一株增强作物耐盐能力的根际促生菌及其微生物肥料和应用的制作方法

本发明涉及农用生物制品生产技术领域，具体涉及一株增强作物耐盐能力的根际促生菌及其微生物肥料和应用。

背景技术：

目前世界上大量的耕地受到盐害的影响，土壤中过量的盐分会抑制农作物的生长，降低农作物产量，土壤盐碱化是全球农业发展面临的重要问题，含微量氯化钠的灌溉水和海水是增加农田土中含盐量最主要的原因。土壤中nacl含量的增加会降低植物吸收水分能力，盐胁迫会通过渗透胁迫、离子毒害、氧化伤害、抑制酶活等途径影响种子的萌发。已知增强植物耐盐胁迫的方法有多种，可以通过培育耐盐胁迫植物的品种或构建转基因植物，也可以通过改善环境，如改造环境结构引水对盐害地进行冲洗来减少环境中的盐分，但是转基因作物目前被公众的接受度较低，改造环境结构工程较大，而植物根际促生菌将会是另一条有效增强植物耐盐胁迫的方式，且没有上述两个方法的缺点。在盐胁迫下，根际促生菌会通过诱导诱导系统耐受来减少植物受到的胁迫伤害。常见的增强植物耐盐胁迫能力的根际促生菌有金黄杆菌、门多萨假单胞菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等。在盐害胁迫下，根际促生菌可通过增加养分吸收率，降低活性氧伤害，产生植物激素，产生vocs，增加渗透保护剂，调节植物乙烯等方法来增强植物耐非生物胁迫能力。

微生物肥料是指一类含有活体微生物的特定制品，通过微生物的生命活动及其代谢产物带来肥效。随着我国化肥和农药使用量的增加，带来了一系列的生态和经济问题，如土壤板结、酸化、土传病害加重，水体富营养化，同时化肥使用量虽在增加，但利用效率却越来越低，作物增产甚微，生产成本提高，农民的经济收入降低，严重打击了生产积极性，从而限制了农业的发展。微生物肥料可以增加化肥的利用率，提高作物的品质，改善土壤结构，增加作物的抗逆和抗病性，提高作物产量，是一类绿色、环保、无毒的新型肥料。研发功能性微生物有机肥料(增强作物耐盐胁迫，提高盐碱地作物产量)是一条可行的出路。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对农业生产中盐碱地作物产量低下土地难以利用的实际问题，开发研制出能够提高盐碱地作物耐盐胁迫能力微生物有机肥，提高盐碱地上作物的产量并在一定程度上改善盐碱地的土壤理化性质。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了副地衣芽孢杆菌(bacillusparalicheniformis)t1-8。

本发明提供的副地衣芽孢杆菌(bacillusparalicheniformis)t1-8，已于2019年03月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为cgmccno.17335。

副地衣芽孢杆菌(bacillusparalicheniformis)t1-8简称为芽孢杆菌t1-8。

所述芽孢杆菌t1-8的发酵产物也属于本发明的保护范围。

所述芽孢杆菌t1-8的发酵产物是将所述芽孢杆菌t1-8接种于液体发酵培养基中进行发酵培养得到的；

所述液体发酵培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在液体发酵培养基中的浓度为：糖蜜4-6g/100ml，豆粕粉0.7-0.8g/100ml，氯化钠0.4-0.6g/100ml，磷酸二氢钾0.05-0.15g/100ml，氯化钙0.05-0.15g/100ml，硫酸镁0.05-0.15g/100ml，硫酸亚铁0.04-0.06g/100ml，硫酸锌0.04-0.06g/100ml，硫酸锰0.04-0.06g/100ml；所述溶剂为水。

在本发明实施例记载的最优液体发酵培养基中，溶质及其在液体发酵培养基中的浓度为：糖蜜5g/100ml，豆粕粉0.72g/100ml，氯化钠0.5g/100ml，磷酸二氢钾0.1g/100ml，氯化钙0.1g/100ml，硫酸镁0.1g/100ml，硫酸亚铁0.05g/100ml，硫酸锌0.05g/100ml，硫酸锰0.05g/100ml。

