用于检测猪捷申病毒的套式PCR引物、方法及试剂盒与流程

本发明属于动物疫病检测技术领域，具体涉及用于检测猪捷申病毒的套式pcr引物、方法及试剂盒。

背景技术：

猪捷申病(porcineteschendisease,ptd)是由小rna病毒科捷申病毒属的猪捷申病毒(porcineteschovirus,ptv)引起的以猪脑脊髓灰质炎、母猪繁殖障碍、肺炎、下痢、心包炎、心肌炎、皮肤损伤及无症状等为主要表现的一种病毒性传染病。该病于1929年首次发现于捷克斯洛伐克的捷申地区，所以又称“捷申病”，各年龄阶段的猪均易感，并具有很高的病死率(90％以上)。猪捷申病主要流行于欧洲，随后流传至北美、非洲、澳大利亚和日本等国。2003年，我国哈尔滨兽医研究所研究人员从内蒙古地区某猪场分离到一株猪捷申病毒，证实我国也有该病毒的存在。目前该病已分布到世界各地，给养猪业带来了巨大损失，已成为世界范围内猪的重要传染病之一，并且该病对我国猪场也存在潜在的影响。

常规的病毒检测技术如病理切片、免疫组化等具有周期长、损伤大、不能一次性确诊等缺点，而聚合酶链式反应(pcr)技术具有快速、灵敏和组织样品需要量小的特点，特别适用于病原监测。而在常规pcr基础上发展起来的套式pcr技术，则具有更高的灵敏性，可大幅提高病原检出率。只需要一台普通pcr仪，即可获得近似实时荧光定量pcr的检测灵敏性。因此，有必要建立对猪捷申病毒套式pcr检测技术，不仅可监测到对捷申病毒的微量潜伏感染，实现对猪捷申病的早期预警，而且对检测仪器设备与人员操作水平要求较低，检测成本也较低，利于在养殖生产一线得到应用和推广。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供用于检测猪捷申病毒的套式pcr引物、方法及试剂盒，该试剂盒检测成本低，对检测仪器以及操作人员的水平要求不高，同时具备较高检测灵敏性与特异性，能够精准的鉴别诊断出捷申病毒的微量潜伏感染，从而尽早实施正确的治疗方案，挽回经济损失。

为此，本发明第一方面提供用于检测猪捷申病毒的套式pcr引物，所述引物根据检测猪捷申病毒的高度保守的特异性序列设计套式pcr引物，其中，检测猪捷申病毒的套式pcr引物中的外引物，由seqidno：1所示的核苷酸序列的正向引物和seqidno：2所示的核苷酸序列的反向引物组成；检测猪捷申病毒的套式pcr引物中的内引物，由seqidno：3所示的核苷酸序列的正向引物和seqidno：4所示的核苷酸序列的反向引物组成。

本发明第二方面提供用于检测猪捷申病毒的套式pcr检测方法，包括以下步骤：

1)从待检样品中提取核酸模板；

2)将如权利要求1所述的套式pcr引物的外引物加入到套式pcr的第一轮反应体系中扩增检测步骤1)所得核酸模板，得第一轮pcr扩增产物。

3)将如权利要求1所述的套式pcr引物的内引物以及上述步骤2扩增所得的第一轮pcr扩增产物加入到套式pcr的第二轮反应体系中扩增检测步骤2)所得第一轮pcr扩增产物，得第二轮扩增产物；

4)第二轮扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。

在本发明一实施例中，所述用于检测猪捷申病毒的套式pcr的第一轮反应体系总体积为25μl，包括：20μm的seqidno：1、seqidno：2所示核苷酸序列各0.375μl，primescript1stepenzymemix1μl，2×1stepbuffer(dyeplus)12.5μl，templaterna3μl，rnasefreedh2o7.375μl。

在本发明一实施例中，所述用于检测猪捷申病毒的套式pcr的第一轮反应条件包括：50℃，30min；94℃预变性5min后进入循环；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；最后72℃延伸5min。

