一种中型无绿藻分子生物学鉴定方法及应用与流程

本发明属于微生物基因型鉴定技术领域，尤其涉及一种中型无绿藻分子生物学鉴定方法及应用。

背景技术：

奶牛中型无绿藻性乳房炎是近年来在世界范围内引起广泛关注的一种奶牛乳房炎，病原是一种单细胞的、没有叶绿素的类酵母样真菌。临床上，乳房炎患牛产奶量下降，体细胞数量明显增加，血凝块异常分泌，偶尔可见乳腺肿块和硬块，治愈困难。近年来，该病在世界范围内有不断增长和蔓延的趋势，巴西、日本和德国的中型无绿藻一直被考虑为乳房炎最重要的病原之一。

根据18srdna的序列分析，中型无绿藻被分为两个亚型：基因1型和基因2型。最初，大多数研究人员通过免疫学(jensenetal1998,roesleretal2001)、显微镜检查(buzzinietal2004,hanaaetal2010)和分子生物学方法(roesleretal2006,etal2007)分析鉴定中型无绿藻，以判断疾病的病原类型，从而针对性治疗。但这些方法存在准确性不够、耗时和适用性较差等问题，特别是针对基因1型和基因2型的区别性鉴定，现有技术很难快速、准确地将两种基因型区别开来。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种中型无绿藻分子生物学鉴定方法及应用，旨在利用分子生物学方法进行中型无绿藻鉴定及基因分型，以进一步调查该病原在我地区的感染情况，并进行防控措施的研究。

本发明是这样实现的，一种中型无绿藻分子生物学鉴定方法，包括以下步骤：

s1：根据目标cob基因序列设计引物，其中，针对中型无绿藻基因1型cob基因序列的正、反向引物序列分别见seqidno:9和seqidno:10；针对中型无绿藻基因2型cob基因序列的正、反向引物序列分别见seqidno:7和seqidno:8；

s2：提取待测dna模板；

s3：利用步骤s1中设计的引物及步骤s2中获取的dna模板进行pcr反应，并根据电泳结果判断基因型。

进一步，步骤s3中，pcr体系为：10μm的上游引物1μl，10μm的下游引物1μl，extaqdna聚合酶0.2μl，10×buffer缓冲液2.5μl，dntp2μl，dna模板1μl，加ddh2o定容至25μl。

进一步，步骤s3中，pcr程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，基因1型56℃退火30s、基因2型58℃退火30s，72℃延伸30s循环30次；72℃终延伸5min。

进一步，在步骤s3后面增加针对cytb基因的cytbpcr及cytbpcr-rflp实验验证步骤。

进一步，所述cytbpcr反应使用的正反向引物序列分别见seqidno:5和seqidno:6。

进一步，所述cytbpcr反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s循环30次；72℃终延伸5min。

进一步，所述cytbpcr-rflp反应体系为：10u的taiⅰ酶1μl，10×bufferr2μl，cytbpcr过程回收的dna片段1μl，加ddh2o定容至20μl。

进一步，所述cytbpcr-rflp反应程序为65℃，反应1h。

一种中型无绿藻分子生物学鉴定方法在中型无绿藻鉴定中的应用。

进一步，所述应用具体为对中型无绿藻基因1型和2型的鉴定。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

随着该研究领域的发展，许多研究者不断设计出新的鉴定方法以解决弊端，从而为鉴定中型无绿藻提供了多种新的选择(bergenetal2009,morandietal2016)。2018年，有来自波兰的研究学者通过cytb基因中某一区段的物种特异性多态性，开发了一种快速、简便的pcr-rflp分析方法，用于鉴定和分化所有无绿藻属物种(jagielskietal2018)。本研究参考该方法后发现单独使用taiⅰ限制性核酸内切酶对中型无绿藻进行分类也是可行的，随后我们将该方法进行了改进。与双重酶切相比，改进后的方法可以节省一些时间，精力和成本，具体表现为：相对于双酶切，单酶切可以节约时间1h左右，单个样品节约成本10-15元。cob基因是线粒体上的一个重要基因，与线粒体的呼吸代谢密切相关。在本研究中，我们对中型无绿藻基因1和2型cob基因序列的差异进行分析，设计了基因型特异性pcr。其鉴定结果与18srrna、pcr-rflp等鉴定结果一致，充分验证了cob基因型特异性pcr可直接用于中型无绿藻的基因分型，为后续研究者鉴定中型无绿藻提供一定的参考。