所述液体发酵培养基的ph为7.5。

在进行所述发酵培养时，将芽孢杆菌t1-8接种于上述液体发酵培养基中，发酵体系中含有的初始菌含量具体可为5×10⁷个/ml。

实现上述初始菌含量的方法具体可为：将芽孢杆菌t1-8接种于lb液体培养基中培养获得菌悬液(菌悬液中的菌浓度为10⁹个/ml)；将所述菌悬液转接至所述液体发酵培养基中，接种量为5％(体积百分含量)。

在进行所述发酵培养时，发酵温度具体可为35℃，转速具体可为180rpm，发酵时间具体可为48h。

所述发酵产物具体可为经过上述发酵得到的发酵体系。

在所述发酵产物中，所述芽孢杆菌t1-8的菌数量或芽孢数量为10¹⁰个/ml以上。

本发明还保护所述芽孢杆菌t1-8或所述发酵产物的应用，为如下(a1)或(a2)：

(a1)缓解盐胁迫对植物的伤害；

(a2)提高植物耐盐胁迫的能力。

所述应用中，(a1)或(a2)具体可体现为受到盐胁迫的植物在接种芽孢杆菌t1-8后与同样受到盐胁迫但未接种芽孢杆菌t1-8的植物相比生长指标(株高、地上部鲜重和根长)提高。

所述应用中，(a1)或(a2)具体可体现为受到盐胁迫的植物在接种芽孢杆菌t1-8后与同样受到盐胁迫但未接种芽孢杆菌t1-8的植物相比可溶性糖总量(tss)提高和/或过氧化物酶(pod)活性提高和/或丙二醛(mda)含量降低和/或过氧化氢(h2o2)含量降低和/或过氧化物歧化酶(sod)活性降低和/或过氧化氢酶(cat)活性降低。

本发明还保护所述芽孢杆菌t1-8或所述发酵产物在制备微生物肥料中的应用。

本发明还保护一种微生物肥料，每克所述微生物肥料中含有5×10⁸-2×10⁹个所述芽孢杆菌t1-8。

本发明实施例制备的微生物肥料还满足如下条件：(1)有机质的质量百分含量为45％以上；(2)氮磷钾的质量百分含量总和为5％以上；(3)含水量为50～60％；(4)ph为6.5～7.5。所述(2)具体体现为氮的质量百分含量为1.5％以上，磷的质量百分含量为2.5％以上，钾的质量百分含量为1％以上。

本发明还保护一种微生物肥料，其制备方法包括如下步骤：将所述芽孢杆菌t1-8的发酵产物与有机物料混合进行二次固体发酵，得到所述微生物肥料。

所述有机料可以为任意商购的普通有机肥料，也可以为任意腐熟后的畜禽粪便、秸秆等有机物料。

所述有机物料可以为满足如下条件的有机物料：(1)有机质的质量百分含量为45％以上；(2)氮磷钾的质量百分含量总和为5％以上；(3)ph为6.5～7.5。所述(2)具体体现为氮的质量百分含量为1.5％以上，磷的质量百分含量为2.5％以上，钾的质量百分含量为1％以上。

在进行所述二次发酵前，需将有机物料补水至含水量达到50～65％。

所述二次固体发酵满足如下条件：(a)发酵温度为30℃-50℃；(b)发酵过程保持含水量为50％-65％；(c)发酵中途进行翻堆。

所述二次固体发酵的天数具体可为7天。当所述发酵天数为7天时，可在第四天进行一次翻堆。

所述二次固体发酵中，每吨有机物料中可加入30l所述发酵产物。所述30l发酵产物中具体可含有3×10¹⁴-5×10¹⁴个所述芽孢杆菌t1-8。

本发明的实施例中采用的有机物料为腐熟后的牛粪猪粪秸秆混合堆肥，其中全氮含量为1.56％，全磷含量为2.52％，全钾含量为1.32％，有机质含量为48.51％，含水量为28.26，ph为6.8。

