相比，具有改良土壤、增加产量、提高品质、保护环境等优点。微生物肥中特定的功能微生物通过自身的生命活动促进土壤中物质的转化、提高作物营养水平、促进和协助营养吸收、刺激调控作物的生长，防治有害微生物等，来增加作物产量和提高作物品质。微生物肥料是将某些有益微生物经大量人工培养制成的生物肥料，又称菌肥、菌剂、接种剂。其原理是利用微生物的生命活动来增加土壤中的氮素或有效磷、钾的含量，或将土壤中一些作物不能直接利用的物质，转换成可被吸收利用的营养物质，或提高作物的生产刺激物质，或抑制植物病原菌的活动，从而提高土壤肥力，改善作物的营养条件，提高作物产量。根据其肥料功效大致可分为以下几类：(1)增加土壤氮素和作物氮素营养的菌肥，如根瘤菌肥、固氮菌肥、固氮蓝藻等；(2)分解土壤有机质的菌肥，如有机磷细菌肥料，综合性菌肥；(3)分解土壤难溶性矿物质的菌肥，如无机磷细菌肥料、钾细菌菌肥；(4)刺激植物生长的菌肥，如抗生菌肥料；(5)增加作物根吸收营养能力的菌肥，如菌根菌肥料。我国微生物肥的研究始于对根瘤菌的研究。在60年代初，陈华癸等将从紫云英中筛选出的根瘤菌制成菌剂，并进行了大面积的示范和推广。尹辛耘等利用从苜蓿根际分离到的放线菌，制成的“5406菌肥”得到广泛应用，促进了我国微生物肥的进一步发展。随着技术的进步，微生物肥逐渐成为生态示范区、绿色和有机农业生产基地的重要用肥之一。应用范围从豆科植物到粮食作物再到蔬菜、果树、花卉等植物，在农业生产中占据着越来越重要的位置。迄今为止，微生物肥料已在世界上60多个国家推广应用，这些国家和地区主要分布在亚洲、南美洲、欧洲和非洲等。为顺应农业可持续发展而研制的微生物肥料具有极其光明的应用前景，但其功能的发挥还没有尽善尽美，目前市售产品种类相对较少，而且使用效果不稳定，推广难度较大。因此，选育优良的具有解磷、解钾、固氮等功能的微生物菌种，仍然是目前微生物肥产品开发的首要任务。技术实现要素：本发明为解决现有技术问题，提供了一种提高土壤肥力的复合微生物菌剂，并提供了其制备方法和应用。所述复合微生物菌剂通过多种微生物的协同促进作用，可以有效提高土壤中有效磷的含量，显著提高土壤肥力，增加作物产量，同时还能抑制病虫害的发生，应用前景广泛。本发明一方面提供了一种复合微生物菌剂，包含枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)、凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)和绿色木霉(trichodermaviride)。所述枯草芽孢杆菌为申请人筛选获得的一株解磷菌，命名为枯草芽孢杆菌llh-3(bacillussubtilisllh-3)，已于2019年5月27日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctccno：m2019402。所述复合微生物菌剂中各组分及其重量比分别为：枯草芽孢杆菌60-80份、粪肠球菌30-40份、凝结芽孢杆菌20-40份和绿色木霉30-50份。进一步优选的，上述复合微生物菌剂中各组分及其重量比分别为：枯草芽孢杆菌80份、粪肠球菌30份、凝结芽孢杆菌30份和绿色木霉50份。进一步优选的，所述粪肠球菌的菌种编号为cgmcc1.125。进一步优选的，所述凝结芽孢杆菌的菌种编号为cgmcc1.4799。进一步优选的，所述绿色木霉的菌种编号为cgmcc3.3744。本发明另一方面提供了上述复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：1)将枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、凝结芽孢杆菌和绿色木霉分别活化后，扩大培养至对数生长期，将发酵液冷冻干燥，制成活菌量高达1010-1011cfu/g的超浓缩菌粉；2)将步骤(1)制得的超浓缩菌粉按照如下重量比：枯草芽孢杆菌60-80份、粪肠球菌30-40份、凝结芽孢杆菌20-40份和绿色木霉30-50份配制成复合微生物菌剂。