一、技术领域
本发明涉及动物胶原蛋白提取技术，具体是一种微波辅助的生物胶原提取方法。
二、
背景技术：
生物胶原一般指从动物组织中提取得到的生物性高分子物质，含有天然的三股螺旋结构。胶原是一种极具生物医学利用的材料，已被广泛用作各种组织工程支架、创伤敷料、药物载体、止血材料等(刘新华,但年华,李正军,等.胶原基复合医用海绵的研究进展[j].西部皮革,2012,(8):13-18.)。虽然胶原纤维得结构稳定，胶原的溶解性差，但可通过改变胶原蛋白所处的外界环境，使胶原分子间交联键断裂，使其从胶原组织中分离、溶解出来，获得生物胶原蛋白。目前，从动物组织中提取胶原蛋白的方法主要有：酸法、碱法、盐法、酶法及其结合法。酸法是利用低离子浓度的酸破坏胶原蛋白纤维分子间的盐键和席夫碱，引起胶原蛋白纤维的膨胀和溶解，从而达到提取胶原蛋白的目的。酸法提取的生物胶原纯度高，结构完整性好，能够重构与天然胶原蛋白纤维性质相似的纤维。然而，常规的酸法提取，温度低(4-10℃)、时间长(24-72h)、提取率小，一般在10％以下(沈菊泉，汤俊，沈亚领，等.酸法制备牛皮胶原蛋白及其结构性质研究[j].食品工业,2009,(4):43-46)。而胶原蛋白的市场售价约为300-400元/g，提取率的大小方法的可行性和经济利益，如果采取一种新的、能显著提高胶原提取率的方法，即使提取率只有几个百分点的增加，都将具有重要的经济价值。
微波是一种电磁波，其作用于极性物质时，由于物体内分子的摩擦产生热效应而使被作用物升温，因此微波可以作为一种热源。同时，在微波场中化学反应速度会大幅加快，甚至一些只有在极端条件下才能发生的化学反应也可以在微波的辅助下在温和的条件下发生(金钦汉，戴树珊，黄卡玛.微波化学[m].北京：科学出版社，1999.)，因此微波被广泛用于促进化学反应的发生和提高化学反应的速率。将微波辐照用于胶原的提取，热效应会促使反应体系温度上升，增加反应物分子的运动速度，增加有效碰撞的频率，而微波非热效应的作用可在温和的条件下破坏胶原蛋白纤维分子间的盐键和席夫碱，引起胶原蛋白纤维的膨胀和溶解，从而为微波辅助提取生物胶原，缩短提取时间、大幅度提高提取率提供了可能。
三、
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，即胶原提取率低和时间长，提出的一种微波辅助的生物胶原提取方法。
为实现上述目的，发明人在已有的生物胶原提取方法的基础上，深入研究了胶原蛋白质在溶液中的反应以及微波辐照对蛋白质性质的影响。胶原是两性电解质，在酸性溶液中胶原会吸收一定的酸，酸容量约为0.82-0.9mmol，理论分析和实践表明，酸用量低于20倍裸皮质量，浓度低于0.2mol/l时，溶液中的酸被皮胶原完全吸收，皮胶原纤维不能受酸的作用而溶解出胶原分子，不能达到良好的胶原提取效果；酸用量大于40倍裸皮用量，浓度高于0.8mol/l时，溶液中有大量的游离酸存在，在微波的作用下，胶原蛋白分子会水解而变为多肽或氨基酸，从而也影响了生物胶原的提取率。研究还发现，酸用量在20-40倍裸皮质量，浓度控制在0.2-0.8mol/l范围内，既能保证提取过程中的ph值的稳定，也能维持体系中一定的离子强度，在微波场的作用下，利于胶原蛋白纤维分子间的盐键和席夫碱受到酸的作用而断裂，加速胶原分子的分离和溶出。
微波反应器的功率，反应温度及时间的设置对微波辅助提取具有三股螺旋结构的生物胶原至关重要。胶原化学显示，原胶原分子由3条各有1052个氨基酸的肽链组成的，每个链上有162个带电侧链，有大量可解离的极性基团。这些极性分子在微波场中具有常规加热所不具有的分子振荡，可增加反应物分子之间的碰撞次数，加快胶原分子的分离和溶出速率。本发明人发现，当微波辐照引入胶原的提取反应时，不仅有热效应所带来的由于温度上升而导致的反应变化，还具有非热效应产生的常规加热方式所不具有的胶原分子的分离和溶出效果；在低于胶原蛋白变性温度的条件下，微波辐照不会使胶原蛋白变性，也不会破坏胶原蛋白分子结构；微波作为热源，在加热过程中伴随着热效应与非热效应，当辐照的功率小、反应温度低和时间短时，微波强度不能促使提取剂破坏胶原分子间的醇醛缩合交联、醛胺缩合交联以及醛醇组氨酸交联等作用，从而提取率较低；当辐照的功率大、温度高、时间长时，高强度的微波作用，会使提取得到的胶原蛋白分子进一步水解，导致提取的胶原产物中，存在部分更低分子量的多肽或氨基酸，从而也会使生物胶原的提取率下降，所得胶原的纯度降低。本发明人还发现，当微波辐照功率为80-800w，温度为15-35℃，反应时间3-7小时，既能显著提高胶原蛋白提取率和缩短提取时间，又能保持所提取胶原的结构和性质不变。
