一种拟海龙糖蛋白的制备方法和应用与流程

本发明涉及生物化学
技术领域：
，更具体的，涉及一种拟海龙糖蛋白的制备方法和应用。
背景技术：
：糖蛋白是由寡糖与多肽链共价结合形成。糖蛋白广泛存在于真核生物中，大多数的蛋白都有糖基化修饰，糖蛋白在生物体内起着重要的作用，与一些疾病的发生有着密切的关系。糖链具有微不均一性和非模板合成的特点，决定了糖链结构的复杂性，组成的多样性，因此对糖链的分析至今无法做出全面和完整的结构鉴定。糖蛋白具有增强免疫调节、抗肿瘤、抗炎症、降低血糖血脂、抗氧化防衰老等生物活性功能。糖蛋白的提取一般采用稀盐溶液浸提法、酸碱溶液提取法、化学试剂提取法以及酶提取法等方法，可根据提取对象的特性来确定提取方法。随着糖生物学研究的迅速发展，糖蛋白已成为生物化学研究的中心，吸引着许多学科，包括化学、生物学、生物化学、免疫学、细胞生物学、医药学以及食品科学的工作者从事这一领域的研究。拟海龙，别称杨枝鱼、钱串子、管口鱼等，属于海龙科，拟海龙主要产于我国东南部的广东、福建等省沿海。《本草纲目拾遗》记载了海龙“性温，味甘，暖水藏，壮阳道，消瘕块”。中国药典记载了其具有温肾壮阳，散结消肿的功效，药食同源，现在更多的人将其用来煲汤，具有补益作用，但至今鲜有关于拟海龙糖蛋白制备方法以及其对免疫系统调节作用的研究和报道。综上所述，研发一种拟海龙糖蛋白的制备方法和应用实为必要。技术实现要素：为克服上述现有技术所述的至少一种缺陷(不足)，本发明提供一种拟海龙糖蛋白的制备方法和应用，本发明的拟海龙糖蛋白的制备方法具有设计合理、工艺简单、操作方便，产品提取率高、纯度高，制备成本低，易于推广应用等优点。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种拟海龙糖蛋白的制备方法，包括以下步骤：①预处理：将拟海龙全体洗净，置于烘箱内，60℃干燥4h，再进行粉碎、过筛，得到拟海龙粗粉，称重；②脱脂处理：将步骤①得到的拟海龙粗粉与相当于其2倍体积量的丙酮加入旋转回流仪中，旋转回流提取，进行脱脂，然后过滤，将得到的脱脂粗粉烘干；③热水浸提：将步骤②得到的脱脂粗粉与蒸馏水按1:20-30(g/ml)的料液比加入水浴锅，搅拌均匀，80-100℃条件下提取2-3h，过滤，所得滤液备用，所得滤渣再与蒸馏水按1:20-30(g/ml)的料液比混合提取1h，过滤，合并两次的滤液，得到拟海龙糖蛋白混合溶液；④浓缩醇沉：将步骤③得到的混合溶液加入旋转蒸发器，50-70℃蒸发浓缩至原体积的1/5，在浓缩液中加入3倍体积量的乙醇，4℃静置12-18h，进行醇沉，将醇沉物离心后收集沉淀物，再对上清液重复醇沉操作至无沉淀析出，上清液每次醇沉时加入的乙醇量为其3倍体积量，上述醇沉操作中所加乙醇的浓度均为80-95％，合并沉淀物；⑤洗涤纯化：将步骤④得到的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇和丙酮的用量以浸没沉淀物为准，然后用蒸馏水将沉淀物完全溶解，所得溶液采用sevage法去除游离蛋白，再通过层析法去除色素，得到拟海龙糖蛋白溶液；⑥透析冻干：对步骤⑤得到的糖蛋白溶液装入透析袋，置于蒸馏水中，4℃下透析60-72h，去除小分子杂质，将透析的截留物冷冻干燥，即得淡黄色的拟海龙糖蛋白粉末，称重。