上述枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、凝结芽孢杆菌和绿色木霉分别优选枯草芽孢杆菌cctccno：m2019402、粪肠球菌cgmcc1.125、凝结芽孢杆菌cgmcc1.4799和绿色木霉cgmcc3.3744。本发明还提供了上述复合微生物菌剂在农作物种植中的应用。所述复合微生物菌剂可以单独施用，用量为20-80kg/亩。所述复合微生物菌剂还可以按10-20％(质量比)的比例与无机肥和/或有机肥混合施用，用量为30-100kg/亩。有益效果本发明提供的复合微生物菌剂通过枯草芽孢杆菌llh-3、粪肠球菌、凝结芽孢杆菌和绿色木霉四种菌共同作用，能够产生协同促进效果，比单一菌种具有更好的肥效，产生了意料不到的技术效果。所述复合微生物菌剂能有效改善土壤肥力，促进作物生长，其肥效显著高于相同施用量的无机肥。与对照组相比，施用复合微生物菌剂的实验组中白菜株高、球高、横径分别提高了19.7％-21.0％，10.6％-19.3％，18.3％-22.2％，产量提高了19.3-22.9％。所述复合微生物菌剂还能有效降低白菜黑腐病和黑斑病的的发病率，比无机肥对照组分别降低了45.8％和67.2％，防治效果显著。所述复合微生物菌剂可以单独施用，也可以按10-20％(质量比)的比例与无机肥和/或有机肥混合施用，使作物产量普遍提高30-50％，而且对环境友好，有利于提升农作物的品质，推动传统农业向生态农业、绿色农业的转变，实现农业健康、可持续的发展。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。本发明所选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。其中：粪肠球菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为cgmcc1.125；凝结芽孢杆菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为cgmcc1.4799；绿色木霉购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为cgmcc3.3744。实施例1具有解磷功能微生物的筛选1、土壤样品：山东省青州市西南部山区的石灰性土壤。2、土壤稀释液的制备：称取0.5g土壤样品溶于4.5ml无菌水中制成1：10的土壤溶液，然后从中吸取0.5ml土壤溶液置于4.5ml无菌水中，制成1：100的土壤溶液，以此方法类推，制备1：106-107的土壤稀释溶液。取0.1ml土壤稀释溶液均匀涂布于难溶性无机磷固体培养基(葡萄糖10g,(nh4)2so40.5g,nacl0.3g,kc10.3g,mgso4·7h200.3g,feso4.7h200.03g,mnso4.4h200.03g,ca3(po4)25.0g,蒸馏水1000ml,ph7.0-7.5，琼脂20g,115℃灭菌30min)上，30℃培养箱中倒置培养3天，观察培养基上长出的菌落，其中有12个菌落周围产生了明显的颜色变化，并有透明圈产生，将其分别命名为llh-1，llh-2，llh-3，……，llh-12。实施例2解磷微生物的复筛将实施例1初筛得到的12株菌分别接种到难溶性无机磷固体培养基上，30℃培养3天后，观察菌落周围透明圈的大小，结果发现透明圈最大的三株菌分别为llh--2，llh--3，llh--10。将上述透明圈最大的三株菌分别接种到50ml难溶性无机磷液体培养基(葡萄糖10g,(nh4)2so40.5g,nacl0.3g,kc10.3g,mgso4.7h200.3g,feso4.7h200.03g,mnso4.4h200.03g，ca3(po4)25.0g,蒸馏水1000ml,ph7.0-7.5，115℃灭菌30min)中，30℃，200rpm，培养6天，同时以不加任何菌的液体解磷培养基作为对照组；分别检测培养液中的活菌数量。