在本发明一实施例中，所述用于检测猪捷申病毒的套式pcr的第二轮反应体系总体积为25μl，包括：20μm的seqidno：3、seqidno：4所示核苷酸序列各0.375μl，extaqversion2.0plusdye12.5μl，第一轮pcr扩增产物2μl，ddh2o9.375μl。

在本发明一实施例中，所述用于检测猪捷申病毒的套式pcr的第二轮反应条件包括：94℃预变性5min后进入循环；94℃变性30sec，59℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；最后72℃终延伸5min。

本发明第三方面提供用于检测猪捷申病毒的套式pcr试剂盒，包括如本发明第一方面所述的用于检测猪捷申病毒的套式pcr引物，还包括第一轮反应试剂、第二轮反应试剂。

在本发明一实施例中，所述的用于检测猪捷申病毒的套式pcr试剂盒的第一轮反应试剂包括：seqidno：1、seqidno：2所示核苷酸序列，primescript1stepenzymemix，2×1stepbuffer(dyeplus)，rnasefreedh2o。

在本发明一实施例中，所述的用于检测猪捷申病毒的套式pcr试剂盒的第一轮反应试剂包括：seqidno：3、seqidno：4所示核苷酸序列，extaqversion2.0plusdye，ddh2o。

在本发明一实施例中，所述的用于检测猪捷申病毒的套式pcr检测试剂盒对猪捷申病毒的最低检出量可低至10copies/μl。

在本发明一实施例中，所述的用于检测猪捷申病毒的套式pcr试剂盒可特异性检测鉴定猪捷申病毒，不能检测出猪蓝耳病病毒(prrsv)、塞内卡谷病毒(svv)、猪丁型冠状病毒(pdcov)、猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪瘟病毒(sfv)中的一种或多种。

本发明第四方面提供如本发明第一方面所述的套式pcr引物、如本发明第二方面所述的套式pcr检测方法或如本发明第三方面所述的套式pcr检测试剂盒在猪捷申病毒检测中的应用，其中，所述检测不以疾病诊断治疗为目的。

本发明的有益效果在于：本发明提供的试剂盒具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的特点，比常规pcr方法具有更高的灵敏度和特异性，大幅提高病毒微量感染时对猪捷申病毒的检出率，而对设备和人员技能要求较低，因此，适用于对猪捷申病毒微量隐性感染时期的监测和早期预警，利于在养殖企业中得到应用和推广。

附图说明

图1为本发明实施例提供的猪捷申病毒的套式rt-pcr外围引物筛选电泳图，其中，泳道m为dnamarkerdl2000，泳道1～3分别代表第一组外引物ptv-1-f1/r1、第二组外引物ptv-2-f1/r1、第三组外引物ptv-1-f3/r3；

图2为本发明实施例提供的猪捷申病毒的套式rt-pcr内引物筛选电泳图，其中，泳道m为dnamarkerdl1000，泳道1～3分别代表第一组内引物ptv-1-f2/r2、第二组内引物ptv-2-f2/r2、第三组内引物ptv-3-f2/r2；

图3为本发明实施例提供的猪捷申病毒的套式rt-pcr外引物浓度优化电泳图，其中，泳道m为dnamarkerdl1000，泳道1～6分别代表0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μm的扩增电泳图；

图4为本发明实施例提供的猪捷申病毒的套式rt-pcr内引物浓度优化电泳图，其中，泳道m为dnamarkerdl1000，泳道1～6分别代表0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μm的扩增电泳图；

图5为本发明实施例提供的猪捷申病毒的套式rt-pcr外引物温度优化电泳图，其中，泳道m为dnamarkerdl1000，泳道1～5分别代表53℃、55℃、57℃、59℃、61℃的扩增电泳图；

图6为本发明实施例提供的猪捷申病毒的套式rt-pcr内引物温度优化电泳图，其中，泳道m为dnamarkerdl1000，泳道1～5分别代表55℃、57℃、59℃、61℃、63℃的扩增电泳图；