进一步的，所述步骤⑤中，采用sevage法去除游离蛋白的具体步骤为：在沉淀物溶解所得溶液中加入sevage试剂，置于磁力搅拌器中振荡1h，再置于离心机中，4℃条件下，以12000r/min的转速离心15min，离心后溶液从上到下依次为水层、蛋白层、有机层，利用移液管将上层溶液吸出，重复上述步骤，直至离心后溶液不再出现蛋白层时，即可认为溶液中的蛋白质已基本除尽，收集上清液，得到深黄色糖蛋白溶液；其中，所述沉淀物溶液与sevage试剂的体积比为4:1，所述sevage试剂由氯仿与正丁醇按4:1的比例混合而成。进一步的，所述步骤⑤中，层析法除色素的具体步骤为：将去除游离蛋白后所得的深黄色糖蛋白溶液用蒸馏水稀释5-10倍后，缓慢加入ab-8大孔树脂层析柱中，以2ml/min的流速通过大孔树脂进行洗脱，全部加入后，再缓慢用2倍柱体积的蒸馏水进行洗脱，收集全部洗脱液并浓缩至原体积的1/10，得到拟海龙糖蛋白溶液。进一步的，所述步骤①中，将拟海龙干体进行粉碎，使所得拟海龙粗粉全部通过10目筛网。进一步的，所述步骤②中，旋转回流提取的条件为：60℃提取2h，旋转回流提取重复进行一次。进一步的，所述步骤③中，脱脂粗粉热水浸提过程中，每次提取的料液比均为1:20(g/ml)，热水浸提的温度为100℃，脱脂粗粉提取时间为2.5h。进一步的，所述步骤④中，对上清液重复进行醇沉操作时，每次加入的乙醇量相当于上清液体积的3倍体积量，拟海龙糖蛋白混合溶液和上清液在醇沉时所加乙醇的浓度均为85％。进一步的，所述步骤⑥中，所用透析袋的截留分子量为8000da，透析过程中每6小时更换一次透析液。本发明的拟海龙糖蛋白提取率＝步骤⑥所得拟海龙糖蛋白粉末重量/步骤①所得拟海龙粗粉重量*100％。本发明还公开了一种如上述制备方法制备得到的拟海龙糖蛋白在细胞免疫调节中的应用，通过实验证明拟海龙糖蛋白对小鼠来源单核巨噬细胞白血病细胞(raw264.7细胞)的增殖、吞噬能力以及细胞分泌no、il-6和tnf-α量的影响，从而说明拟海龙糖蛋白的免疫调节作用。与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：本发明的拟海龙糖蛋白制备方法中，采用丙酮对拟海龙粗粉进行脱脂，脱脂效率高，脱脂粗粉中无丙酮残留；采用热水浸提的方式提取拟海龙糖蛋白，工艺简单，操作方便，条件温和，可保证糖蛋白结构和活性不被破坏；浓缩后采用乙醇对糖蛋白溶液进行醇沉，可以将不同分子量阶段的糖蛋白进行收集提取，保证了制取糖蛋白种类的完整性，同时提高制备效率，无毒无害，安全性好；采用sevage法能够有效的脱除游离蛋白，避免游离蛋白对产品提取率和纯度的干扰；采用层析法对粗产品进行洗脱，去除无用的色素成分，提高产品的纯度和品相；再采用低温透析去除产品中的盐分及小分子杂质，进一步确保产品纯度，透析截留物进行冷冻干燥，既可防止蛋白质变性，又能保持蛋白质中的固有成分，最终得到的糖蛋白具有疏松、溶解度好、结构稳定等优点。总之，本发明的拟海龙糖蛋白的制备方法设计合理、工艺简单、操作方便可行，粗产品易于分离提纯，产品提取率高、纯度高；制备条件温和，制得的拟海龙糖蛋白结构稳定，同时也确保了糖蛋白的活性；制备方法中所使用的仪器试剂简单易得，因此制备成本低，且本发明的制备方法具有良好的重复性，易于推广应用。附图说明图1为提取时间对拟海龙糖蛋白提取率的影响；图2为提取温度对拟海龙糖蛋白提取率的影响；图3为料液比对拟海龙糖蛋白提取率的影响；图4为醇沉浓度对拟海龙糖蛋白提取率的影响；图5为苯酚-硫酸法测定糖含量标准曲线及回归方程；图6为拟海龙糖蛋白对raw264.7细胞增殖的影响；图7为拟海龙糖蛋白对raw264.7细胞吞噬能力的影响；图8为拟海龙糖蛋白对raw264.7细胞分泌no的影响；图9为拟海龙糖蛋白对raw264.7细胞分泌il-6的影响；图10为拟海龙糖蛋白对raw264.7细胞分泌tnf-α的影响。