一种生物腐熟剂及其在堆肥中的应用的制作方法

本发明涉及功能微生物的筛选与应用
技术领域：
，具体涉及一种生物腐熟剂及其在堆肥中的应用。
背景技术：
：堆肥是目前最常用的无害化处理畜禽粪便、作物秸秆、生活垃圾、城市污泥等废弃有机物料的方法。传统的堆肥法一般都是采用增加营养和改善环境条件的方法，利用堆制原料中的土著微生物来降解有机污染物，但由于堆肥初期土著微生物量少，需要一定时间才能繁殖起来，并且各种微生物分解速度差别很大，因此传统堆肥往往存在发酵时间长、产生臭味且肥效低等问题。而现代堆肥技术普遍采用人工接种分解有机物能力强的微生物的方法。由于微生物的表面积比较大，代谢旺盛，数目巨大，繁殖迅速，在堆肥化过程中对有机物质降解起主导作用。有机堆肥的发酵过程简单可分为以下4个阶段：1、发热阶段堆肥制作初期，堆肥中的微生物以中温、好气性的种类为主。它们启动堆肥的发酵过程，在好气性条件下旺盛分解易分解有机物质(如简单糖类、淀粉、蛋白质等)，产生大量的热，不断提高堆肥温度，从20℃左右上升至40℃，称为发热阶段，或中温阶段。2、高温阶段随着温度的提高，好热性的微生物逐渐取代中温性的种类而起主导作用，温度持续上升，一般在几天之内即达50℃以上，进入高温阶段。在高温阶段，好热性的微生物对堆肥中复杂的有机物质(如纤维素、半纤维素、果胶物质等)进行强烈分解，热量积累，堆肥温度上升至60-70℃，甚至可高达80℃。随即大多数好热性微生物也大量死亡或进入休眠状态(20天以上)，这对加快堆肥的腐熟有很重要的作用。堆肥高温期作为有机大分子分解的主要阶段，也是保障堆肥无害化的重要阶段。因为许多堆肥用的基质携带人类、动植物的病原体，以及杂草种子。在堆肥过程中，通过短时间的持续升温，能够使动植物病原体以及杂草种子失活3、降温阶段当高温阶段持续一定时间后，纤维素、半纤维素、果胶物质大部分已被分解，剩下很难分解的复杂成分(如木质素)和新形成的腐殖质，微生物的活动减弱，温度逐渐下降。当温度下降到40℃以下时，中温性微生物又成为优势种类。如果降温阶段来的早，表明堆制条件不够理想，植物性物质分解不充分。这时可以翻堆，将堆积材料拌匀，使之产生第二次发热、升温，以促进堆肥的腐熟。4、腐熟保肥阶段堆肥腐熟后，体积缩小，堆温下降至稍高于气温，这时应将堆肥压紧，造成厌气状态，使有机质矿化作用减弱，以利于保肥。简而言之，有机堆肥的发酵过程实际上就是各种微生物新陈代谢、繁殖的过程。微生物的新陈代谢过程即有机物分解的过程。有机物分解必然会产生能量，这些能量推动了堆肥化进程，使温度升高，同时还可干燥湿基质。参与堆肥过程的主要微生物种类是细菌、真菌以及放线菌等。这些微生物都有中温菌和高温菌。但目前市售的腐熟接种菌剂大多数是中温性的微生物，他们虽然能缩短堆肥的启动期，使堆肥迅速进入高温期，但却不能延长高温期，加速物质的分解，因为接种的中温性微生物在高温期迅速死亡，因此，缩短整个堆肥腐熟的时间是非常有限的。而堆肥最重要的阶段是高温期，大多数的有机物特别是纤维素、半纤维素等是在高温期分解的，高温期的长短决定了整个堆肥的堆制时间，甚至决定了堆肥的成败。因此，接种高效的高温微生物菌株，缩短堆肥的启动期，延长高温分解期，是缩短堆肥过程，提高堆肥质量的关键。技术实现要素：本发明为解决现有技术问题，提供了一种生物腐熟剂，并提供了其制备方法和应用。所述腐熟剂通过多种微生物的协同促进作用，可以有效提高堆肥温度，延长高温期，缩短堆肥时间，应用前景广泛。本发明一方面提供了一种生物腐熟剂，包含植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、白浅灰链霉菌(streptomycesalbogriseolus)、克鲁斯假丝酵母(candidakrusei)和绿色木霉(trichodermaviride)。所述植物乳杆菌为申请人筛选获得的一株耐高温菌株，命名为植物乳杆菌llh-2(lactobacillusplantarumllh-2)，已于2019年5月27日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctccno：m2019401。所述生物腐熟剂中各组分及其重量比分别为：植物乳杆菌120-150份、枯草芽孢杆菌90-130份、白浅灰链霉菌80-120份、克鲁斯假丝酵母90-140份和绿色木霉80-130份。