图7为本发明实施例提供的猪捷申病毒的套式rt-pcr的灵敏度检测电泳图，第一轮外引物一步法rt-pcr和第二轮内引物pcr灵敏度结果分析图：其中，泳道ma为dnamarkerdl1000、mb为dnamarkerdl1000；泳道1a/1b、2a/2b、3a/3b、4a/4b、5a/5b、6a/6b、7a/7b、8a/8b、9a/9b、10a/10b分别代表10⁸copies/μl、10⁷copies/μl、10⁶copies/μl、10⁵copies/μl、10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10¹copies/μl、10⁰copies/μl和阴性对照的反应产物的一步法rt-pcr和套式pcr电泳结果图；

图8为本发明实施例提供的猪捷申病毒的套式rt-pcr的特异性检测电泳图，第一轮外引物一步法rt-pcr和第二轮内引物套式pcr特异性结果分析图：其中泳道ma、mb为dnamarkerdl1000；泳道1a/1b、2a/2b、3a/3b、4a/4b、5a/5b、6a/6b、7a/7b分别代表猪蓝耳病病毒(prrsv)、塞内卡谷病毒(svv)、猪丁型冠状病毒(pdcov)、猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪瘟病毒(sfv)和阴性对照的一步法rt-pcr和套式pcr电泳结果图；

图9为本发明实施例提供的猪捷申病毒的套式rt-pcr的临床样品检测电泳图，其中，泳道m为dnamarkerdl1000、泳道1-20为检测样品。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。

本发明实施例中提及的试剂：primerscript1stepenzymemix、2×1stepbuffer、rnasefreedh2o、takarataq、dntpmixture、10×pcrbuffer(mg2++plus)均购自takara生物科技有限公司，货号lmp204。

实施例1

1.检测猪捷申病毒的套式pcr引物设计与合成

检测猪捷申病毒的套式pcr引物设计

根据参考比对genbank中猪捷申病毒ptv基因序列(accession:gq914053.2、accession:kc667562.1、accession:jq429405.、accession:kc667563.1、accession:jq664746.1、accession:mf170941.1、accession:mf170923.1、accession:kc667563.1、accession:kc667562.1)，首先利用megalign软件进行序列比对，选择位于全基因序列中的保守基因片段5'区域作为引物设计区域，确定该核甘酸序列中的保守片段作为扩增区域，然后再利用引物辅助设计软件primer5根据确定的保守核甘酸序列设计出了三组检测ptv基因的套式rt-pcr引物组：包括正向引物ptv-x-f1、反向引物ptv-x-r1组成的外引物以及正向引物ptv-x-f2、反向引物ptv-x-r2组成的内引物(x为1、2或3，分别代表第一组、第二组、第三组引物组)，由北京擎科生物科技有限公司广州分公司合成，具体序列见表1：

表1用于检测猪捷申病毒的套式pcr的特异性引物

2核酸提取

取猪小肠组织及其内容物约45mg，用核酸提取试剂盒提取总rna作为扩增模板。

3套式pcr扩增

用步骤2所得rna模板，进行套式pcr扩增，反应条件如下：

第一轮反应总体积25μl体系，其中，primescript1stepenzymemix1μl，2×1stepbuffer(dyeplus)12.5μl,上游primer(20μm)、下游primer(20μm)各0.5μl，rna模板3μl，rnasefreedh2o7.5μl；

第一轮反应条件为：50℃30min；94℃预变性5min；94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸30sec；35cycles，最后72℃延伸5min；

第二轮反应总体积25μl体系，其中，extaqversion2.0plusdye12.5μl，上游primer(20μm)、下游primer(20μm)各0.5μl,ddh2o9.5μl，第一轮pcr扩增产物2μl。

第二轮的反应条件为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸30sec，35cycles；最后72℃终延伸5min。