在上述研究的基础上，本发明人提出了一种微波辅助的生物胶原提取方法，该方法的特征是，将经过预处理的裸皮剪碎成0.5cm×0.5cm的小块，置于反应容器中，加入20-40倍0.2-0.8mol/l的有机酸溶液，反应容器中放有磁力搅拌子；将容器置于微波反应器中，施加功率为80-800w的微波能量，在15-35℃下，搅拌反应3-7小时，获得含胶原的提取液；将提取液经进一步纯化处理得到高纯度的胶原产品。
上述方法中所述的预处理过程包括浸水、脱脂、脱毛、浸灰以及脱灰，裸皮ph为6.0-7.0。
上述方法中所述的裸皮为牛皮、猪皮、羊皮、兔皮中的任意一种。
上述方法中所述的有机酸为甲酸、乙酸、丁酸、柠檬酸、苹果酸中的任意一种。
上述方法中所述的提纯处理为过滤、离心、盐析、透析以及冷冻干燥。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、高得率。采用本发明的方法可以从牛皮中提取得到的胶原蛋白产品得率高，达20％，是常规提取方法200-300％。
2、高效率。采用本发明的方法可以明显缩短提取胶原蛋白的提取时间，在6小时内就能完成提取操作，仅是常规提取方法所用时间的1/8到1/4。
3、产品性能优良。采用本发明的方法获得的胶原蛋白产品，保持了天然胶原结构和性质。
具体实施方式
下面给出实施例以对本发明作更详细的说明，有必要指出的是以下实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述本发明内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1：
取质量约为1kg的新鲜牛皮去除杂质后清洗，去肉，修边，称重。先将牛皮放于转鼓中，加皮重量50％、18℃的水，然后再加入0.05％的脱脂剂、0.1％的润湿剂及0.5％的硫氢化钠，转动30分钟后，再加入1.0％的硫化钠，转动40分钟。加入0.5％的浸灰助剂，转动10分钟，再加入3％的氧化钙与100％的水，转动8小时，过夜。次日转20min排液，闷水洗两次，每次5min。将浸灰后的皮样进行片皮处理，修边，称重，流水洗10分钟；将水洗后的牛皮放于转鼓中，加70％、25℃的水，然后再加入1％的氯化铵和0.3％的盐酸，转动60分钟。再加入一定量0.5％的盐酸，调节ph至6.0，蒸馏水冲洗，剪碎成0.5cm×0.5cm的小块。取脱灰后皮块100g于烧杯中，并加入20倍0.2mol/l的甲酸溶液，置于微波反应器中，在80w、15℃下，搅拌反应5小时。将提取液过滤、离心、盐析、透析以及冷冻干燥即可得到高纯度的胶原产品。
实施例2：
取质量约为1kg的新鲜猪皮去除杂质后清洗，去肉，修边，称重。先将猪皮放于转鼓中，加皮重量70％、20℃的水，然后再加入0.10％的脱脂剂、0.12％的润湿剂及0.8％的硫氢化钠，转动30分钟后，再加入1.5％的硫化钠，转动40分钟。加入0.6％的浸灰助剂，转动10分钟，再加入3.5％的氧化钙与150％的水，转动8小时，过夜。次日转20min排液，闷水洗两次，每次5min。将浸灰后的皮样进行片皮处理，修边，称重，流水洗10分钟；将水洗后的猪皮放于转鼓中，加80％、30℃的水，然后再加入2％的氯化铵和0.5％的盐酸，转动60分钟。再加入一定量0.5％的盐酸，调节ph至6.0，蒸馏水冲洗，剪碎成0.5cm×0.5cm的小块。取脱灰后皮块100g于烧杯中，并加入30倍0.4mol/l的乙酸溶液，置于微波反应器中，在240w、20℃下，搅拌反应3小时。将提取液过滤、离心、盐析、透析以及冷冻干燥即可得到高纯度的胶原产品。
实施例3：