进一步优选的，所述生物腐熟剂中各组分及其重量比分别为：植物乳杆菌150份、枯草芽孢杆菌120份、白浅灰链霉菌120份、克鲁斯假丝酵母95份和绿色木霉110份。进一步优选的，所述枯草芽孢杆菌的保藏号为cctccno：m2019402。进一步优选的，所述白浅灰链霉菌的菌种编号为cgmcc4.6301。进一步优选的，所述克鲁斯假丝酵母的菌种编号为cgmcc2.2918。进一步优选的，所述绿色木霉的菌种编号为cgmcc3.3744。本发明另一方面提供了上述生物腐熟剂的制备方法，包括如下步骤：1)将植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、白浅灰链霉菌、克鲁斯假丝酵母和绿色木霉分别活化后，扩大培养至对数生长期，将发酵液冷冻干燥，制成活菌量高达1010-1011cfu/g的超浓缩菌粉；2)将步骤(1)制得的超浓缩菌粉按照如下重量比：植物乳杆菌120-150份、枯草芽孢杆菌90-130份、白浅灰链霉菌80-120份、克鲁斯假丝酵母90-140份和绿色木霉80-130份配制成生物腐熟剂。本发明还提供了上述生物腐熟剂在有机物料堆肥中的应用。所述有机物料包括蘑菇菌渣、玉米皮、花生壳、畜禽粪便、作物秸秆、城市污泥、餐厨垃圾、食品加工或制药废渣中的任意一种或两种或多种的组合。所述生物腐熟剂的添加量为0.5-5kg/吨物料。有益效果本发明提供的生物腐熟剂通过耐热植物乳杆菌llh-2与多种微生物的协同作用，可以迅速升高堆肥温度，延长高温期的持续时间，快速杀灭堆肥中病原微生物，加快腐熟进程，大大提高堆肥的腐熟度和肥效。在蘑菇菌渣堆肥过程中，接种所述生物腐熟剂的处理组堆体升温较快，在堆肥第2天温度即超过55℃。整个堆肥过程中，腐熟剂处理组堆体的最高温度均达到75℃以上，尤其是实施例7腐熟剂处理组的堆体温度最高达到78℃，显著高于对照组(61℃)。而且腐熟剂处理组的高温期持续时间比对照组多了3天。腐熟剂处理组堆肥的腐熟度和肥效得到显著提高，c/n值均低于16，发芽指数高达116.0％-121.2％，能大幅提高土壤肥力，促进作物生长。施用腐熟剂处理组堆肥后，花生和白菜的产量普遍提高38％-62％。此外，腐熟剂处理组堆肥还能有效防治作物的常见病害，降低发病率。其中，花生根腐病、白绢病、疮痂病和褐斑病的发病率降低了51.2％-63.4％，白菜黑腐病和黑斑病的发病率也分别降低了47.2％和55.8％，取得了意料不到的技术效果。所述生物腐熟剂可广泛用于玉米皮、花生壳、秸秆、畜禽粪便、餐厨垃圾等有机废弃物料的腐熟，效果显著。附图说明图1为鸡粪堆肥过程中堆体的温度变化图；图2为蘑菇菌渣堆肥过程中堆体的温度变化图。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。本发明所选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。白浅灰链霉菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为cgmcc4.6301；克鲁斯假丝酵母购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为cgmcc2.2918；绿色木霉购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为cgmcc3.3744。枯草芽孢杆菌为申请人从山东省青州市西南部山区的石灰性土壤中筛选到的一株解磷菌，命名为枯草芽孢杆菌llh-3(bacillussubtilisllh-3)，已于2019年5月27日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2019402。该菌株能将难溶磷(ca3(po4)2)分解成可溶性的有效磷，解磷效率最高达85％。该菌株还有较强的产酶能力和抑菌能力，其发酵液中植酸酶酶活高达13.5u/ml，纤维素酶酶活高达4.04u/ml，对根腐病菌、白绢病菌、疮痂病菌和褐斑病菌具有明显的拮抗作用。实施例1耐高温乳酸菌的筛选及与鉴定1.1耐高温乳酸菌的筛选样品：山东省青岛市平度蓼兰镇养殖场沼气池底部污泥。将污泥样品经70℃高温富集培养，用梯度稀释法分离得到55株耐高温纯菌株。