4套式pcr扩增产物的鉴定

将套式pcr反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果，同时将套式pcr鉴定阳性的核酸送华大基因有限公司测序，验证套式pcr检测的准确性。

5体系优化

5.1最佳引物筛选

将步骤1设计所得三组套式pcr引物组以及步骤所得rna模板按步骤3反应条件进行套式pcr扩增，筛选最佳引物，根据扩增的产物量及其特异性等条件，第一轮一步法rt-cr，第一组外引物扩增效果最好，如图1所示，第二轮pcr，第一组内引物扩增效果最好，如图2所示，第一组套式pcr引物组扩增效果最好，后续将以此引物组作为猪捷申病毒的套式pcr检测的优势引物组合开展下一步实验。

5.2引物浓度优化

通过单一变量，改变第一轮、第二轮引物浓度的用量，筛选最优引物浓度，结果显示，第一轮25μl反应体系中当引物的使用终浓度均为0.3μm时，扩增效果最好，目标条带最亮，如图3所示。第二轮25μl反应体系中当引物的使用终浓度均为0.3μm时，扩增效果最好，目标条带最亮，如图4所示。

5.3退火温度的优化

通过改变第一轮、第二轮退火温度，筛选最优退火温度，结果显示，第一轮反应中，当退火温度为57℃，扩增产物条带最清晰，背景没有非特异扩增，如图5所示。第二轮反应中，当退火温度为59℃，扩增产物条带最清晰，背景没有非特异扩增，如图6所示。

6试剂盒性能

6.1灵敏度检测

取1.0×10⁸copies/μl的猪捷申病毒阳性质粒为模板作10倍梯度稀释，得到10-10⁸拷贝/μl的梯度模板，用本发明试剂盒检测，测试本发明试剂盒检测灵敏度，同时利用本发明试剂盒提供的第一轮反应体系作为常规pcr方法对照，结果如图7所示，常规pcr方法对照只能检测到10⁴copies/μl，而本发明的套式pcr试剂盒在dna模板浓度为10copies/μl时仍有明亮的条带，可见，本发明的套式pcr试剂盒的检测灵敏度是常规pcr方法的1000倍。

6.2特异性检测

利用本发明试剂盒对捷申病毒阳性样品dna模板进行扩增，凝胶电泳结果获得了明亮的目的条带，而对其他样品如猪蓝耳病病毒、塞内卡谷病毒、猪丁型冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒的dna模板和无dna酶水均未出现扩增条带，如图8所示。实验结果表明，本发明试剂盒具有良好的病原特异性。

6.3临床样品检测

运用本发明的套式pcr检测试剂盒对华南地区的部分猪场猪只进行检测，同时以常规pcr检测方法作为对照，结果如图9所示，常规pcr检测方法只能检出1份阳性样品，而本发明的套式pcr检测试剂盒以及荧光定量pcr检测方法均可从20份样品中检测出3份阳性，将阳性扩增的pcr产物送华大基因公司进行测序，测序结果显示6份阳性样品的扩增产物的序列均存在与目标猪捷申病毒(ptv)相同的基因序列。可见，本发明的试剂盒检测能特异检测猪捷申病毒，并且其检测灵敏度比常规pcr高，可对猪捷申病毒进行有效扩增，显示本发明试剂盒在复杂样品检测中仍能保持良好的病原特异性。

综上所述，本发明的套式pcr检测试剂盒具备较高的检测灵敏度以及特异性，同时本发明提供的检测试剂盒对设备和人员技能要求较低，适用于对猪捷申病毒微量隐性感染时期的监测和早期预警，利于在养殖企业中得到应用和推广，可大幅增加猪捷申病毒微量感染情况下的病原检出率，能够精准的鉴别诊断出猪感染的病因，有利于对症下药实施正确的治疗方案，具有很好的应用前景。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110>华南农业大学

<120>用于检测猪捷申病毒的套式pcr引物、方法及试剂盒

<160>12

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<213>人工序列(artificialsequence)

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