本发明的实施例中，二次固体发酵具体操作方法为：取有机物料和芽孢杆菌t1-8的发酵产物混合(每吨有机物料中可加入30l所述发酵产物)，于通风阴凉处进行二次固体发酵，第四天进行翻堆，发酵温度保持在30℃-50℃，将发酵体系的含水量控制在50～60％，发酵7天后结束，得到微生物有机肥。

参照上述方法制备得到每克所述微生物肥料中含有5×10⁸-2×10⁹个所述芽孢杆菌t1-8。

本发明还保护上述任一所述微生物肥料的应用，为如下(b1)-(b5)的至少一种：

(b1)缓解盐胁迫对植物的伤害；

(b2)提高植物耐盐胁迫的能力；

(b3)作为盐碱地植物的肥料；

(b4)提高盐碱地植物产量；

(b5)改良盐碱地土壤理化性质。

所述(b5)中，所述改良盐碱地土壤理化性质具体可体现为与使用普通肥料相比，使用上述微生物肥料后，土壤有机质含量增加和/或ph下降和/或含盐量下降。

以上任一所述的植物可为双子叶植物或单子叶植物。

所述植物可为禾本科植物。

所述植物具体可为小麦或玉米。

本发明提供了一株能提高玉米耐盐胁迫能力的菌株，将该菌株接种于盆栽玉米和小麦根际，在盐分胁迫下能提高玉米，小麦的生长指标(株高、地上部鲜重)，提高玉米叶片中可溶性糖总量(tss)、过氧化物酶(pod)活性，同时能降低玉米叶片中丙二醛(mda)、过氧化氢(h2o2)含量，过氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)的活性。此外，菌株t1-8还具有产氨、解无机磷、产嗜铁素、产iaa等促生能力，为根际促生芽孢杆菌。将该菌发酵后的菌液与普通牛粪猪粪秸秆混合堆肥均匀混合后二次发酵制成微生物有机肥料，该微生物有机肥料具有以下优点：

1、本发明提供的微生物有机肥专用于提高盐碱地玉米产量且在一定程度上改良土壤理化性质，不仅起到增产的作用还可以改良土壤；

2、本发明提供的微生物有机肥中的有效菌株来源自盐碱地，对盐碱环境有适应性，兼具产氨、解无机磷、产嗜铁素等能力，且溶血反应阴性，对人类不具有危害；

3、本发明提供的微生物有机肥前期液体发酵所需的培养液主要原料为糖蜜、豆粕粉，原料成本低廉，且提高了这些物料的利用效率。且在最佳发酵条件下，较短的发酵周期就可使菌液中有效菌数量或芽孢含量达到所需量；

4、本发明提供的微生物有机肥所用的载体有机物料为普通的牛粪猪粪秸秆混合堆肥，不需要特定的有机肥料承载，二次发酵之后即可正常使用，做载体的原料常见易得成本低。

附图说明

图1为实施例1中菌株初筛时部分菌株根长测定结果。

图2为实施例1中菌株复筛(水培)时玉米、小麦的表型观察结果。

图3为实施例1中菌株复筛(土培)时玉米、小麦的表型观察结果。

图4为实施例2中相关指标检测结果。

图5为实施例5中单因素实验不同实验条件的发酵效果检测结果。

图6为实施例5中正交实验不同实验条件的发酵效果检测结果。

图7为实施例7中不同施肥条件下玉米表型观察结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

玉米品种京甜紫花糯：可从江苏省农业科学院购得，记载于文献“王建煌,陈伟平,李侠涛.优质紫黑色糯玉米新品种及高产栽培要点[j].中国种业,2008(7):79-80.”；公众也可以从中国农业科学院农业资源与农业区划研究所获得。

小麦品种百农矮抗58：可从河南省农业科学院购得，记载于文献“李淦,李笑慧,齐尚红.小麦新品种百农矮抗58特征特性及高产栽培要点[j].农业科技通讯,2006(9):24-25.”公众也可以从中国农业科学院农业资源与农业区划研究所获得。