将分离得到的菌株分别接种至加0.5％碳酸钙的mrs平板(蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温80ml，琼脂15g，蒸馏水1.0l组成，ph6.5±0.2)上，37℃培养48h，分离培养有透明圈的菌株，获得3株乳酸菌，分别命名为llh-1，llh-2，llh-3；将上述3株乳酸菌分别接种于50mlmrs肉汤培养基中，分别在37℃，50℃和70℃条件下，各培养48h，用hplc分别测定培养基中乳酸的含量，用ph计测定培养基的ph，具体结果如表1所示。表1耐高温乳酸菌在不同培养温度下产酸能力比较从表1的结果可以看出，本发明筛选到的3株乳酸菌中，llh-2菌株在37℃、50℃、70℃条件下的乳酸产量均最高，且发酵后培养基的ph值也最低，从而说明llh-2菌株的综合产酸能力最强。而且，与37℃条件下的乳酸产量相比，llh-2菌株在50℃和70℃高温条件下分别保留了高达85.1％和65.2％的乳酸产量，发酵后培养基的ph值分别为3.55和4.07。从而说明，本发明筛选到的llh-2菌株具有很强的耐热性，在50-70℃高温条件下仍能大量存活和繁殖，并高效分泌乳酸等酸类物质，效果非常显著。1.2菌株鉴定llh-2菌株的菌落为乳白色，边缘整齐；革兰氏染色呈阳性，细胞形态为短杆状、无芽孢；在15℃-70℃条件下生长状况良好。llh-2菌株在摇瓶mrs肉汤培养基中培养24小时后，活菌数量超过10亿个/ml。采用分子生物学的方法对上述筛选得到的llh-3菌株进行鉴定，测得其16srdna序列seqidno:1。将seqidno:1在genbank核酸数据库中进行blast比对，发现其与植物乳杆菌的16srdna序列相似性最高达98.56％。seqidno:1如下所示：aaagatggcttcggctatcacttctggatggtcccgcggcgtattaggtagatggtggggtaacggctcaccatggcaaagatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacggggggcagcagtagggaattttccaaaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaaactcttttgttaaagaagaacatatctgagagtaaattttcaggtattgacggtatttaaccagaaagccacggctaactacctgccagcaggcggggtaattcgtaggtggcaagggttgtcaggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagcctttggctcaaccgaagaagtgcatcggaaactgggaaaattgaatgcagaagaggacagtggaactctatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagtatgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccataccgtaaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatactatgcaaatctaagagattagacgttcccttcggggacatggatacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattatcagttgccagcattaagttgggcactctggtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgaactcgcgagagtaagctaatctcttaaagccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagtcggtggggtaaccttta结合llh-2菌株的菌落形态和16srdna比对结果，申请人确认llh-2菌株为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，命名为植物乳杆菌llh-2(lactobacillusplantarumllh-2)。申请人已于2019年5月27日将上述植物乳杆菌llh-2(lactobacillusplantarumllh-2)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2019401。