2.1磷标准曲线的绘制依次吸取5mg/l的磷标准溶液0.0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、3.2、4.0ml于试管中，然后各加入钼锑抗显色剂2ml，蒸馏水定容至20ml，摇匀静置20min，700nm波长下测定吸光度。此时各管中磷的浓度分为：0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.50、0.80、1.00mg/l。以磷浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制磷标准曲线。2.2培养液有效磷含量测定在无菌条件下分别取上述三株菌的培养液各5ml，8000rpm，离心5min，取上清液，稀释到合适的浓度，吸取0.5ml稀释液至试管中，加5ml蒸馏水，加2滴2,4-二硝基酚指示剂，加2ml钼锑抗显色剂，然后用蒸馏水定容至20ml，摇匀静置20min，于700nm波长下比色，吸光度值代入标准曲线计算上清液中的有效磷含量，具体结果见表1。表1不同菌株的解磷效果从表1中的数据可以看出，申请人从土壤样品中筛选到的三株菌均具有较强的解磷能力，能将培养基中的难溶磷(ca3(po4)2)分解成可溶性的有效磷，且效果显著。其中，llh-3菌株的解磷效率最高达85％，有效磷含量高达856mg/l，取得了意料不到的效果。实施例3llh-3菌株的鉴定1)llh-3菌株的菌落形态：所述llh-3菌株的菌落扁平，表面粗糙，不透明，边缘初期光滑后变粗糙，菌落呈现白色至污白色，芽孢大小约为0.5-0.9×0.8-1.3μm，椭圆形或柱状，中生或近中生；革兰氏反应阳性，过氧化氢酶反应阳性，v.p反应阳性，淀粉水解试验阳性，吲哚试验阳性，可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇，生长温度范围20-45℃，ph范围5-10。2)llh-3菌株的分子生物学鉴定：采用分子生物学的方法对上述筛选得到的llh-3菌株进行鉴定，测得其16srdna序列seqidno:1，并在genbank核酸数据库中进行blast比对。seqidno:1如下所示：结合llh-3菌株的菌落形态和16srdna比对结果，申请人确认llh-3菌株为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，命名为枯草芽孢杆菌llh-3(bacillussubtilisllh-3)。申请人已于2019年5月27日将上述枯草芽孢杆菌llh-3(bacillussubtilisllh-3)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2019402。实施例4枯草芽孢杆菌llh-3的产酶活力测定1、菌液的制备挑一环新鲜的枯草芽孢杆菌llh-3菌泥，接种于100mllb培养基(1000ml水，10.0蛋白胨，5.0酵母浸粉，5.0gnacl，ph7.0-7.2)中，30℃、200rpm培养12-16h即成种子液；将种子液以5％接种量接种至灭菌营养肉汤培养基中，30℃、200rpm培养28-32h，镜检芽孢产率在95％以上时停止发酵培养，得到活菌含量为108-109cfu/ml的发酵液。2、酶活检测将发酵液在4℃条件下，8000rpm，离心5min，取上清，按照下述方法分别测定发酵上清液中的植酸酶和纤维素酶酶活。结果显示，本发明筛选获得的枯草芽孢杆菌llh-3具有较强的产酶能力，所述发酵上清液中植酸酶酶活高达13.5u/ml，纤维素酶酶活高达4.04u/ml，取得了意料不到的技术效果。(1)植酸酶酶活测定方法酶活单位的定义：在30℃、ph值为5.0的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的植酸钠溶液中释放1μmol无机磷所需要的酶量即为一个酶活力单位u。