一种合成pRNA-3WJ-siLNAgapmer-aptamer的方法与流程

本申请涉及分子生物学领域，尤其涉及一种合成prna-3wj-silnagapmer-aptamer的方法。

背景技术：

现有使用的抗结核药物易耐药，并且脊柱结核硬化壁包裹等原因使脊柱结核病灶药物浓度低，容易出现脊柱结核治疗失败的问题。

由此可见，如何克服治疗脊柱结核时治疗成功率低的问题是本领域技术人员亟待解决的问题。

技术实现要素：

本申请提供了一种合成prna-3wj-silnagapmer-aptamer的方法，解决了现有技术中如何克服在治疗脊柱结核时，治疗成功率低的问题。

为解决上述技术问题，本申请提供了一种合成纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer的方法，包括：

以具有“三路结”结构域3wj的噬菌体phi29包装prna，将prna-3wj作为基因载体；

在所述3wj的一端嵌合小干扰lna；

在所述3wj的另一端嵌合能够靶向结合cd40细胞的cd40分子的rna适配体以合成纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer；

其中，锁核酸silnagapmer与结核基因mce4对应，适配体aptamer与cd40对应。

优选地，还包括：

对所述纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer的条链进行自动化合成。

优选地，所述对所述纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer的条链进行自动化合成包括：

依次对所述纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer的第一条链、第二条链、第三条链以及第四条链进行自动化合成。

优选地，在对所述第一条链或所述第二条链或所述第三条链或所述第四条链进行自动化合成之后，还包括：

对自动化合成后的所述纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer的四条链进行高效液相纯化。

优选地，还包括：

将高效液相纯化后的所述纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer的四条链冻干呈固体状，再放入零下80℃超低温冰箱中进行保存；

分别对所述第一条链、所述第二条链、所述第三条链以及所述第四条链进行溶解以形成溶液；

将各所述溶液加入0.5mlpcr管中，并混合均匀；

将所述0.5mlpcr管放入热循环仪以进行成反应。

优选地，在所述prna-3wj中还加入荧光探头。

优选地，所述荧光探头为alexa647，其中，所述prna-3wj纳米微粒的一条链用于连接所述alexa647。

相比于现有技术，本申请所提供的一种合成纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer的方法，首先以具有“三路结”结构域3wj的噬菌体phi29包装prna，将prna-3wj作为基因载体；接着在3wj的一端嵌合小干扰lna；在3wj的另一端嵌合能够靶向结合cd40细胞的cd40分子的rna适配体以合成纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer；其中，锁核酸silnagapmer与结核基因mce4对应，适配体aptamer与cd40对应。本申请中的锁核酸silnagapmer是专门抑制结核基因mce4的，适配体sptamer是专门针对cd40的，结核病灶中含有cd40，通过实验研究发现纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer可以靶向进入病灶，并且可以有效抑制结核分枝杆菌(结核杆菌)在人成骨细胞中的生长存活；进而可以提高在治疗脊柱结核时的治疗成功率。

附图说明

为了更清楚的说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简要的介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例所提供的一种合成纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer的方法流程图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚完整的描述。

本申请的核心是提供一种合成prna-3wj-silnagapmer-aptamer的方法，可以解决如何克服在治疗脊柱结核时，治疗成功率低的问题。

图1为本发明实施例所提供的一种合成纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer的方法流程图，如图1所示，该方法包括以下步骤：

s101：以具有“三路结”结构域3wj的噬菌体phi29包装prna，将prna-3wj作为基因载体；

s102：在3wj的一端嵌合小干扰lna；

s103：在3wj的另一端嵌合能够靶向结合cd40细胞的cd40分子的rna适配体以合成纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer；

其中，锁核酸silnagapmer与结核基因mce4对应，适配体aptamer与cd40对应。

在本申请实施例中，具有“三路结”结构域的3wj是three-wayjunction的缩写，通过对构建机制，即承载与转运功能、沉默效应、靶向作用机制的研究，在3wj的一端嵌合能够沉默结核分枝杆菌哺乳动物侵入蛋白4a(mammaliancell-entryproteins4a，mce4a)的小干扰lna(smallinterferinglna，silna)，在3wj的另一端嵌合能够靶向结合位于cd40t细胞表面的cd40分子的rna适配体(aptamer，是指能结合蛋白或其他小分子物质的单链或双链寡核苷酸)，应用dna和rna纳米构造术底端向上的“自组装”技术中的非模板组装法设计相应碱基序列，构建特异性的prna-3wj-sirna-aptamer纳米靶向基因微粒。silnagapmer是一种锁核酸，有抗感染的功能。aptamer是一种专门针对cd40的适配体，cd40是与t细胞和b细胞功能有关的一种表面抗原，在结核病灶中包含cd40。

噬菌体phi29的dna包装马达由prna环进行齿构成，prna环含有两个功能结构域。prna亚基的中心结构域包含两个互锁环，表示为右手和左手环，可以将其设计为形成二聚体，三聚体或六聚体。因为两个结构域分别折叠，用sirna替换螺旋结构域不会影响prna的结构、折叠或分子间相互作用。已显示这种prna/sirna嵌合体可用于基因治疗。这两个结构域通过三通连接(3wj)区域连接。已有研究显示prna的3wj区域可以由具有高亲和力的三片小rna寡聚体组装而成，三个寡聚体可以分别携带sirna，受体结合适配体(aptamer)或核酶(ribozyme)，产生适合作为治疗剂的三rna纳米微粒。