具体实施例下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，因此本发明要求保护的范围并不局限于所述。实施例1：一种拟海龙糖蛋白的制备方法，包括以下步骤：①预处理：将拟海龙洗净，置于烘箱内，60℃干燥4h，再进行粉碎、过10目筛，得到拟海龙粗粉，称重；②脱脂处理：将步骤①得到的拟海龙粗粉与相当于其2倍体积量的丙酮加入旋转回流仪中，60℃旋转回流提取2h，进行脱脂，然后过滤，滤渣再重复旋转回流提取一次，将得到的脱脂粗粉烘干；③热水浸提：将步骤②得到的脱脂粗粉与蒸馏水按1:20(g/ml)的料液比加入水浴锅，搅拌均匀，100℃条件下提取2.5h，过滤，所得滤液备用，所得滤渣再与蒸馏水按1:20(g/ml)的料液比混合提取1h，过滤，合并两次的滤液，得到拟海龙糖蛋白混合溶液；④浓缩醇沉：将步骤③得到的混合溶液加入旋转蒸发器，50℃蒸发浓缩至原体积的1/5，在浓缩液中加入3倍体积量的乙醇，4℃静置18h，进行醇沉，将醇沉物离心后收集沉淀物，再对上清液重复醇沉操作至无沉淀析出，上清液每次醇沉时加入的乙醇量为其3倍体积量，上述醇沉操作中所加乙醇的浓度均为85％，合并沉淀物；⑤洗涤纯化：将步骤④得到的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇和丙酮的用量以浸没沉淀物为准，然后用蒸馏水将沉淀物完全溶解，得到的溶液中加入相当于溶液体积1/4的sevage试剂(sevage试剂由氯仿与正丁醇按4:1的比例混合而成)，置于磁力搅拌器中振荡1h，再置于离心机中，4℃条件下，以12000r/min的转速离心15min，离心后溶液从上到下依次为水层、蛋白层、有机层，利用移液管将上层溶液吸出，重复上述步骤，直至离心后溶液不再出现蛋白层时，即可认为溶液中的蛋白质已基本除尽，收集上清液，得到深黄色糖蛋白溶液；将上述深黄色糖蛋白溶液用蒸馏水稀释5-10倍后，缓慢加入ab-8大孔树脂层析柱中，以2ml/min的流速通过大孔树脂进行洗脱，全部加入后，再缓慢用2倍柱体积的蒸馏水进行洗脱，收集全部洗脱液并浓缩至原体积的1/10，得到拟海龙糖蛋白溶液；⑥透析冻干：对步骤⑤得到的拟海龙糖蛋白溶液装入透析袋，所用透析袋的截留分子量为8000da，置于蒸馏水中，4℃下透析60-72h，每6小时更换一次透析液，去除小分子杂质，将透析的截留物冷冻干燥，即得淡黄色的拟海龙糖蛋白粉末，称重。实施例2：实施例2与实施例1的操作基本相同，其区别在于：在步骤③热水浸提中：将步骤②得到的脱脂粗粉与蒸馏水按1:25(g/ml)的料液比加入水浴锅，搅拌均匀，80℃条件下提取3h，过滤，所得滤液备用，所得滤渣再与蒸馏水按1:25(g/ml)的料液比混合提取1h，过滤，合并两次的滤液，得到拟海龙糖蛋白混合溶液；在步骤④浓缩醇沉中：将步骤③得到的混合溶液加入旋转蒸发器，60℃蒸发浓缩至原体积的1/5，在浓缩液中加入3倍体积量的乙醇，4℃静置12h，进行醇沉，将醇沉物离心后收集沉淀物，再对上清液重复醇沉操作至无沉淀析出，上清液每次醇沉时加入的乙醇量为其3倍体积量，上述醇沉操作中所加乙醇的浓度均为95％，合并沉淀物。