玉米品种恒源一号：可从无棣县种子公司购得。

实施例1、样本采集及菌种筛选

一、样本采集和菌株分离

采集全国各地盐碱土，并进行盆栽实验，在这些土壤上分别种植玉米品种京甜紫花糯，正常浇水，一个月后收获玉米植株。分别浸提根际土的土壤悬液，将土壤悬液85℃水浴15min后在lb固体培养基上稀释涂布，37℃培养过夜，分别对平板上的菌株分离纯化，共筛选得到芽孢杆菌124株。

二、菌株的初筛

待测菌株：步骤一筛选的124株芽孢杆菌。

1、将玉米品种京甜紫花糯的种子表面消毒后置于灭菌的培养皿中(培养皿底部放置无菌水润湿的灭菌滤纸)，在4℃避光春化3天。

2、完成步骤1后，将发芽的种子置于圆形塑料筐中，每个小筐上放置种子30粒，塑料筐至于1.6l小桶上，加水约1.4l至与种子接触，用黑色避光膜遮光，置于25℃培养4天，每日换水一次。

3、完成步骤2后，撤去黑色避光膜，置于25℃继续培养一周，每日早晚换水一次。

4、完成步骤3后，将小桶中的水更换为含140mmnacl的1/4ms营养液，同时，在玉米的根部接种10ml含有待测菌株的1/4ms营养液(1/4ms营养液中的待测菌浓度为10⁷个/ml)，置于25℃培养7天。

每个待测菌株设置3个重复。

设置使用1/4ms营养液替代含140mmnacl的1/4ms营养液，且不接种菌株的对照(mockcontrol)。

设置不接种菌株的对照(saltcontrol)。

5、完成步骤4后，测定玉米的株高、地上部鲜重和根长。

根据株高、地上部鲜重和根长的统计结果，初步筛选出2株效果较好的菌株，其中，菌株t1-8的效果最佳。

部分根长测定结果如图1所示。图1中，ck100为不接种菌株的对照(saltcontrol)的根长统计结果，其余为接种不同菌株的玉米根长统计结果。

三、菌株的复筛(水培)

待测菌株：步骤三初筛的2株菌株。

1、将玉米品种京甜紫花糯的种子和小麦品种百农矮抗58的种子表面消毒后置于灭菌的培养皿中(培养皿底部放置无菌水润湿的灭菌滤纸)，在4℃避光春化3天。

2、完成步骤1后，将发芽的种子置于圆形塑料筐中，每个小筐上放置种子30粒，塑料筐至于1.6l小桶上，加水约1.4l至与种子接触，用黑色避光膜遮光，置于25℃培养4天，每日换水一次。

3、完成步骤2后，撤去黑色避光膜，置于25℃继续培养一周，每日早晚换水一次。

4、完成步骤3后，将小桶中的水更换为含nacl的1/4ms营养液，同时，在玉米或小麦的根部接种10ml含有待测菌株的1/4ms营养液(1/4ms营养液中的待测菌浓度为10⁷个/ml)，置于25℃培养7天。

步骤4中，玉米组将水更换为含140mmnacl的1/4ms营养液；小麦组将水更换为含180mmnacl的1/4ms营养液。

每个待测菌株设置3个重复。

设置使用1/4ms营养液替代含nacl的1/4ms营养液，且不接种菌株的对照(mockcontrol)。

设置不接种菌株的对照(saltcontrol)。

根据统计结果，接种了菌株t1-8的玉米和小麦生长情况最好，接种菌株t1-8的玉米和小麦株高、地上部鲜重均显著高于不接种菌株t1-8的对照。

接种菌株t1-8的玉米和小麦表型观察结果见图2。图2中，a为玉米，b为小麦。

三、菌株的复筛(土培)