取质量约为1kg的新鲜羊皮去除杂质后清洗，去肉，修边，称重。先将羊皮放于转鼓中，加皮重量90％、22℃的水，然后再加入0.15％的脱脂剂、0.15％的润湿剂及1.0％的硫氢化钠，转动30分钟后，再加入2％的硫化钠，转动40分钟。加入0.8％的浸灰助剂，转动10分钟，再加入4％的氧化钙与200％的水，转动8小时，过夜。次日转20min排液，闷水洗两次，每次5min。将浸灰后的皮样进行片皮处理，修边，称重，流水洗10分钟；将水洗后的羊皮放于转鼓中，加90％、32℃的水，然后再加入3％的氯化铵和0.6％的盐酸，转动60分钟。再加入一定量0.5％的盐酸，调节ph至6.5，蒸馏水冲洗，剪碎成0.5cm×0.5cm的小块。取脱灰后皮块100g于烧杯中，并加入40倍0.6mol/l的丁酸溶液，置于微波反应器中，在480w、30℃下，搅拌反应4小时。将提取液过滤、离心、盐析、透析以及冷冻干燥即可得到高纯度的胶原产品。
实施例4：
取质量约为1kg的新鲜兔皮去除杂质后清洗，去肉，修边，称重。先将兔皮放于转鼓中，加皮重量100％、25℃的水，然后再加入0.15％的脱脂剂、0.2％的润湿剂及1.0％的硫氢化钠，转动30分钟后，再加入2％的硫化钠，转动40分钟。加入1.0％的浸灰助剂，转动10分钟，再加入5％的氧化钙与300％的水，转动8小时，过夜。次日转20min排液，闷水洗两次，每次5min。将浸灰后的皮样进行片皮处理，修边，称重，流水洗10分钟；将水洗后的兔皮放于转鼓中，加100％、35℃的水，然后再加入2.5％的氯化铵和0.5％的盐酸，转动60分钟。再加入一定量0.5％的盐酸，调节ph至7.0，蒸馏水冲洗，剪碎成0.5cm×0.5cm的小块。取脱灰后皮块100g于烧杯中，并加入35倍0.8mol/l的柠檬酸溶液，置于微波反应器中，在640w、35℃下，搅拌反应5小时。将提取液过滤、离心、盐析、透析以及冷冻干燥即可得到高纯度的胶原产品。
实施例5：
取质量约为1kg的新鲜牛皮去除杂质后清洗，去肉，修边，称重。先将牛皮放于转鼓中，加皮重量80％、24℃的水，然后再加入0.12％的脱脂剂、0.18％的润湿剂及％的硫氢化钠，转动30分钟后，再加入2％的硫化钠，转动40分钟。加入0.7％的浸灰助剂，转动10分钟，再加入5％的氧化钙与300％的水，转动8小时，过夜。次日转20min排液，闷水洗两次，每次5min。将浸灰后的牛皮进行片皮处理，修边，称重，流水洗10分钟；将水洗后的牛皮放于转鼓中，加120％、32℃的水，然后再加入3％的氯化铵和0.6％的盐酸，转动60分钟。再加入一定量0.5％的盐酸，调节ph至6.8，蒸馏水冲洗，剪碎成0.5cm×0.5cm的小块。取脱灰后皮块100g于烧杯中，并加入25倍0.7mol/l的苹果酸溶液，置于微波反应器中，在720w、30℃下，搅拌反应7小时。将提取液过滤、离心、盐析、透析以及冷冻干燥即可得到高纯度的胶原产品。
实施例6：
取质量约为1kg的新鲜羊皮去除杂质后清洗，去肉，修边，称重。先将羊皮放于转鼓中，加皮重量70％、19℃的水，然后再加入0.17％的脱脂剂、0.13％的润湿剂及％的硫氢化钠，转动30分钟后，再加入2％的硫化钠，转动40分钟。加入0.7％的浸灰助剂，转动10分钟，再加入5％的氧化钙与300％的水，转动8小时，过夜。次日转20min排液，闷水洗两次，每次5min。将浸灰后的羊皮进行片皮处理，修边，称重，流水洗10分钟；将水洗后的羊皮放于转鼓中，加120％、32℃的水，然后再加入2.5％的氯化铵和0.5％的盐酸，转动60分钟。再加入一定量0.5％的盐酸，调节ph至6.3，蒸馏水冲洗，剪碎成0.5cm×0.5cm的小块。取脱灰后皮块100g于烧杯中，并加入25倍0.7mol/l的乙酸溶液，置于微波反应器中，在800w、32℃下，搅拌反应6小时。将提取液过滤、离心、盐析、透析以及冷冻干燥即可得到高纯度的胶原产品。
为了考察所用方法提取得到的胶原蛋白提取率及其性能，发明人采用对比实验的方法，获得常规水浴加热酸法提取的胶原蛋白；采用紫外分光光度法及线性回归方程对胶原蛋白提取率进行了测定，采用荧光分光光度法、傅里叶红外光谱以及圆二色谱等对提取得到的胶原蛋白的性能及结构进行了表征，具体测试数据如下表：
实施例产物的提取率和性质表：