实施例3：实施例3与实施例1的操作基本相同，其区别在于：在步骤③热水浸提中：将步骤②得到的脱脂粗粉与蒸馏水按1:30(g/ml)的料液比加入水浴锅，搅拌均匀，90℃条件下提取2h，过滤，所得滤液备用，所得滤渣再与蒸馏水按1:30(g/ml)的料液比混合提取1h，过滤，合并两次的滤液，得到拟海龙糖蛋白混合溶液；在步骤④浓缩醇沉中：将步骤③得到的混合溶液加入旋转蒸发器，70℃蒸发浓缩至原体积的1/5，在浓缩液中加入3倍体积量的乙醇，4℃静置16h，进行醇沉，将醇沉物离心后收集沉淀物，再对上清液重复醇沉操作至无沉淀析出，上清液每次醇沉时加入的乙醇量为其3倍体积量，上述醇沉操作中所加乙醇的浓度均为90％，合并沉淀物。一、对比实验：通过单因素实验和正交实验结合来对比优化本发明的拟海龙糖蛋白制备方法最佳工艺条件，确定影响拟海龙糖蛋白提取率的主要因素为：提取时间、提取温度、料液比、醇沉浓度。所述醇沉浓度是指拟海龙糖蛋白混合溶液在浓缩醇沉操作中所加的乙醇的浓度。1.单因素实验即对拟海龙糖蛋白制备过程中的提取时间、提取温度、料液比、醇沉浓度进行单因素实验。①.提取时间对拟海龙糖蛋白提取率的影响称取一定量的经预处理的拟海龙粗粉，脱脂后，在料液比为1:20(g/ml)，温度为90℃固定不变，保持其余提取步骤一致的情况下，研究不同提取时间(1h、1.5h、2h、2.5h、3h)对拟海龙糖蛋白提取率的影响。在上述条件下浸提2次，合并滤液，加3倍体积量的95％乙醇进行醇沉，沉淀物洗涤、溶解后，除游离蛋白，除色素，再透析、冻干，即得拟海龙糖蛋白粉末。实验结果如附图1所示，当提取时间为2-3h时的拟海龙糖蛋白提取率显著高于提取时间为1h和1.5h时的糖蛋白提取量(p<0.05)，因此，在该提取条件中，2-3h为拟海龙糖蛋白提取的最佳时间。②.提取温度对拟海龙糖蛋白提取率的影响称取一定量的经预处理的拟海龙粗粉，脱脂后，在料液比1:20(g/ml)，提取时间为2h固定不变，保持其余提取步骤条件一致，分别研究提取不同提取温度(60℃、70℃、80℃、90℃、100℃)对拟海龙糖蛋白提取率的影响。实验结果如附图2所示，当提取温度为100℃时拟海龙糖蛋白的提取率显著高于提取温度为60、70、80、90℃时的糖蛋白提取率(p<0.05)，因此，在该提取条件中，100℃为拟海龙糖蛋白提取的最佳温度。③.料液比对拟海龙糖蛋白提取率的影响称取一定量的经预处理的拟海龙粗粉，脱脂后，在提取时间为2h，提取温度为90℃的条件下，保持其余提取步骤条件一致，分别研究料液比(g/ml)为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30时对拟海龙糖蛋白提取率的影响。实验结果如附图3所示，当料液比为1:25(g/ml)时拟海龙糖蛋白提取率显著高于料液比为1:10、1:15、1:20、1:30(g/ml)时的提取率(p<0.05)，因此，在该提取条件中，1:25(g/ml)为拟海龙糖蛋白提取的最佳料液比。④.醇沉浓度对拟海龙糖蛋白提取率的影响称取一定量的经预处理的拟海龙粗粉，脱脂后，按料液比为1:20(g/ml)，提取温度90℃，提取时间为2h的条件下，保持其余提取步骤条件一致，分别研究醇沉所用乙醇浓度为75％、80％、85％、90％、95％时对拟海龙糖蛋白提取率的影响。实验结果如附图4所示，当醇沉浓度为85％时拟海龙糖蛋白的提取率显著高于醇沉浓度为75％、80％、90％、95％的提取率(p<0.05)，因此，在该提取条件中，85％乙醇浓度为拟海龙糖蛋白提取最佳醇沉浓度。2.