测定方法：取4ml浓度为7.5mmol/l的植酸钠溶液(ph5.00.25mol/l乙酸缓冲液配制)，加入到比色管中，30℃平衡5min，再加入2ml经ph5.00.25mol/l乙酸缓冲液适当稀释并经30℃平衡好的植酸酶酶液，混匀于30℃精确保温反应30min。反应结束后，加入4ml终止液(2份硝酸溶液(硝酸：水＝1:2)、1份100g/l钼酸铵溶液、1份2.35g/l钒酸铵溶液)，混匀以终止反应。然后室温放置10min显色，分光光度计415nm处测定吸光值。酶活计算公式：u＝(a-a0-0.0016)×f/(0.0415×30)式中：a为样品的吸光值；a0为空白样品的吸光值；f为实际样液反应前的总稀释倍数；30为酶解反应时间，min。(2)纤维素酶酶活测定方法酶活单位的定义：在50℃、ph值为6.0的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的羟甲基纤维素钠溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u，还原糖以葡萄糖等量。测定方法：取三支试管各加入0.5mlcmc底物，与待测酶液一起50℃水浴预热5min。在第一、二试管中各加入0.5ml待测液，并计时，50℃水浴中反应15min。反应完后在三支试管中各加入1.5mldns试剂，并在第三支试管总补加0.5ml的待测酶液。取出并摇匀三支试管后，在沸水浴中反应5min。迅速冷却至室温，用水定到5.0ml。以第三支试管试液为对照在540nm波长条件下测第一、二试管试液的吸光度，吸光度在0.25-0.35之间为宜。待测酶液反应液的吸光度与水平控制酶液反应液吸光度之差的绝对值不超过0.015。酶活x＝(葡萄糖等量值/180/15/0.5)×n其中:x——酶活力单位，iu/g(ml)；180——葡萄糖从微克换算成微摩尔；15——待测液与底物的反应时间；0.5——加入反应的待测酶液量；n——稀释倍数。实施例5枯草芽孢杆菌llh-3在菠菜大田栽培实验中的应用1、地点：青岛市莱西菠菜种植大棚，土壤整体状况较为均匀。2、实验过程设置30个实验区，每个实验区为2m×2m的方形区域，且每个实验区之间保持1米的间隔。实验共设3个组：①空白对照组：不添加任何物质；②培养基处理组：在每个实验区中按40ml/m2的比例均匀喷洒上述灭菌的营养肉汤培养基，然后将表层5-10cm厚的土壤进行有效混匀；③枯草芽孢杆菌llh-3处理组：在每个实验区中按60ml/m2的比例均匀喷洒实施例4所述枯草芽孢杆菌llh-3发酵菌液(108-109cfu/ml)，然后将表层5-10cm厚的土壤进行有效混匀。每个组随机选择10个实验区。1)种子处理：用5％的次氯酸钠表面灭菌菠菜种子10min，用蒸馏水清洗3-4次除去次氯酸钠后在常温下放置30min自然干燥。2)播种与收获：在每个实验区均匀播种25g菠菜种子，定时浇水和管理，不施加肥料。播种50天后，收获全部菠菜，并分别检测每个实验区菠菜的鲜重和干重，计算每个处理组菠菜的平均鲜重和平均干重，进行比较。3)收获菠菜的同时，分别采集每个实验区的土样，采用olsen法检测土样中有效磷的含量，并进行比较。试验结果表明：与空白对照组相比，培养基处理组菠菜的平均鲜重和干重分别提高了4.8％和4.1％，有效磷含量提高了3.2％；枯草芽孢杆菌llh-3处理组菠菜的平均鲜重和干重比空白对照组分别提高了295.7％和228.2％，比培养基处理组分别提高290.9％和224.1％，有效磷含量比空白处理组提高了78.5％，比培养基处理组提高了75.3％。上述结果表明本发明筛选到的枯草芽孢杆菌llh-3能极显著提高土壤肥力，从而大幅提高种植作物的产量，可作为生物肥广泛应用于农业生产领域。实施例6枯草芽孢杆菌llh-3在水稻育苗中的应用1、菌粉制备挑一环新鲜的枯草芽孢杆菌llh-3菌泥，接种于100mllb培养基中，30℃、200rpm培养12-16h即成种子液；将种子液以5％接种量接种至灭菌营养肉汤培养基中，30℃、200rpm培养28-32h，镜检芽孢产率在95％以上时停止发酵培养；将发酵液离心(8000rpm，5min)收集菌体，加入糊精搅拌混匀，真空冷冻干燥，制成菌量为109-1010cfu/g的枯草芽孢杆菌llh-3菌粉。