一种适用于Iso-Seq的百合鳞茎总RNA提取方法与流程

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种百合鳞茎总rna的提取办法，尤其适用于iso-seq的百合属植物鳞茎总rna的提取。

背景技术：

全长转录组研究是理解生物机体功能的一个重要途径，目前iso-seq越来越多地应用于无参考基因组物种。iso-seq全称叫做isoform-sequencing，是pacbio公司对其开发的转录本测序技术的规范化命名；是利用三代测序长读长的特点，不打断转录本，直接测序，从而得到全长转录本的一种测序技术。该技术可通过超长读长获得mrna全长序列及完整结构信息，克服了其转录本拼接短、信息不完整的难题，为后续功能基因挖掘、基因克隆等研究提供了物质基础。然而，相对于二代测序技术、pcr等分子技术，iso-seq对待测样品rna的质量、浓度和完整性提出了更高的要求。

百合是著名的球根花卉，具有较高的观赏、食用和药用价值。其基因组庞大，目前尚未进行全基因组测序，缺乏可利用的基因序列信息，iso-seq技术的运用可极大地促进百合研究。百合各组织中富含多糖多酚等物质，在鳞茎中更为突出，而多糖的许多理化性质与rna很相似，从而在沉淀rna时，往往产生富含多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的rna沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液，在去除多糖的同时rna也容易被带走，造成rna得率的减少，因此从百合中提取高质量的rna有相当的难度。

目前百合总rna提取方法大多是关于叶片、花瓣的报道，而适合于百合鳞茎总rna的提取方法很少，仅有杜运鹏，li,xueyan等为数不多的用改良ctab法提取过百合鳞茎总rna，但仍存在部分百合难以提取且耗时较长、操作繁琐等问题，不适用于大批量快速操作。trizol法提取rna降解严重且存在污染；普通试剂盒法操作简单、用时短，但大多提取浓度过低。因此，迫切需要开发一种方便易行、稳定性好、适用于iso-seq的百合鳞茎总rna提取方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种快速稳定的适用于iso-seq的百合鳞茎总rna提取方法。该方法提取的百合鳞茎总rna完整性好，纯度高，能够解决百合鳞茎总rna提取难的问题。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种适用于iso-seq的百合鳞茎总rna提取方法，包括以下步骤：

(1)对实验过程中所用物品及器材进行消毒和灭菌；

(2)取块状组培鳞茎的样品，在以液氮维持温度的条件下进行研磨；所得粉末状样品倒入离心管，置于液氮中备用；

(3)向新的离心管中依次加入裂解液clb和β-巯基乙醇；混匀后加入备用的粉末状样品，裂解至匀浆状态；

(4)对裂解物离心处理，取上清加入新的离心管，加入一半体积的无水乙醇；吹打混匀后，立即将混合物加入基因组清除柱；对清除柱离心，弃废液；

(5)将基因组清除柱放入新的离心管内，加裂解液rltplus后离心处理；收集滤液，并记下体积，加入一半体积的无水乙醇，立即吹打混匀；

(6)将混合物加入吸附柱ra中，对吸附柱ra离心，弃废液；

(7)向吸附柱ra中加入去蛋白液rw1，室温放置后离心，弃废液；以漂洗液rw对吸附柱ra漂洗两次后，再进行处理后的离心；

(8)将吸附柱ra放入rnasefree离心管中，加入rnasefreewater洗脱，得到总rna溶液。

本发明中，所述步骤(1)中的消毒和灭菌包括：将实验需用到的枪头、离心管、研钵、研杵和药匙用铝箔纸包裹后置于高压灭菌锅中，121℃灭菌40min；然后置于烘箱中80℃烘30min，备用；操作台面用75％酒精喷雾后，用无菌纸拭干；操作人员佩戴一次性无菌口罩和手套，并适时更换。

本发明中，所述步骤(2)中的以液氮维持温度是指，研磨所用研钵提前放入液氮中预冷，在研磨过程中多次适量添加液氮以保持低温，防止样品潮解(否则rna容易降解且样品容易结霜，后期在裂解液中容易结团或结块而影响裂解效果)。

本发明中，所述步骤(3)中，裂解液clb、β-巯基乙醇和样品按下述比例添加：裂解液clb体积1.6ml∶β-巯基乙醇体积80μl∶样品质量400～500mg；其中，β-巯基乙醇的体积比浓度为5％。

本发明中，所述步骤(3)中，所述裂解指：加入样品立即进行剧烈涡旋，涡旋时间为1～2min，如出现难溶絮状团块则用枪头吹打以辅助其裂解；裂解过程中放回65℃水浴15min，水浴过程中取出涡旋2～3次辅助裂解；直至没有明显成团或成块的絮状物。