正交实验在单因素实验的基础上，进行正交实验的设计，采用四因素三水平设计优选海龙糖蛋白提取工艺，以提取温度(a)、提取时间(b)、料液比(c)、醇沉浓度(d)为考察因素，以拟海龙糖蛋白得率为指标，分析4个因素的3个水平间相互关系，优化提取条件，选择l9(34)正交表安排拟海龙糖蛋白提取工艺正交实验，设计方案见表1：表1正交实验因素水平表根据正交实验因素水平表1的设计进行正交试验，拟海龙糖蛋白正交试验结果如表2所示：表2正交实验结果表注：在表2中，k1表示各因素在1水平时每次实验提取率的平均值；k2表示各因素在2水平时每次实验提取率的平均值；k3表示各因素在3水平时每次实验提取率的平均值；极差r是指同一因素对应的k1、k2、k3中最大值与最小值之差。由表2可见，极差数据ra>rb>rc>rd，则实验因素的主次顺序为a(提取温度)>b(提取时间)>d(醇沉浓度)>c(料液比)，即四个因素中，提取温度对工艺的影响最大，其次是提取时间、醇沉浓度的影响，料液比的影响最小。正交实验得出最优水平组合为a3b2c1d1，即提取温度100℃，提取时间2.5h，料液比1:20g/ml，醇沉浓度85％为拟海龙糖蛋白制备的最佳工艺条件。综上所述，拟海龙糖蛋白提取率与其影响因素的单因素实验得出最佳提取工艺条件为：提取温度100℃，提取时间3h，醇沉浓度85％，料液比1:25(g/ml)，在该提取条件下通过实验提取拟海龙糖蛋白，最终得出拟海龙糖蛋白提取率为7.59％。正交实验得出最佳提取工艺条件为：提取温度100℃，提取时间2.5h，醇沉浓度85％，料液比1:20(g/ml)，在该提取条件下通过实验提取拟海龙糖蛋白，最终得出拟海龙糖蛋白提取率为11.0％。由此说明，提取温度100℃，提取时间2.5h，醇沉浓度85％，料液比1:20(g/ml)为拟海龙糖蛋白的最佳提取工艺条件，拟海龙糖蛋白提取率为11.0％。二、拟海龙糖蛋白纯度验证实验：通过实验测定验证本发明实施例1所制备的拟海龙糖蛋白纯度。糖蛋白是大分子化合物，其纯度标准不能用通常的小分子化合物纯度标准来衡量，因为即便是糖蛋白纯品，在微观也是不均一的，因此，本发明制备的拟海龙糖蛋白纯度表征方式为：拟海龙糖蛋白纯度＝糖含量+蛋白质含量。①.糖含量测定采用苯酚-硫酸法测定拟海龙糖蛋白的糖含量：精确称量葡萄糖标准品10mg，加蒸馏水溶解，定容至50ml，标准品终浓度为0.2mg/ml；分别精确吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0ml于不同试管中；补加蒸馏水，使每管体积达到2ml；分别精确吸取200μl于2ml离心管中，逐管加入6％苯酚100μl，摇匀后再加入浓硫酸500μl，振荡混匀，室温放置20min；用紫外分光光度计于490nm处测量吸光值，以标准单糖质量和测得的吸光值绘制标准曲线，根据标准曲线建立回归方程，标准曲线及回归方程如附图5所示。精确称取10mg本发明制备的拟海龙糖蛋白，加蒸馏水溶解，定容至10ml，样品终浓度为1mg/ml，精确吸取样品溶液0.1ml，然后按标准曲线制作方法，测定其吸光值，根据测得的吸光值对应标准曲线和回归方程计算糖蛋白样品的糖含量，计算得出拟海龙糖蛋白中的糖含量为3.07％。②.蛋白质含量测定为防止蛋白质测定过程中，部分蛋白质降解造成实验误差，特通过测定氨基酸的方法来测定表征拟海龙糖蛋白中的蛋白质含量，测定方法为：称取20mg拟海龙糖蛋白于水解管中，然后加入18ml浓度为6mol/l的盐酸溶液，充入氮气2min，抽真空封管，置于烤箱内110℃水解24h，水解完成后的水解液放在100℃水浴锅中，使盐酸充分挥发，从而脱去水解液中的酸，用双蒸水洗涤3次，继续蒸发剩余盐酸，然后用蒸馏水定容至5ml，再用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液用氨基酸分析仪进行氨基酸含量测定分析，测定结果如表3所示：表3氨基酸含量检测结果由表3可以看出，本发明制备的拟海龙糖蛋白中的氨基酸含量为88.81％，即拟海龙糖蛋白中的蛋白质含量为88.81％，综上所述，本发明制备的拟海龙糖蛋白纯度＝糖含量+蛋白质含量，即拟海龙糖蛋白纯度为91.88％。