实施例2植物乳杆菌llh-2产蛋白酶活力测定将植物乳杆菌llh-2接入mrs液体培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温80lml，蒸馏水1.0l组成，ph6.5±0.2)中，在37℃培养24h，连续转接活化两代，以1％(/v/v)接种量接入200mlmrs液体培养基中，37℃培养48h；4℃，8000r/min离心10min，收集上清夜，采用下述方法检测上清液中蛋白酶酶活。结果显示，本发明筛选到的植物乳杆菌llh-2发酵上清液中蛋白酶酶活高达97u/ml，取得了意料不到的技术效果。(1)酶活力定义：37℃，每分钟分解牛血清蛋白产生1μmol的色氨酸所需酶量即为一个酶活单位。(2)酶活测定方法：取50μl浓度为1％(w/v)牛血清蛋白(bsa)，酶液450μl，与浓度为0.1mol/l，ph7.0的1.5ml乙酸钠缓冲液混合，在37℃下保温5min。以0.5ml浓度为10％的三氯乙酸终止反应，在280nm处测定吸光值。空白对照管：以蒸馏水代替酶液如上同样条件操作。酶活公式：酶活(u/ml)＝(k×w)(/v×t)，其中k为酶液稀释倍数；w为生成的色氨酸量(μmol)；v为反应酶液体积(ml)；t为反应时间(min)。实施例3植物乳杆菌llh-2作为腐熟剂在鸡粪堆肥中的应用1、堆肥物料为鸡粪和锯末，分别取自青岛市平度的养鸡场和木材加工厂。2、实验组设置：(1)空白对照组：接种无菌水；(2)cgmcc1.572处理组：接种植物乳杆菌cgmcc1.572；(3)llh-2处理组：接种植物乳杆菌llh-2。根据鸡粪与锯末的性质，将水分调节至60％左右，c/n比调节至25～30之间，充分混合均匀后，装入容积为4l的泡沫盒中。堆肥接种前，先将植物乳杆菌发酵液((108-109cfu/ml))以物料湿重的5‰与玉米面按体积质量为1∶1的比例充分混匀，待堆体温度上升至40℃以上时接种至堆肥物料中。空白对照组以等量无菌水代替发酵液与玉米面混合加入。将装有堆肥物料的泡沫盒置于室温18℃左右的实验室内进行腐熟。分别在每天上午10：30和下16：30对堆体内部进行温度测定，每个实验组各取3个点测定，并记录当时的环境温度，取1d中测定值的平均值作为当天温度值。结果见图1。从图1可以看出，堆体温度经历了快速上升、维持，然后下降的过程。堆体温度在堆肥开始后第2天上升至40℃左右。接种植物乳杆菌后，llh-2处理组在第3天进入高温期，温度高达68℃；cgmcc1.572处理组也在第3天进入高温期，但温度只有60℃；而空白对照组第3天时，堆体温度仅为54℃，第4天才进入高温期，堆体温度为57℃，显著低于植物乳杆菌处理组。堆肥第7天，llh-2处理组堆体温度维持在53℃，cgmcc1.572处理组堆体温度下降至47℃，而空白对照组堆体温度下降至44℃，均显著低于llh-2处理组。llh-2处理组堆体最高温度达到68℃，比cgmcc1.572处理组最高温度(60℃)高8℃，比空白对照组最高温度(57℃)高11℃；而且llh-2处理组高温期持续时间比cgmcc1.572处理组多1天，比空白对照组多2天。上述结果说明，堆肥中接种本发明提供的耐高温菌株植物乳杆菌llh-2可以显著提高微生物的活性，迅速升高堆肥温度，且高温期持续时间更长，有利于杀灭堆肥中病原微生物，缩短堆肥时间，提高堆肥品质。因此，本发明提供的植物乳杆菌llh-2可作为生物腐熟剂广泛应用于玉米皮、花生壳、蘑菇菌渣、畜禽粪便、作物秸秆、城市污泥、餐厨垃圾、食品加工和制药废渣等有机物料堆肥，效果显著。实施例4植物乳杆菌llh-2抑菌能力测定1、对细菌的抑制能力测定1)乳酸菌液制备：将植物乳杆菌llh-2接种于100mlmrs液体培养基中，37℃静置培养48h；2)致病菌菌液制备：分别将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌菌种接种于营养肉汤培养基，37℃摇床培养过夜；3)抑菌实验—双层平板，牛津杯法：每5ml灭菌营养琼脂培养基(50℃左右)加100μl致病菌菌液(菌量106数量级)，混匀后倾倒至营养琼脂平板做成双层平板，凝固后在培养基上放置牛津杯，向牛津杯中添加200μl培养好的植物乳杆菌llh-2菌液，待菌液扩散后放入37℃培养箱中培养20h，观察抑菌圈直径。结果见表2。