2、实验过程(1)实验地点：辽宁省丹东市的育苗大棚。(2)实验设计：①空白对照组：仅采用育苗基质(购自哈尔滨苗生壮农业科技发展有限公司)；②枯草芽孢杆菌cgmcc1.8886对照组：1.5kg枯草芽孢杆菌cgmcc1.8886菌粉(109-1010cfu/g)与1吨育苗基质掺匀；③枯草芽孢杆菌llh-3处理组：1.5kg枯草芽孢杆菌llh-3菌粉(109-1010cfu/g)与1吨育苗基质掺匀；以上两个处理组的播种、灌溉和施肥等管理相同，整个育苗期约为40天。3、实验结果及分析(1)水稻秧苗形态及叶绿素含量评价从各处理组育苗盘的中央随机抽取100株秧苗，用清水冲洗干净后进行考苗，并检测第二叶的叶绿素含量。结果见表3。表2枯草芽孢杆菌llh-3对水稻苗株生长的影响从表2的数据可知，与空白对照组相比，本发明提供的枯草芽孢杆菌llh-3处理组的水稻秧苗的株高，茎粗，根数，叶龄，第二叶长，叶绿素含量分别提高了24.1％，27.3％，29.3％，30.9％，10.3％，10.2％，效果非常显著。而采用市售的枯草芽孢杆菌cgmcc1.8886处理后的水稻秧苗，仅株高和茎粗分别提高了10.2％和8.9％，而根数、叶龄、第二叶长和叶绿素含量增长均不明显。从而说明，本发明提供的枯草芽孢杆菌llh-3能显著提高水稻的育苗质量，效果明显优于市售的枯草芽孢杆菌。(2)水稻秧苗素质评价百株干重和壮苗指数是秧苗素质高低的重要指标。壮苗指数＝(茎粗×100株秧苗全株干重)/株高。本发明提供的枯草芽孢杆菌llh-3处理组的水稻秧苗百株干重和育苗指数比空白对照组分别增加了38.56％和58.07％，比枯草芽孢杆菌cgmcc1.8886对照组分别增加了30.48％和48.76％，取得了意料不到的技术效果。实施例7枯草芽孢杆菌llh-3抑菌能力测定1、培养致病真菌：在无菌操作台中，用镊子分别取约0.5cm×0.5cm的小块的花生根腐病菌、白绢病菌、疮痂病菌和褐斑病菌接种至pda培养基中，28℃倒置培养3天。2、接种对峙菌：待致病真菌长至约占培养皿1/3时，在距离真菌2cm处分别接种枯草芽孢杆菌llh-3，以未接种枯草芽孢杆菌llh-3的真菌作为对照，继续在28℃条件下培养3天后，分别测定各致病真菌的菌落半径，计算抑菌率。抑菌率＝[(对照真菌生长半径-处理真菌生长半径)/对照真菌生长半径]×100％。结果显示，枯草芽孢杆菌llh-3对上述四种花生致病真菌均有明显的拮抗作用。其中，llh-3对花生根腐病菌和疮痂病菌的抑制作用最强，抑制率分别高达87.4％和81.6％；对花生白绢病菌和褐斑病的抑制作用相对较弱，抑制率分别为63.3％和59.8％。实施例8枯草芽孢杆菌llh-3在花生病害防治中的应用1、实验地点：青岛平度后沙岭村的花生连作田，花生根腐病、白绢病、疮痂病和褐斑病发生严重。2、实验设计：随机设置实验区，每个实验区为6m×10m的长方形区域，且每个实验区之间保持3米以上的间隔。花生的行距为40cm，株距20cm。每个实验组设置三个平行实验区。(1)空白对照组：清水；(2)杀菌剂处理组：50％多菌灵800倍液；(3)枯草芽孢杆菌cgmcc1.8886处理组：分别在播种期、播种后15d、30d、45d利用枯草芽孢杆菌llh-3发酵液(108-109cfu/ml)灌根，每株每次浇稀释100倍发酵液约30ml；(4)枯草芽孢杆菌llh-3处理组：分别在播种期、播种后15d、30d、45d利用枯草芽孢杆菌llh-3发酵液(108-109cfu/ml)灌根，每株每次浇稀释100倍发酵液约30ml。其他田间管理同正常生产，75天后调查发病情况，结果如表3-6所示。根腐病分级标准：0级:茎基和主须根上均无病斑；1级:茎基和主根上有少量病斑；3级:茎基和主根上病斑较多,病斑面积占茎基和根总面积的1/4～1/2；5级:茎基和主根上病斑多且大,病斑面积占茎基和根总面积的1/2～3/4；7级:茎基和主根上病斑连片,形成绕茎现象,但根系并未死亡；9级:根系坏死,植株地上部萎蔫或死亡。