待测菌株：步骤三初筛的2株菌株。

1、分别将玉米品种京甜紫花糯的种子和小麦品种百农矮抗58的种子表面消毒后置于灭菌的培养皿中(培养皿底部放置无菌水润湿的灭菌滤纸)，在4℃避光春化。

2、完成步骤1后，将发芽的种子置于底部扎孔的700ml塑料杯中(每个塑料杯装土1kg)，每个塑料杯中分别移栽玉米种子3粒和小麦种子10粒，25℃培养10天，每隔一天浇去离子水50ml。

3、完成步骤2后，每个塑料杯加入10ml含有待测菌的1/4ms营养液(使土壤中菌浓度为10⁸个/g土壤)，保持培养条件不变继续培养10天，每隔一天浇含有200mmnacl的去离子水50ml；第5天时每个塑料杯加入3ml含有待测菌的1/4ms营养液(使土壤菌浓度保持在10⁸个/g土壤)。

4、完成步骤3后，测定玉米和小麦的株高和干鲜重。

每个待测菌株设置3个重复。

设置不接种菌株的对照(saltcontrol)。

设置使用去离子水替代含有200mmnacl的去离子水，且不接种菌株的对照(mockcontrol)。

根据统计结果，接种了菌株t1-8的玉米和小麦生长情况最好，接种菌株t1-8的玉米和小麦株高、地上部鲜重均显著高于不接种菌株t1-8的对照。

接种菌株t1-8的玉米和小麦表型观察结果见图3。图3中，a为玉米，b为小麦。

四、菌株t1-8的形态鉴定及分子鉴定

1、菌株t1-8在lb固体培养基上菌落为扁平，边缘不整齐，白色黏稠，表面有褶皱。

2、将菌株t1-8的16srdna序列进行扩增并测序，测序结果如序列表的序列1所示。

经过鉴定，可以确定菌株t1-8属于副地衣芽孢杆菌，因此重新将其命名为副地衣芽孢杆菌t1-8。

五、芽孢杆菌t1-8的保藏

本发明提供的副地衣芽孢杆菌(bacillusparalicheniformis)t1-8，已于2019年03月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为cgmccno.17335。副地衣芽孢杆菌(bacillusparalicheniformis)t1-8简称为芽孢杆菌t1-8。

实施例2、接种芽孢杆菌t1-8的玉米植株中与逆境胁迫相关物质含量的测定

1、将玉米品种京甜紫花糯的种子表面消毒后置于灭菌的培养皿中(培养皿底部放置无菌水润湿的灭菌滤纸)，在4℃避光春化3天。

2、完成步骤1后，将发芽的种子置于圆形塑料筐中，每个小筐上放置种子30粒，塑料筐至于1.6l小桶上，加水约1.4l至与种子接触，用黑色避光膜遮光，置于25℃培养4天，每日换水一次。

3、完成步骤2后，撤去黑色避光膜，置于25℃继续培养一周，每日早晚换水一次。

4、完成步骤3后，将小桶中的水更换为含140mmnacl的1/4ms营养液，同时，在玉米的根部接种10ml含有芽孢杆菌t1-8的1/4ms营养液(1/4ms营养液中的菌浓度为10⁷个/ml)，置于25℃培养3天。

每个待测菌株设置3个重复。

设置使用1/4ms营养液替代含140mmnacl的1/4ms营养液，且不接种菌株的对照(mockcontrol)。

设置不接种菌株的对照(saltcontrol)。

5、完成步骤4后，测定玉米叶片中各项与盐胁迫相关物质(可溶性总糖、过氧化氢、mda、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化氢)的含量。

可溶性总糖含量用蒽酮比色法测定；

过氧化氢含量用二甲酚橙法测定；

mda、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化氢使用商购试剂盒(均购买于索莱宝生物科技有限公司)检测。

蒽酮比色法测定可溶性总糖含量的方法如下：

①标准曲线的制作

取20ml刻度试管6支，从1～6分别编号，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的100μg/ml蔗糖溶液，并用水补至2ml，各管中糖含量分别为0、20、40、60、80、100μg，然后按顺序向试管中加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作对照，在630nm波长下测其吸光度，以吸光度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。