(裂解操作有多种方案，例如可以选择全部加入到一个2ml离心管混合混匀，也可以选择用两个1.5ml离心管，各加入样品200～250mg、裂解液clb0.8ml、β-巯基乙醇40μl(体积比浓度5％)，混匀离心后用移液枪将上清转移到同一个新的离心管中。)

本发明中，所述步骤(4)中，将混合物平均加入多个基因组清除柱，并分别离心；加入混合物时，用移液枪挑除混合物中的絮状不溶的漂浮物(以降低基因组清除柱的清除压力，更有效地将dna除去)。

本发明中，所述步骤(5)中，裂解液rltplus的添加量为500μl，离心速度为13000rpm，离心时间为30秒。

本发明中，所述步骤(6)中，将全部混合物加入同一个吸附柱ra中，通过浓缩保证rna的浓度；对吸附柱ra离心时，转速为13000rpm，时间为2min，并确保离心后液体全部滤出，膜上没有残留。

本发明中，所述步骤(7)中，具体包括以下步骤：

(7.1)向吸附柱ra中加700μl去蛋白液rw1，室温放置1min，13000rpm离心30秒，弃掉废液；

(7.2)加入500μl漂洗液rw，13000rpm离心30秒，弃掉废液；再加入500μl漂洗液rw重复该操作；漂洗液rw中按10:42体积比预先添加入无水乙醇(即直接在原试剂10ml基础上添加42ml无水乙醇)；

(7.3)将吸附柱ra放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液残留乙醇抑制下游反应。

本发明中，所述步骤(8)中，具体包括以下步骤：

(8.1)rnasefreewater事先置于75℃水浴中预热；

(8.2)将吸附柱ra放入rnasefree离心管中，在吸附膜中间部位加入30μlrnasefreewater，洗脱得到总rna溶液；

(8.3)总rna溶液置于冰上待测，或者放置在-80℃的冰箱中保存。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明不需使用酚、氯仿等有毒的刺激性试剂，更好保护了操作人员的安全；

2、本发明操作简单，耗时短；

3、本发明提取的rna完整性好，纯度高，可满足于全长转录组测序等绝大多数分子生物学实验的需要。

附图说明

图1是实施例3重复1中野百组培鳞茎nanodrop检测rna质量峰图；

图2是实施例1、2、3中三种百合鳞茎rna的琼脂糖凝胶电泳图，从左至右依次为：索邦、巨百和野百，每个种(或品种)有2个重复；

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

本发明通过三个实施例和两个对比例对东方百合‘索邦’(liliumorientalhybrid'sorbonne')、巨球百合(liliumbrowniivar.giganteum)和野百合(liliumbrownii)组培鳞茎的总rna提取过程进行说明(下文中以简称“索邦”、“巨百”和“野百”代替，其中野百更是百合鳞茎rna难以提取的典型代表，除此之外各种方法提取均未能达到要求)。每个实施例均设置2个重复，对比例不设置重复。

实验前准备工作包括：将所用到的枪头、离心管、研钵、研杵和药匙用铝箔纸包裹后于高压灭菌锅中121℃灭菌40min，之后拿出放到烘箱中80℃烘30min，待用；操作台面用75％酒精喷雾后用无菌纸拭干，并准备好无菌口罩和手套。

实施例1：

用本方法对索邦组培鳞茎总rna进行提取，包括以下步骤：

(1)取索邦组培鳞茎小块(-80℃冰箱拿出)放入液氮提前预冷的研钵中，快速研磨，期间及时添加液氮防止样品潮解，研磨至均匀的粉末状态后迅速倒入50ml离心管，将离心管放入液氮中备用；

(2)取1.6ml裂解液clb至2ml离心管内(2个重复，即2管，以下操作为求简洁明了以单一重复操作进行说明)，在裂解液clb中加入β-巯基乙醇80μl(体积比浓度5％)，颠倒混匀，用液氮预冷的药匙转移约400mg的索邦鳞茎粉末至裂解液中，立即剧烈涡旋并用枪头辅助吹打1min，短时放回65℃水浴中15min，中间拿出涡旋2次得到满意匀浆效果(没有成团或成块的絮状物)；

(3)将裂解物13000rpm离心10min；

(4)取裂解物上清转到一个新的离心管，加入上清体积一半的无水乙醇，立即吹打混匀，不要离心；

(5)立即将混合物(每次不超过720μl)平均加入3个基因组清除柱中，清除柱放入收集管中，13000rpm离心2min，弃掉废液，加入混合物时用枪头小心挑开絮状不溶物；