白绢病分级标准：0级：植株无症状；1级：仅在茎基部产生病斑；2级：茎基部产生缢缩症状,整株的三分之一以下表现系统症状(枯萎、死亡、萎蔫等)；3级：整株的三分之二以下表现系统症状；4级：整株的三分之二以上表现系统症状。疮痂病分级标准：0级：健康植株1级：在顶部嫩叶和果柄上出现小病斑2级：在嫩叶、果柄、茎上出现小病斑3级：嫩叶边缘向上卷曲，在花生茎和果柄上出现疮痂状4级：果柄、茎严重弯曲，植株现灼烧状褐斑病分级标准：0级：无病害症状；1级：受害叶片面积占调查叶片面积的1/10以下；2级：受害叶片面积占调查叶片面积的1/4以下；3级：受害叶片面积占调查叶片面积的1/2以下；4级：受害叶片面积占调查叶片面积的1/2以上，落叶。病株率＝发病株数/总株数×100％病情指数＝∑(发病级代表值×各级病株数)×100/(调查总株数×最高级发病代表值)防治效率＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％表3花生根腐病防治效果比较表4花生白绢病防治效果比较表5花生疮痂病防治效果比较表6花生褐斑病防治效果比较从表3-6的大田实验数据可以看出，本发明提供的枯草芽孢杆菌llh-3对花生根腐病、白绢病、疮痂病和褐斑病均有明显的防治效果，其中对根腐病和疮痂病的防治效率超过80％，对白绢病和褐斑病的防治效率超过60％，显著高于药剂处理组多菌灵的防治效果。而市售的枯草芽孢杆菌cgmcc1.8886对花生根腐病、白绢病、疮痂病和褐斑病具有一定的防治效果，但防治效率仅为11.7％-13.6％，远低于本发明所述枯草芽孢杆菌llh-3。上述结果表明，本发明提供的枯草芽孢杆菌llh-3对花生常见病害的防治效果要显著优于传统的化学杀菌剂，且对环境友好，有利于提升农作物的品质，可广泛应用于绿色农业生产中。实施例9一种复合微生物菌剂，其各组分及其重量分别为：枯草芽孢杆菌llh-360份、粪肠球菌40份、凝结芽孢杆菌40份和绿色木霉45份。上述复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：1)将枯草芽孢杆菌llh-3、粪肠球菌、凝结芽孢杆菌和绿色木霉分别活化后，扩大培养至对数生长期，将发酵液冷冻干燥，制成活菌量高达1010-1011cfu/g的超浓缩菌粉；2)将步骤(1)制得的超浓缩菌粉按照如下重量比：枯草芽孢杆菌llh-360份、粪肠球菌40份、凝结芽孢杆菌40份和绿色木霉45份配制成复合微生物菌剂。实施例10一种复合微生物菌剂，其各组分及其重量比分别为：枯草芽孢杆菌llh-370份、粪肠球菌33份、凝结芽孢杆菌20份和绿色木霉30份。制备方法参照实施例9。实施例11一种复合微生物菌剂，其各组分及其重量比分别为：枯草芽孢杆菌llh-380份、粪肠球菌30份、凝结芽孢杆菌30份和绿色木霉50份。制备方法参照实施例9。实施例12复合微生物菌剂在白菜种植中的应用1、复合微生物菌剂对白菜生长性能和产量的影响在青岛市莱西蔬菜种植区选取土质肥沃、地力均匀的地块，栽植大白菜苗，分别于1个月、两个月时分别施用本发明实施例9，10，11制备得到的复合微生物菌剂，施肥量10kg/亩，同时，以施用等量无机肥作为对照组，3个月时对实验组和对照组的白菜进行测评，结果如表7所示。表7复合微生物菌剂对白菜生长性能和产量的影响处理施肥株高(cm)球高(cm)横径(cm)亩产量(kg)对照组无机肥30.521.815.33126实验组1实施例936.924.118.13728实验组2实施例1036.524.518.43760实验组3实施例1136.926.018.73842从表7中的数据可以看出，与对照组相比，施用复合微生物菌剂的实验组中白菜株高、球高、横径分别提高了19.7％-21.0％，10.6％-19.3％，18.3％-22.2％，产量提高了19.3-22.9％，增产效果显著。