表2植物乳杆菌llh-2对致病菌的抑制作用致病菌大肠杆菌沙门氏菌金黄色葡萄球菌李斯特菌抑菌圈直径28mm25mm27mm28mm由上表可以看出，本发明筛选出的植物乳杆菌llh-2对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌均有很强的抑制作用，尤其对大肠杆菌和李斯特菌的抑制作用最强，抑菌圈直径达到28mm。2、对致病真菌的抑制能力测定(1)培养致病真菌：在无菌操作台中，分别接种花生根腐病菌、白绢病菌、疮痂病菌和褐斑病菌至pda培养基中，28℃倒置培养3天。(2)接种对峙菌：待致病真菌长至约占培养皿1/3时，在距离真菌2cm处分别接种植物乳杆菌llh-2，以未接种植物乳杆菌llh-2的真菌作为对照，继续在37℃条件下培养3天后，分别测定各致病真菌的菌落半径，计算抑菌率。抑菌率＝[(对照真菌生长半径-处理真菌生长半径)/对照真菌生长半径]×100％。结果显示，植物乳杆菌llh-2对上述四种花生致病真菌均有明显的拮抗作用。其中，llh-2对花生根腐病菌和褐斑病的抑制作用最强，抑制率分别高达84.5％和80.7％；对花生白绢病菌和疮痂病的抑制作用相对较弱，抑制率分别为58.7％和60.8％。实施例5植物乳杆菌llh-2在花生病害防治中的应用1、实验地点：青岛平度后沙岭村的花生连作田，花生根腐病、白绢病、疮痂病和褐斑病发生严重。2、实验设计：随机设置实验区，每个实验区为6m×10m的长方形区域，且每个实验区之间保持3米以上的间隔。花生的行距为40cm，株距20cm。每个实验组设置三个平行实验区。(1)空白对照组：清水；(2)杀菌剂处理组：50％多菌灵800倍液；(3)植物乳杆菌cgmcc1.572处理组：分别在播种期、播种后15d、30d、45d利用植物乳杆菌cgmcc1.572发酵液(108-109cfu/ml)灌根，每株每次浇稀释100倍发酵液约50ml；(4)植物乳杆菌llh-2处理组：分别在播种期、播种后15d、30d、45d利用植物乳杆菌llh-2发酵液(108-109cfu/ml)灌根，每株每次浇稀释100倍发酵液约50ml。其他田间管理同正常生产，75天后调查发病情况，结果如表3-6所示。根腐病分级标准：0级:茎基和主须根上均无病斑；1级:茎基和主根上有少量病斑；3级:茎基和主根上病斑较多,病斑面积占茎基和根总面积的1/4～1/2；5级:茎基和主根上病斑多且大,病斑面积占茎基和根总面积的1/2～3/4；7级:茎基和主根上病斑连片,形成绕茎现象,但根系并未死亡；9级:根系坏死,植株地上部萎蔫或死亡。白绢病分级标准：0级：植株无症状；1级：仅在茎基部产生病斑；2级：茎基部产生缢缩症状,整株的三分之一以下表现系统症状(枯萎、死亡、萎蔫等)；3级：整株的三分之二以下表现系统症状；4级：整株的三分之二以上表现系统症状。疮痂病分级标准：0级：健康植株1级：在顶部嫩叶和果柄上出现小病斑2级：在嫩叶、果柄、茎上出现小病斑3级：嫩叶边缘向上卷曲，在花生茎和果柄上出现疮痂状4级：果柄、茎严重弯曲，植株现灼烧状褐斑病分级标准：0级：无病害症状；1级：受害叶片面积占调查叶片面积的1/10以下；2级：受害叶片面积占调查叶片面积的1/4以下；3级：受害叶片面积占调查叶片面积的1/2以下；4级：受害叶片面积占调查叶片面积的1/2以上，落叶。病株率＝发病株数/总株数×100％病情指数＝∑(发病级代表值×各级病株数)×100/(调查总株数×最高级发病代表值)防治效率＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％表3花生根腐病防治效果比较表4花生白绢病防治效果比较表5花生疮痂病防治效果比较表6花生褐斑病防治效果比较从表3-6的大田实验数据可以看出，本发明提供的植物乳杆菌llh-2对花生根腐病、白绢病、疮痂病和褐斑病均有明显的防治效果，其中对根腐病和褐斑病的防治效率高达和83.0％和80.0％，对白绢病和疮痂病的防治效率超过55％，显著高于药剂处理组多菌灵的防治效果。而市售的植物乳杆菌cgmcc1.572对花生根腐病、白绢病、疮痂病和褐斑病虽然也具有一定的防治效果，但防治效率仅均低于10％，远低于本发明所述植物乳杆菌llh-2。上述结果表明，本发明提供的植物乳杆菌llh-2对花生常见病害的防治效果要显著优于传统的化学杀菌剂，且对环境友好，有利于提升农作物的品质，可广泛应用于绿色农业生产中。