三、拟海龙糖蛋白的免疫调节实验：通过实验验证本发明实施例1制得的拟海龙糖蛋白的细胞免疫调节作用，实验方法及结果如下：1.实验对象：小鼠来源单核巨噬细胞白血病细胞(raw264.7细胞)，属于巨噬细胞。2.主要试剂：主要试剂规格生产厂家四唑盐(cck8)500t日本同仁脂糖蛋白(lps)10mg上海源叶生物有限公司一氧化氮测定试剂盒500t上海源叶生物有限公司小鼠tnf-αelisa试剂盒96t深圳欣博盛生物科技有限公司小鼠il-6elisa试剂盒96t深圳欣博盛生物科技有限公司3.细胞的培养和传代raw264.7细胞的培养：用含有10％胎牛血清和1％双抗的deme的完全培养基在具有饱和湿度、含5％(v/v)co2、37℃恒温培养箱中培养；待细胞贴满培养瓶底部时进行传代，用含有0.25％edta的胰酶消化液消化细胞。该细胞贴壁较松，膜酶消化时间不宜过长，在实验中应轻拿轻放。4.拟海龙糖蛋白对raw264.7细胞增殖的影响采用cck8法检测拟海龙糖蛋白对raw264.7细胞活力的影响。取对数生长期raw264.7细胞，血细胞计数器计数，调整细胞悬液浓度至5x104cells/ml，接种至96孔板，每孔100μl，37℃培养24h；弃上清，实验组加入不同浓度(5-600μg/ml)的拟海龙糖蛋白样品溶液，每个浓度设置6个复孔，空白组只有培养液，对照组＝培养液+细胞，37℃培养24h；于24h后每孔加入cck8溶液10μl，继续置于培养箱中培养2-4h；振荡混匀。采用酶标仪检测450nm处的吸光值。实验结果如附图6所示，在5-600μg/ml浓度范围内，拟海龙糖蛋白可以促进raw264.7细胞的增殖，且在5-200μg/ml浓度范围内，随着拟海龙糖蛋白浓度的增加，促进作用更明显，而在400-600μg/ml虽然有促进增殖作用，但促进增殖作用低于200μg/ml，由此得出，拟海龙糖蛋白在200μg/ml增殖作用最明显。5.拟海龙糖蛋白对raw264.7细胞吞噬能力的影响采用中性红吞噬实验检测拟海龙糖蛋白对raw264.7细胞吞噬能力的影响。取对数生长期细胞，血细胞计数器计数，调整细胞悬液浓度至5x104cells/ml，接种至96孔板，每孔100μl，37℃培养24h；弃上清，加入不同浓度(5-400μg/ml)的拟海龙糖蛋白样品溶液，每个浓度设置3个复孔，培养液作为空白对照，2μg/ml的lps溶液作为阳性对照，37℃培养24h，24h后弃上清，每孔加入100μl中性红生理盐水溶液(0.5mg/ml)，继续培养4h，然后弃上清，pbs溶液洗涤3次；每孔加入100μl细胞裂解液(冰乙酸:乙醇＝1:1v/v)，室温孵育过夜，振荡，采用酶标仪检测540nm处吸光值。实验结果如附图7所示，在5-400μg/ml浓度范围内，拟海龙糖蛋白可以促进raw264.7细胞的吞噬能力，且在5-100μg/ml浓度范围内，随着拟海龙糖蛋白浓度的增加，促进作用更明显，而在200-400μg/ml虽然有促进吞噬作用，但促进吞噬作用低于100μg/ml，由此得出，拟海龙糖蛋白在100μg/ml吞噬作用最明显。6.拟海龙糖蛋白对raw264.7细胞分泌no、il-6和tnf-α的影响当糖蛋白作用于raw264.7细胞时，可诱导多种细胞免疫应答反应的发生，通过促进细胞的增殖和产生细胞因子的方式实现免疫调节作用。