从而说明，本发明生产的复合微生物菌剂能有效改善土壤肥力，促进大白菜生长，其肥效显著高于相同施用量的无机肥。而且，三个实验组中，施用实施例11所述复合微生物菌剂的实验组3的白菜各个指标明显高于实验组1和实验组2。2、复合微生物菌剂中四种菌的协同作用评价(1)微生物菌剂样品1：枯草芽孢杆菌llh-3菌粉，有效活菌数约1010cfu/g；样品2：屎肠球菌菌粉，有效活菌数约1010cfu/g；样品3：凝结芽孢杆菌菌粉，有效活菌数约1010cfu/g；样品4：绿色木霉菌粉，有效活菌数约1010cfu/g；样品5：实施例11所述复合微生物菌剂，由枯草芽孢杆菌llh-3、粪肠球菌、凝结芽孢杆菌和绿色木霉组成，总有效活菌数约1010cfu/g；(2)实验过程在青岛市莱西蔬菜种植区选取土质肥沃、地力均匀的地块，栽植大白菜苗，分别于1个月、两个月时分别施用样品1-5所述微生物菌剂，施肥量10kg/亩，同时，以施用等量无机肥作为对照组，3个月时对实验组和对照组的白菜进行测评，结果如表8所示。表8复合微生物菌剂对白菜生长性能和产量的影响处理施肥球高(cm)横径(cm)亩产(kg)亩产较ck±％对照组无机肥21.815.33126-实验组1样品124.717.5362015.8％实验组2样品217.114.22428-22.3％实验组3样品322.816.334058.9％实验组4样品422.015.431861.9％实验组5样品526.018.7384222.9％从表8的数据可以看出：(1)单独施用枯草芽孢杆菌llh-3菌粉的实验组1和单独施用凝结芽孢杆菌菌粉的实验组3白菜的生长性能显著高于无机肥对照组，亩产比对照组分别提高15.8％和8.9％，说明枯草芽孢杆菌llh-3或凝结芽孢杆菌单独作用，均能有效提高土壤肥力，效果优于等量的无机肥；(2)单独施用屎肠球菌菌粉的实验组2白菜的生长性能和亩产均低于无机肥对照组，说明屎肠球菌单独作用对土壤肥力的提升效果不如等量的无机肥；(3)单独施用绿色木霉菌粉的实验组4白菜的生长性能和亩产与无机肥对照组基本相当，说明绿色木霉单独作用对土壤肥力的提升效果与等两无机肥相当。(4)施用等量由枯草芽孢杆菌llh-3、粪肠球菌、凝结芽孢杆菌和绿色木霉组成的复合微生物菌剂的实验组5，白菜的生长性能显著高于实验组1和实验组3，亩产比对照组提高了22.9％，也显著高于实验组1和实验组3。上述结果说明，本发明提供的复合微生物菌剂中枯草芽孢杆菌llh-3、粪肠球菌、凝结芽孢杆菌和绿色木霉四种菌共同作用，能够产生协同促进效果，比单一菌种具有更好的肥效，产生了意料不到的技术效果。此外，申请人在实验过程中还发现，本发明提供的复合微生物菌剂除了能大幅提高土壤肥力，促进作物生长之外，还能有效降低白菜黑腐病和黑斑病的的发病率，比无机肥对照组分别降低了45.8％和67.2％，效果显著。实施例12复合微生物菌剂在玉米种植中的应用1、实验地点：青岛市平度李家屯村，土壤整体状况较为均匀。2、实验样品：1)样品：实施例11所述复合微生物菌剂，总有效活菌数约1010cfu/g。2)传统复合肥样品：为史丹利三安复合肥，其中n-p2o5-k2o，26-14-14，总养分≥54％。3、实验过程：1)供试土壤ph值6.7-7.0，经测定，土壤中有效磷含量约为1.53mg/kg。2)玉米品种：先玉335。3)每个实验小区面积400平米，共5个处理，每个处理设3个平行，各实验小区随机排列。对照组：只施用传统复合肥，施用量为40kg/亩；处理组1：将本发明提供的复合微生物菌剂按10％(质量比)的添加比例对传统复合肥进行包衣，施用量为40kg/亩；处理组2：将本发明提供的复合微生物菌剂按10％(质量比)的添加比例对传统复合肥进行包衣，施用量为30kg/亩。处理组3：将本发明提供的复合微生物菌剂按10％(质量比)的添加比例对传统复合肥进行包衣，施用量为25kg/亩。处理组4：将本发明提供的复合微生物菌剂按15％(质量比)的添加比例对传统复合肥进行包衣，施用量为20kg/亩。玉米于2018年5月11日种肥同时播种，行距50±1cm，株距25±1cm。其它田间日常管理各实验小区保持一致。