实施例6一种生物腐熟剂，其各组分及其重量分别为：植物乳杆菌llh-2120份、枯草芽孢杆菌130份、白浅灰链霉菌80份、克鲁斯假丝酵母140份和绿色木霉80份。上述生物腐熟剂的制备方法，包括如下步骤：1)将植物乳杆菌llh-2、枯草芽孢杆菌、白浅灰链霉菌、克鲁斯假丝酵母和绿色木霉分别活化后，扩大培养至对数生长期，将发酵液冷冻干燥，制成活菌量高达1010-1011cfu/g的超浓缩菌粉；2)将步骤(1)制得的超浓缩菌粉按照如下重量比：植物乳杆菌llh-2120份、枯草芽孢杆菌130份、白浅灰链霉菌80份、克鲁斯假丝酵母140份和绿色木霉80份配制成生物腐熟剂。实施例7一种生物腐熟剂，其各组分及其重量比分别为：植物乳杆菌llh-2150份、枯草芽孢杆菌120份、白浅灰链霉菌120份、克鲁斯假丝酵母95份和绿色木霉110份。制备方法参照实施例9。实施例8一种生物腐熟剂，其各组分及其重量比分别为：植物乳杆菌llh-2135份、枯草芽孢杆菌90份、白浅灰链霉菌100份、克鲁斯假丝酵母90份和绿色木霉130份。制备方法参照实施例9。实施例9生物腐熟剂在蘑菇菌渣堆肥中的应用1、堆肥原料蘑菇菌渣：取自青岛市莱西平菇栽培基地，由棉籽壳、木屑、米糠等组成，ph8.1、有机碳、氮、磷、钾质量分数分别是45.88％、1.52％、0.48％、1.75％。2、堆肥方法取蘑菇菌渣1吨，堆体的长、宽、高各1米。将堆体物料的含水量调节至60％左右。按0.5kg/吨的用量分别将实施例6-8所述生物腐熟剂加入堆体，为撒施均匀，提前用15倍麸皮或秸秆粉等对腐熟剂进行稀释。同时设置空白对照组，不添加任何腐熟剂。按常规方法堆置发酵，发酵过程中每3天翻堆一次，翻堆时及时补充水分，以保证堆肥含水率达到60％。发酵天数为15天，从堆肥开始，分别在每天上午9点和下午4点各测定一次堆体的温度，然后求平均值，其中堆体的深度选择30-40cm。结果见图2。在堆肥结束时采用四分法取样，每个堆体取样1kg。分别测定堆肥的c/n值和种子发芽率(gi)，用来评价堆肥的质量，具体结果见表7。(1)c/n值：采用凯氏定氮法和重铬酸钾氧化法对堆肥进行全n及toc含量的测定，两者含量之比即为堆肥c/n值。c/n是衡量堆料腐熟程度的重要指标。一般来说，堆料的c/n值降至20，即可认定堆肥腐熟。(2)玉米种子发芽指数(gi)：称取通过1mm筛孔烘干土重的风干堆肥25g，放入500ml三角瓶中，加去离子水250ml。在振荡机上振荡2h，离心后进行过滤，将滤液收集备用。取上述滤液10ml于垫有滤纸的培养皿中，同时设有空白对照(蒸馏水)，每个培养皿内放20粒饱满的玉米种子，然后将其置于25℃培养箱中培养，在48h测定发芽率和根长，计算发芽指数(gi)。其计算方法为：gi(％)＝(堆肥浸提液的种子发芽率×种子根长)/(蒸馏水的种子发芽率×种子根长)×100％。发芽指数是衡量堆肥植物毒性和腐熟度的重要参数，被认为是最敏感、最可靠的堆肥腐熟度评价指标。若发芽指数＞80％则可认定堆肥物料对植物无毒性。3、结果分析如图2所示，与空白对照组相比，接种本发明所述生物腐熟剂的处理组堆体升温较快，在堆肥第2天温度即超过55℃。整个堆肥过程中，腐熟剂处理组堆体的最高温度均达到75℃以上，尤其是实施例7腐熟剂处理组的堆体温度最高达到78℃，显著高于对照组(61℃)。堆肥第12天，腐熟剂处理组堆体的温度普遍高于55℃，而对照组温度已降至43℃。腐熟剂处理组的高温期持续时间比空白对照组多了3天。表7蘑菇菌渣堆肥质量评价分组c/n值gi值空白对照组25.82±0.5271.8％实施例6腐熟剂处理组15.71±0.31119.5％实施例7腐熟剂处理组15.65±0.27121.2％实施例8腐熟剂处理组15.86±0.24116.0％从表7的数据可以看出，未接种腐熟剂的空白对照组堆肥的c/n值高达25.82，发芽指数低于80％，说明对照组堆肥的腐熟度不够，对植物具有毒性。而接种生物腐熟剂的处理组堆肥的c/n值均低于16，发芽指数高达116.0％-121.2％。上述结果表明，本发明所述生物腐熟剂通过耐热植物乳杆菌llh-2与多种微生物的协同作用，可以迅速升高堆肥温度，而且高温期持续时间更长，能快速杀灭堆肥中病原微生物，加快腐熟进程，大大提高了堆肥的腐熟度和肥效，效果显著。本发明提供的生物腐熟剂还可以用于玉米皮、花生壳、秸秆、畜禽粪便、餐厨垃圾等有机废弃物料的腐熟，发酵结束后堆肥的c/n值为14.3-16.1，发芽指数为96.0％-126.4％，效果显著。