(6)将基因组dna清除柱子放在一个新的2ml离心管内，在基因组清除柱内加500μl裂解液rltplus，13000rpm离心30秒，收集滤液，并记下体积，加入一半体积的无水乙醇，立即吹打混匀；

(7)立刻将混合物加入一个吸附柱ra中(吸附柱放入收集管中)，13000rpm离心2min，弃掉废液，确保液体全部滤出；

(8)加700μl去蛋白液rw1，室温放置1min，13000rpm离心30秒，弃掉废液；

(9)加入500μl漂洗液rw(已加入无水乙醇)，13000rpm离心30秒，弃掉废液，加入500μl漂洗液rw重复一遍；

(10)将吸附柱ra放回空收集管中，13000rpm离心2min；

(11)取出吸附柱ra放入一个rnasefree离心管中，在吸附膜中间部位加30μlrnasefreewater(事先在75℃水浴中加热)，室温静置1min，12000rpm离心1min，得到rna溶液，之后对其进行nanodrop检测、琼脂糖凝胶电泳以及华大公司用于iso-seq测序的各项检测，具体结果见附图2及表1。

实施例2：

用本方法对巨百组培鳞茎总rna进行提取，包括以下步骤：

(1)取巨百组培鳞茎小块(-80℃冰箱拿出)放入液氮提前预冷的研钵中，快速研磨，期间及时添加液氮防止样品潮解，研磨至均匀的粉末状态后迅速倒入50ml离心管，将离心管放入液氮中备用；

(2)取1.6ml裂解液clb至2ml离心管内(2个重复，即两管，以下操作为求简洁明了以单一重复操作进行说明)，在裂解液clb中加入β-巯基乙醇80μl(体积比浓度5％)，颠倒混匀，用液氮预冷的药匙转移约450mg的巨球百合鳞茎粉末至裂解液中，立即剧烈涡旋1.5min，短时放回65℃水浴中15min，中间拿出涡旋3次得到满意匀浆效果(没有成团或成块的絮状物)；

(3)将裂解物13000rpm离心10min；

(4)取裂解物上清至一个新的离心管，加入上清体积一半的无水乙醇，立即吹打混匀；

步骤(5)到(10)与实施例一中步骤(5)到(10)一致，在此不再赘述。

(11)取出吸附柱ra放入一个rnasefree离心管中，在吸附膜中间部位加30μlrnasefreewater(事先在75℃水浴中加热)，室温静置1min，12000rpm离心1min，得到rna溶液，之后对其进行nanodrop检测、琼脂糖凝胶电泳以及华大公司用于iso-seq测序的各项检测，具体结果见附图2及表1。

实施例3：

用本方法对野百组培鳞茎总rna进行提取，包括以下步骤：

(1)取野百组培鳞茎小块(-80℃冰箱拿出)放入液氮提前预冷的研钵中，快速研磨，期间及时添加液氮防止样品潮解，研磨至均匀的粉末状态后迅速倒入50ml离心管，将离心管放入液氮中备用；

(2)取1.6ml裂解液clb至2ml离心管内(2个重复，即两管，以下操作为求简洁明了以单一重复操作进行说明)，在裂解液clb中加入β-巯基乙醇80μl(体积比浓度5％)，颠倒混匀，用液氮预冷的药匙转移约500mg的野百合鳞茎粉末至裂解液中，立即剧烈涡旋2min，边用枪头吹打难溶的絮状团块，短时放回65℃水浴中15min，中间拿出涡旋3次得到满意匀浆效果(没有成团或成块的絮状物)；

(3)将裂解物13000rpm离心10min，沉淀不能裂解的碎片；

(4)取裂解物上清转到一个新的离心管，加入上清体积一半的无水乙醇，立即吹打混匀，不要离心；

步骤(5)到(10)与实施例一中步骤(5)到(10)一致，在此不再赘述。

(11)取出吸附柱ra放入一个rnasefree离心管中，在吸附膜中间部位加30μlrnasefreewater(事先在75℃水浴中加热)，室温静置1min，12000rpm离心1min，得到rna溶液，之后对其进行nanodrop检测、琼脂糖凝胶电泳以及华大公司用于iso-seq测序的各项检测，具体结果见附图1、2及表1。

对比例1：

本对比例采用改良ctab法对野百鳞茎总rna进行提取，包括以下步骤：

(1)取野百组培鳞茎小块(-80℃冰箱拿出)放入液氮提前预冷的研钵中，快速研磨，期间及时添加液氮防止样品潮解，研磨至均匀的粉末状态后迅速倒入50ml离心管，将离心管放入液氮中备用；