2019年9月25日对各实验小区玉米分别收获，测定产量，并计算各处理组玉米的增产情况，具体结果见表9。3、实验结果表9不同处理组玉米的产量比较从表9的结果可以知道，与对照组相比，在相同施肥量的情况下，添加本发明提供的复合微生物菌剂的处理组1玉米产量提高了30.7％；当施肥量减少25％时，添加复合微生物菌剂的处理组2仍能实现玉米增产22.5％；当施肥量减少50％时，添加复合微生物菌剂的处理组3玉米产量仍能比对照组略高，实现了减肥不减产，取得了意料不到的效果。而且，随着复合微生物菌剂添加比例的增加(由10％增加至15％)，处理组4的玉米产量与处理组3相比得到显著提高。上述结果表明，本发明所提供的复合微生物菌剂通过枯草芽孢杆菌llh-3、粪肠球菌、凝结芽孢杆菌和绿色木霉之间的协同促进作用，能有效提高土壤中有效磷的含量，不仅能大幅提高作物产量，还有助于降低环境污染。所述复合微生物菌剂可以单独施用，也可以按10-20％(质量比)的比例与无机肥和/或有机肥混合施用，可以使作物产量提高30-50％，市场前景广阔。序列表<110>青岛力力惠生物科技股份有限公司<120>一种提高土壤肥力的复合微生物菌剂及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>960<212>dna<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)<400>1ctctagggttttcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaa60accacatgctccaccgcttttgcgggcctccgtcaattcctttgagttttagccttgcgg120ccgtactccccaggcggagtggttaatgcgttaacttcagcactaaagggcggaaaccct180ctaacacttagaactcatcctttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgct240ccccacgctttcgcgcctcagtgtcagttacagaccagaaagtcgccttcgccactggtg300ttcctccatatctctacgcatttcaccgctacacatggaattccactttcctcttctgca360ctcaagtctcccagtttccaatgaccctccacggttgagccgtgggctttcacatcagac420ttaagaaaccacctgcgcgcgctttacgcccaataattccggataacgcttgccacctac480gtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaagg540tgccagcttattcaactagcacttgttcttccctaacaacagagttttacgacccgaaag600ccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcgggggattccgtc660ctgctgcctcccctaggaggctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctct720caggtcggctacgcatcgttgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgac780gcgggtccatccataagtgacagccgaagccgcctttcaatttcgaaccatgcagttcaa840aatgttatccggtattagccccggtttcccggagttaccccagtcttatgggcaggttac900ccacgtgttactcacccgtccgccgctaactcactcgagcatgctactagcttttgcccc960当前第1页12