②可溶性糖的提取

称取已粉碎样品0.10～0.30g放入20ml刻度试管中，加入5～10ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min(提取2次)，提取液过滤入25ml容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。

③显色测定

吸取0.5ml样品液于20ml刻度试管中(3次重复)，加蒸馏水1.5ml，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入蒽酮乙酸乙酯试剂、浓硫酸溶液，显色并测定吸光度。由标准线性方程求出糖的量(μg)，计算测试样品中的糖含量。

二甲酚橙法测定过氧化氢含量的方法如下：

①标准曲线的制作

取10ml离心管六支，分别加入0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml10μmol/l过氧化氢，加水至2ml，显色时，向各管加4ml工作试剂，30℃水浴显色30min，于560nm出测定吸光度值，绘制标准曲线。

②样品的提取

取植物组织样品0.5g，加2ml预冷丙酮研磨匀浆，10000r/min离心10min，上清液定容至3ml，即为过氧化氢提取液，取1ml加3ml萃取剂，混匀，再加5ml蒸馏水，混匀，5000r/min离心1min，上层水相即为样品提取液。

③显色测定

取2ml样品提取液，加入4ml工作试剂，按标准曲线方法同样处理后，于560nm处测定吸光度值，从标准曲线查得过氧化氢浓度。

结果如图4所示。结果表明，与对照组相比，接种芽孢杆菌t1-8能提高玉米叶片中可溶性糖总量(tss)、过氧化物酶(pod)活性，同时能降低玉米叶片中丙二醛(mda)、过氧化氢(h2o2)含量，过氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)的活性。

实施例3、芽孢杆菌t1-8其他促生能力测定

一、nh3产生能力测定

将芽孢杆菌t1-8接入盛有蛋白胨水培养液的试管中，28℃，170rmin^-1振荡培养72h，向培养体系中加入1mlnessler’s试剂(0.09mol/l碘化汞钾与2.5moll^-1氢氧化钾的混合液)，出现黄褐色沉淀的菌株为产氨阳性反应。

蛋白胨水培养液：蛋白胨粉10g，nacl5g，蒸馏水定容至1000ml，ph7.8。

二、嗜铁素产生能力的测定

将芽孢杆菌t1-8点接到lb固体培养基平板上，28℃培养24h，然后将cas固体培养基倾倒平铺于lb平板上，15-30min后观察菌体周围是否出现淡黄或淡红色的晕圈，初步判定其产嗜铁素能力。

将芽孢杆菌t1-8接种于lb液体培养基，28℃、170rpm培养12h，然后取培养液上清过膜除菌后，与cas蓝色检测液等体积混合，充分反应30min，测od630，得吸光值as，以双蒸水作为对照调零；以未接种的培养液与cas蓝色检测液等体积混合，测od630，得吸光值ar。as/ar值代表样品中嗜铁素的相对含量，嗜铁素含量测定重复3次，as/ar值越低，产嗜铁素能力越强。一般产铁载体能力较高的菌株，其as/ar低于0.5。

三、iaa产生能力测定

将芽孢杆菌t1-8接种于含有2.5mmoll^-1l-色氨酸的landy培养基中，25℃、140rmin^-1条件下振荡培养72h，取培养液1ml，12000×g离心5min取上清，取500μl上清液，加入等体积的salkowski试剂，室温暗处显色30min后，于530nm处测光密度值，以空白培养基作对照，并以纯iaa对应的光密度作标准曲线，计算iaa的产出量(mgl^-1)。

四、解磷能力测定

将芽孢杆菌t1-8在lb培养基中活化，取1ml培养液，6000rmin^-1离心5min，弃上清，菌体用无菌水洗涤三次后重悬，将芽孢杆菌t1-8接入磷酸盐液体养基(nbrip)，不接菌为空白对照，28℃、170rmin^-1条件下振荡培养7天，钼锑抗比色法定量测定溶磷含量及对应ph值。