(2)取2ml离心管，在通风橱中每管加700μlctab溶液，加14μlβ-巯基乙醇(2％)，每个样品两管提取液；

(3)将加好的试管放入65℃水浴锅中预热(稍敞口，以免管子受热爆开)；

(4)每管加入研磨好的野百粉末150mg，在漩涡仪上充分混匀后放入65℃水浴锅15min(中间拿出进行漩涡3次)；

(5)在通风橱中每管加入720μl氯仿：异戊醇试剂，漩涡混匀后15℃，10000rpm离心10min；

(6)在通风橱中吸上清液至新2ml管，再加720μl氯仿：异戊醇试剂，漩涡混匀后15℃，10000rpm离心10min；

(7)吸取上清液至新2ml管，两管合一管；

(8)加入1/5体积12mlicl，吸打混匀，-20℃冰箱放置15h后4℃，12000rpm离心20min；

(9)倒掉上清液，在吸水纸上扣干，加入20μlrnase-freewater，涡旋混匀；

(10)20μl样品，加入5μl10×dnaseibμfferbμffer+1μldnasei+1.25μlrnaseoμt+22.75μlrnase-freewater(通过样品数，计算总量，后每30μl/样加入)后37℃金属浴30min；

(11)加入300μlrnase-freewater，加入350μl苯酚：氯仿：异戊醇试剂，漩涡混匀后4℃，12000rpm离心5min；

(12)取上清液，加入等体积氯仿：异戊醇试剂的1.5ml离心管中，漩涡混匀后4℃，10000rpm离心1min；

(13)将上清液吸出至新1.5ml离心管中，加入两倍体积的无水乙醇和1/10体积的3m醋酸钠；上下颠倒混匀，-80℃放置1h后4℃，12000rpm离心20min；

(14)弃上清，用70％乙醇洗涤，漩涡混匀后4℃，12000rpm离心15min；

(15)重复上一步操作后倒掉上清液，倒扣于吸水纸上，并在离心机中快甩，用移液枪吸出残液，在通风橱中晾干(＜10min，以防过干)；

(16)加入30μlrnase-freewater得到总rna溶液，将得到的总rna溶液于nanodrop检测rna浓度及od260/280和od260/230，检测结果见附表1。

对比例2：

采用天根的多糖多酚植物总rna提取试剂盒对野百鳞茎总rna进行提取，步骤如下：

(1)取野百组培鳞茎小块放入液氮提前预冷的研钵中，快速研磨，期间及时添加液氮防止样品潮解，研磨至均匀的粉末状态后迅速倒入50ml离心管，放入液氮中备用；

(2)取2ml离心管，每管加700μlsl裂解液，加35μl巯基乙醇(体积比浓度5％)，每个样品两管提取液；

(3)每管加入研磨好的野百粉末约150mg，立即涡旋剧烈震荡混匀；

(4)12000rpm离心2min；

(5)将上清转移至过滤柱cs上(过滤柱放在收集管上)，12000rpm离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的rnase-free的离心管中；

(6)缓慢加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀，将得到的两管溶液和沉淀一起转入同一个吸附柱cr3中，12000rpm离心15秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管；

余下步骤按照天根多糖多酚植物总rna提取试剂盒说明书进行，得到的总rna溶液于-80℃冰箱保存，之后送至华大基因用于iso-seq测序的各项检测，检测结果见表1。

表1本发明与其它常用方法提取百合鳞茎rna效果对比(“/”表明该项没有测定；rin为rnaintegritynumber的缩写)。

从表1中可以看出，采用本方法提取的6个样品百合鳞茎总rna浓度均高于80ng/μl，且大部分浓度在100ng/μl以上，而采用改良ctab法的对比例1和采用天根试剂盒提取的对比例2中的浓度均不足40ng/μl，浓度过低，难以满足测序的要求。实施列中od260/280均在2.0～2.2之间，od260/230均高于1.6，表明用本方法提取的总rna没有受到蛋白和酚类等物质的污染，多糖去除比较干净,所得总rna纯度较高。rin值反应rna完整性情况，数值越接近10表明样品完整性越高，反之，完整性越差，满足iso-seq的rna一般要求rin≥6.5。用本方法提取的rna完整性高，除了实施例2中巨百重复1所得总rna的rin值为6.4，其余均大于7.0，实施例3中野百重复2的rin值甚至高达8.0。相对于其它常用方法，本发明提取的百合鳞茎总rna浓度和纯度较高、完整性好，满足iso-seq等绝大多数分子生物学研究的需要。