本申请实施例所提供的一种合成纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer的方法，首先以具有“三路结”结构域3wj的噬菌体phi29包装prna，将prna-3wj作为基因载体；接着在3wj的一端嵌合小干扰lna；在3wj的另一端嵌合能够靶向结合cd40细胞的cd40分子的rna适配体以合成纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer；其中，锁核酸silnagapmer与结核基因mce4对应，适配体aptamer与cd40对应。本申请中的锁核酸silnagapmer是可能抑制结核基因mce4的，适配体sptamer是专门针对cd40的，结核病灶中含有cd40，通过实验研究发现纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer可以靶向进入病灶，并且可以有效抑制结核分枝杆菌(结核杆菌)在人成骨细胞中的生长存活；进而可以提高在治疗脊柱结核时的治疗成功率。

在上述实施例的基础上，作为优选地实施方式，还包括：

对纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer的条链进行自动化合成。

优选地，对纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer的条链进行自动化合成包括：依次对纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer的第一条链、第二条链、第三条链以及第四条链进行自动化合成。

优选地，在对第一条链或第二条链或第三条链或第四条链进行自动化合成之后，还包括：

对自动化合成后的纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer的四条链进行高效液相纯化。

优选地，还包括：

将高效液相纯化后的纳米靶向基因prna-3wj-silnagapmer-aptamer的四条链冻干呈固体状，再放入零下80℃超低温冰箱中进行保存；

分别对第一条链、第二条链、第三条链以及第四条链进行溶解以形成溶液；

将各溶液加入0.5mlpcr管中，并混合均匀；

将0.5mlpcr管放入热循环仪以进行合成反应。

由于prna-3wj-silnagapmer-aptamer纳米微粒基因的合成需要使用等摩尔比的溶液，在实际应用时，使用1x双向缓冲液(1x双向缓冲液由30mmhepes，ph7.5，100mmpotassiumacetate组成)对四条链溶解。将prna-3wj-silnagapmer-aptamer纳米微粒基因的4条链寡核苷酸均配制成100nmol/ml的浓度。配制完成的各个溶液经分装之后立即放入-80℃超低温冰箱保管。具体地，就是在冰块架中插入0.5mlpcr管进行预冷却，约10分钟的冷却之后，在0.5mlpcr管中小心放入4条链的寡核苷酸溶液约100μl，并用吸液管上下混匀使之完全混合。此后，把含有4条链的寡核苷酸溶液混合液的0.5mlpcr管放入ptc-200热循环仪进行合成反应，这种合成反应需先加热到95℃之后非常缓慢的冷却，合成完的产物分装至0.5mlpcr管之后，放入零下80℃超低温冰箱保管。

为了便于检测，在上述实施例的基础上，作为优选地实施方式，在prna-3wj中还加入荧光探头。优选地，荧光探头为alexa647，其中，prna-3wj纳米微粒的一条链用于连接alexa647。也就是在该纳米微粒四条链中的一条链中还加入alexa647荧光探头。

为了使本领域技术人员更好地理解本方案，下面以具体的实验对本方案进行详细说明。以下在细胞模型中的实验可以证实prna-3wj-silnagapmermce4-aptamer纳米微粒可以有效抑制结核杆菌。

将已浸染结核杆菌的人成骨细胞随机分为a、b、c、d四组，a为空白对照组，b、c、d为实验组，将prna-3wj-silnagapmermce4-aptamer纳米微粒用1:1的dmem/f12培养基分别稀释至0.1μm，1μm，10μm。0.1μm纳米微粒作用于b组，1μm纳米微粒作用于c组，10μm纳米微粒作用于d组。之后将a、b、c、d四组成骨细胞培养18小时之后，再一次以同样浓度进行为期18小时的增强处理，总共经过36小时的纳米微粒作用之后，小心移除细胞培养液；用1xdbps清洗细胞3次。之后加入2ml的细胞裂解液进行裂解细胞，先在室温下培养5分钟，在显微镜下观察是否完全裂解。

上述纳米微粒处理之后所得到的裂解产物1ml，用即用型液体培养基(middlebrook7h9)培养液稀释20倍，之后均匀涂抹到琼指平板。放入到37℃、5％co2细胞培养箱中培养21天，等21天培养之后，可观察到菌落。菌落的影像收集及分析使用了凝胶成像系统(geldocxr+system)，采集影像使用的光源是白光反射滤镜2，分析软件是凝胶成像附带的灰度分析软件。

经统计分析a、b、c、d四组之间菌落形成单位的差异存在统计学意义(f＝37.585，p<0.05)；且b、c、d三组的菌落形成单位分别与a组相比时，均明显低于a组(p<0.05)，表现为a组(227.333±14.50287)与b组(153.6667±45.00370)相比时，p﹤0.05；a组(227.333±14.50287)与c组(65.3333±24.58319)相比时，p﹤0.05；a组(227.333±14.50287)与d组(12.3333±6.80686)相比时，p﹤0.05。b、c、d三组之间两两相比时的菌落形成单位值也存在差异，且差异具有统计学意义(p﹤0.05)，表现为b组(153.6667±45.00370)与c组(65.3333±24.58319)相比时，p﹤0.05；b组(153.6667±45.00370)与d组(12.3333±6.80686)相比时，p﹤0.05；c组(65.3333±24.58319)与d组(12.3333±6.80686)相比时，p﹤0.05。并经统计分析b、c、d三组之间两两相比时的菌落形成单位值也存在差异，且差异具有统计学意义(p﹤0.05)，b、c、d三个实验组中菌落计数随着纳米微粒溶度的增高呈明显下降，结果证实prna-3wj-silnagapmermce4-aptamercd40纳米微粒可以有效抑制结核杆菌在人成骨细胞中的生长存活。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的申请后，将容易想到本申请的其他实施方案。本申请旨在涵盖本申请的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本申请的一般性原理并包含本申请公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为实例性的，本申请的正真范围由权利要求指出。

应当理解的是，本申请并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。以上的本申请实施方式并不构成对本申请保护范围的限定。