其中，no是生物体内的活性物质，no的释放量是判断巨噬细胞免疫调节活性是否增强的重要指标；raw264.7细胞受到糖蛋白的刺激，促进分泌细胞因子，如肿瘤坏死因子(tnf)和白细胞介素(il)等，这些因子能在一定程度上调控机体的免疫功能，并在免疫应答反应中发挥重要作用；脂糖蛋白(lps)是革兰氏阴性细菌细胞壁中的主要成分，对宿主具有毒性，具有诱导细胞产生免疫应答反应的作用，常用作免疫调节活性评价的阳性对照。取对数生长期细胞，计数，培养基稀释细胞悬液，调整细胞悬液浓度至5x105cells/ml，接种至24孔板，每孔100μl，37℃培养24h，弃上清，实验组加入不同浓度(10-120μg/ml)的拟海龙糖蛋白样品溶液，每个浓度设置4个复孔，空白组＝培养液+细胞，阳性对照组＝lps溶液(2μg/ml)+培养液+细胞，各组细胞均于37℃培养24h。采用griess试剂检测拟海龙糖蛋白对raw264.7细胞分泌no含量的影响。吸取细胞培养上清液50μl，加入50μlgriess试剂i，再加入50μlgriess试剂ⅱ溶液，振荡混匀，采用酶标仪检测540nm处吸光值，同时将用dmem培养液稀释的系列浓度(1、2、5、10、40、60、100nmol/l)nano2溶液作为标准品，绘制标准曲线，建立回归方程，根据回归方程计算细胞上清液中no的含量。实验结果如附图8所示，拟海龙糖蛋白能显著促进raw264.7细胞分泌no，且呈剂量依赖性，当拟海龙糖蛋白浓度达到120μg/ml时，no的释放量约为空白组的4.2倍。采用elisa试剂盒法检测拟海龙糖蛋白对raw264.7细胞分泌il-6含量的影响。吸取细胞培养上清液100μl，采用il-6elisa试剂按照试剂盒说明书所述检测方法检测细胞上清液中il-6的含量，拟海龙糖蛋白对raw264.7细胞分泌il-6影响的检测结果如附图9所示，拟海龙糖蛋白在浓度低于30μg/ml时，对促进raw264.7细胞分泌il-6的效果不显著，随着拟海龙糖蛋白浓度的增加，促进作用逐渐显著，当拟海龙糖蛋白浓度达到120μg/ml时，il-6的分泌量比空白对照组提高了6.7倍。采用elisa试剂盒法检测拟海龙糖蛋白对raw264.7细胞分泌tnf-α含量的影响。吸取细胞培养上清液100μl，采用tnf-αelisa试剂按照试剂盒说明书所述检测方法检测细胞上清液中tnf-α的含量，拟海龙糖蛋白对raw264.7细胞分泌tnf-α影响的检测结果如附图10所示，与空白对照组相比，拟海龙糖蛋白在10～120μg/ml浓度范围内能显著促进raw264.7细胞分泌tnf-α，且呈剂量依赖关系，当拟海龙糖蛋白浓度达到120μg/ml时，tnf-α的分泌量是空白对照组的27.14倍。综上所述，低剂量的拟海龙糖蛋白即可显著提高raw264.7细胞的增殖、吞噬能力，并显著促进raw264.7细胞分泌no、il-6和tnf-α，从而说明拟海龙糖蛋白具有免疫调节作用，对拟海龙应用于免疫调节药品、保健食品的研发以及拟海龙最大化开发利用具有很大参考价值。本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施例的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施例予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。当前第1页12