上述结果如表1所示。

表1

结果表明，芽孢杆菌t1-8具有产氨、解无机磷、产嗜铁素等能力，为根际促生芽孢杆菌。

实施例4、芽孢杆菌t1-8的溶血反应

将芽孢杆菌t1-8接种于绵羊血平板上，37℃倒置培养24h，观察无溶血圈产生，即溶血反应阴性，可用于肥料的开发利用。

绵羊血平板：蛋白胨10g，牛肉浸出粉10g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水定容至1000ml，ph7.5，高压灭菌(121℃，15min)冷却至60℃左右加入无菌脱纤维绵羊血60ml，旋转式充分摇匀后制平板。血琼脂层厚4mm。

实施例5、芽孢杆菌t1-8的液体发酵

将芽孢杆菌t1-8接种于发酵培养基中进行发酵。

发酵所用的发酵培养基(ph＝7.5±0.1)的溶质包括碳源、氮源、氯化钠、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌和硫酸锰；溶质为水。其中，部分溶质及其所述发酵培养基中的浓度为：氯化钠0.5g/100ml，磷酸二氢钾0.1g/100ml，氯化钙0.1g/100ml，硫酸镁0.1g/100ml，硫酸亚铁0.05g/100ml，硫酸锌0.05g/100ml，硫酸锰0.05g/100ml。

根据液体发酵培养基中的碳源、氮源、碳氮比、发酵温度、装液量、接菌量、发酵体系出书ph和发酵的转速，设计如表2所示的单因素实验，统计发酵结束时发酵液中的od600。表2中各碳源和氮源的含碳量、含氮量和碳氮比见表3。

表2中的接菌量是将含有10⁹个/ml芽孢杆菌t1-8的lb液体培养液接种于发酵体系时的体积百分含量，括号中为接种后初始发酵体系中的菌浓度。

表2

表3

结果如图5所示。发酵液中最高od600＝6.76。

根据图5的结果，设计如表4所示的正交实验(每组设置24h和48h两个发酵时间)。统计发酵结束时发酵液的od600或芽孢量。

表4

结果如图6所示。发酵24h后发酵液中最高od600＝12.11，发酵48h后发酵液中最高od600＝12.98，芽孢数量中最高可达到1×10¹⁰个/ml-1.5×10¹⁰个/ml。

根据上述结果，确定芽孢杆菌t1-8的最佳发酵培养基(ph＝7.5±0.1)的溶质为糖蜜、豆粕粉、氯化钠、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌和硫酸锰；溶质为水。其中，溶质及其所述发酵培养基中的浓度为：糖蜜5g/100ml，豆粕粉0.72g/100ml，氯化钠0.5g/100ml，磷酸二氢钾0.1g/100ml，氯化钙0.1g/100ml，硫酸镁0.1g/100ml，硫酸亚铁0.05g/100ml，硫酸锌0.05g/100ml，硫酸锰0.05g/100ml。

将芽孢杆菌t1-8按照5％的接菌量接种于上述发酵培养基中，35℃、180rpm培养48h。在此条件下，发酵结束时发酵液中活菌或芽孢量≥1×10¹⁰个/ml。

实施例6、微生物有机肥的制备

用于制备微生物有机肥的有机物料购于江阴市联业生物科技有限公司，为腐熟后的牛粪猪粪秸秆混合堆肥，其中全氮含量为1.56％，全磷含量为2.52％，全钾含量为1.32％，有机质含量为48.51％，含水量为28.26％，ph为6.8。在进行二次发酵前将有机物料用清水补至50％-65％再进行二次发酵。

1、将芽孢杆菌t1-8按照5％的接种量接种于实施例5筛选的最佳发酵培养基中，35℃、180rpm培养48h，得到液体发酵菌液(此时菌浓度约为1×10¹⁰-1.5×10¹⁰个/ml)。

2、将步骤1得到的液体发酵菌液与有机物料均匀混合后于通风阴凉处进行二次固体发酵，每吨有机物料中加入30l液体发酵菌液(即每吨有机物料中加入3×10¹⁴-5×10¹⁴个芽孢杆菌t1-8)，第四天时进行一次翻堆，使其发酵温度保持在30℃-50℃，将发酵体系的含水量控制在50～60％，发酵7天后结束，得到微生物有机肥。