此外，申请人将上述处理组的堆肥分别施用于花生和白菜种植区，同时以施用等同肥效的无机肥作为对照。结果发现，与无机肥对照组相比，堆肥处理组的花生和白菜的产量普遍提高了38％-62％，而且，花生根腐病、白绢病、疮痂病和褐斑病的发病率比对照组降低了51.2％-63.4％，白菜黑腐病和黑斑病的的发病率也比对照组分别降低了47.2％和55.8％，效果显著。从而说明，通过接种本发明所述生物腐熟剂制备得到的堆肥，除了能大幅提高土壤肥力，促进作物生长之外，还能有效防治作物的常见病害，降低发病率，取得了意料不到的技术效果。序列表<110>青岛力力惠生物科技股份有限公司<120>一种生物腐熟剂及其在堆肥中的应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1253<212>dna<213>植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)<400>1aaagatggcttcggctatcacttctggatggtcccgcggcgtattaggtagatggtgggg60taacggctcaccatggcaaagatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattggg120actgagacacggcccaaactcctacggggggcagcagtagggaattttccaaaatggacg180aaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaaactctttt240gttaaagaagaacatatctgagagtaaattttcaggtattgacggtatttaaccagaaag300ccacggctaactacctgccagcaggcggggtaattcgtaggtggcaagggttgtcaggat360ttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagcctttggctc420aaccgaagaagtgcatcggaaactgggaaaattgaatgcagaagaggacagtggaactct480atgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtct540ggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagtatgggtagcaaacaggattagataccctgg600tagtccataccgtaaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgc660agctaacgcattaagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaa720ttgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaac780cttaccaggtcttgacatactatgcaaatctaagagattagacgttcccttcggggacat840ggatacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccg900caacgagcgcaacccttattatcagttgccagcattaagttgggcactctggtgagactg960ccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctg1020ggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgaactcgcgagagtaagctaa1080tctcttaaagccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaa1140tcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacacc1200gcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagtcggtggggtaaccttta1253当前第1页12