经检测，微生物有机肥中的活菌或芽孢量达到5×10⁸-2×10⁹个/g。

实施例7、大田小区试验验证微生物有机肥的肥效

2018年6月下旬至10月初在山东滨州“渤海粮仓无棣示范样板项目区”选择三块盐碱程度高低不同(3‰盐分地块、4‰盐分地块、5‰盐分地块)的盐碱地进行小区试验，种植品种为恒源一号玉米，分别施加不同肥料处理(处理方法见表5)，三个月后对玉米进行取样测产同时取土样测定土壤理化性质(采用重铬酸钾氧化-外加热法测定土壤有机质含量；采用半微量凯氏定氮法测定土壤全氮含量；采用naoh碱熔融钼锑抗分光光度法测定土壤全磷含量；采用残渣烘干-重量法测定土壤全盐含量；采用玻璃电极法测定土壤ph；采用乙酸钠提取-原子吸收分光光度法测定土壤阳离子交换量；采用硝酸银滴定法测定土壤氯离子含量；采用硝酸-双氧水-氢氟酸消解，icp-aes测定土壤钾钠元素含量；上述方法记载于文献“梁宇雁.硝酸-氢氟酸-双氧水体系消解土壤中的重金属[j].广东化工,2017(8).”)验证该微生物有机肥的肥效。

表5中，复合肥为购买于无棣县化肥种子农药店，其中n-p2o5-k2o为16-16-16；普通有机肥为实施例5中用于制备微生物有机肥的有机物料，购于江阴市联业生物科技有限公司，为腐熟后的牛粪猪粪秸秆混合堆肥，其中全氮含量为1.56％，全磷含量为2.52％，全钾含量为1.32％，有机质含量为48.51％，含水量为28.26，ph为6.8。

表5

小区试验分别设置3个重复，随机分布。在每个小区施入肥料后进行旋耕，旋耕之后播种，隔一天浇水。在玉米抽雄期施追肥一次。追肥时采样测量玉米的株高、茎粗及干鲜重等。三个月后对玉米进行采样测产，并取土样测定土壤理化性质。

玉米外观如图7所示。图7中，t1对应表5中不施肥的结果(ck)，t2对应表5中常规化肥的结果(npk)，t3对应表5中普通有机肥的结果(npk(bio))，t4对应表5中t1-8有机肥的结果(t1-8(bio))。

玉米产量统计结果如表6所示。表6中，a为3‰盐分地块检测结果；b为4‰盐分地块检测结果；c为5‰盐分地块检测结果。

土壤理化性质检测结果如表7。所示。表7中，a为3‰盐分地块检测结果；b为4‰盐分地块检测结果；c为5‰盐分地块检测结果。

上述表中，t1对应表5中不施肥的结果(ck)，t2对应表5中常规化肥的结果(npk)，t3对应表5中普通有机肥的结果(npk(bio))，t4对应表5中t1-8有机肥的结果(t1-8(bio))。

表6

表7

上述结果表明，菌株t1-8微生物有机肥料施入盐碱程度不同土壤后，与使用普通肥料相比，土壤有机质含量增加，ph和含盐量有所下降；菌株t1-8微生物有机肥料能够改良土壤的理化性质且提高作物的产量，可在很大程度上缓解盐胁迫对作物的伤害，提高盐碱地作物的产量。本发明制备的微生物有机肥料可专用于盐碱地作物增产。

序列表

<110>中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

南京农业大学

<120>一株增强作物耐盐能力的根际促生菌及其微生物肥料和应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1463

<212>dna

<213>副地衣芽孢杆菌(bacillusparalicheniformis)

<400>1

accatcggtaactctatactgcgagctggctccaaaggttacctcaccgacttcgggtgt60

tacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcgg120

catgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgat180

ccgaactgagaacagatttgtgggattggcttagcctcgcggcttcgctgccctttgttc240

tgcccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatcc300

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