附图说明

图1是本发明技术路线流程图；

图2是18srrnapcr结果；

图3是cob基因型特异性pcr结果；

图4是cytbpcr结果；

图5是cytbpcr-rflp结果；

图6是分离株18srrnapcr结果；

图7是分离株cob基因型特异性pcr结果；

图8是分离株cytbpcr结果；

图9是分离株cytbpcr-rflp结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种中型无绿藻分子生物学鉴定方法及应用，具体如下各实施例所示。

实施例1鉴定方法

s1：根据基因序列设计pcr引物。

在genbank中检索中型无绿藻基因1型、2型标准菌株的18srrna及cob基因序列，基因1型、2型标准菌株的18srrna分别见seqidno:1和seqidno:2，cob基因序列分别见seqidno:3和seqidno:4。

使用primer5软件设计出pcr引物见表1，及cytb引物参考相关文献(jagielskietal2018)，中型无绿藻不同基因型的分子分化信息见表2。

表1pcr引物信息

简并引物:y,c或t；h,a,c,或t；r,a或g；w,a或t

表2中型无绿藻的分子分化

s2：获取dna模板。申请人从北京北纳创联生物技术研究院购买两种基因型的中型无绿藻标准菌株，并按照提供的培养方式培养菌液，使用omegafungaldnakit试剂盒提取dna模板。

s3：pcr反应。利用步骤s1中设计的引物及步骤s2中获取的dna模板进行pcr反应，反应体系及程序如下：

pcr反应体系

18srrnapcr反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s循环30次；72℃终延伸5min。设特异性对照一组，阴性对照一组。pcr反应产物在1％琼脂糖凝胶中电泳(120v，30min)，电泳结束后进行凝胶成像分析。

cob基因型特异性pcr反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，基因1型56℃退火30s、基因2型58℃退火30s，72℃延伸30s循环30次；72℃终延伸5min。设特异性对照一组，阴性对照一组。pcr反应产物在1％琼脂糖凝胶中电泳(120v，30min)，电泳结束后进行凝胶成像分析。

cytbpcr反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s循环30次；72℃终延伸5min。设特异性对照一组，阴性对照一组。pcr反应产物在1％琼脂糖凝胶中电泳(120v，30min)，电泳结束后进行凝胶成像分析。随后将扩增成功的目的片段置于紫外透照台上，切下含目的片段的胶块。用琼脂糖试剂盒纯化回收目的片段dna，回收方法参考说明书：

1.柱平衡步骤：将吸附柱ca1放入收集管中，并向吸附柱中加入500μl平衡液bl，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2.将单一的目的dna条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

3.向胶块中加入等倍体积溶胶液pn。50℃水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

4.将上一步所得溶液加入到吸附柱ca1中，室温放置2min，12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

5.向吸附柱ca1中加入600μl漂洗液pw，静置2-5min，12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

6.重复操作步骤5。

7.将离心吸附柱ca1放回收集管中，12,000rpm离心2min，除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底地晾干。

8.将吸附柱ca1放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量ddh2o，室温放置2min。12,000rpm离心2min收集dna溶液。-20℃保存备用。

cytbpcr-rflp反应体系见下表，该体系中所用dna为cytbpcr过程回收的dna片段。

cytbpcr-rflp反应体系

cytbpcr-rflp反应程序：65℃，反应1h。反应产物在4％琼脂糖凝胶中电泳(120v，30min)，电泳结束后进行凝胶成像分析。

实施例2鉴定结果

1、18srrnapcr结果见图2，泳道1和2：中型无绿藻基因1型18srrna基因质粒，泳道3和4：中型无绿藻基因2型菌株，泳道5：大肠杆菌，泳道6：阴性对照。m：dl2000markers。

结果显示，中型无绿藻基因1型18srrna基因质粒及中型无绿藻基因2型菌株均成功扩增目的片段(1549bp)，将成功扩增的pcr产物测序后进行ncbiblast同源性分析。

2、中型无绿藻基因1型特异性pcr结果见图3，泳道1和2：中型无绿藻基因1型cob基因质粒；泳道3和4：中型无绿藻基因2型菌株；泳道5：大肠杆菌；泳道6：阴性对照。m：dl1000markers。图3中a为使用针对中型无绿藻基因1型cob基因设计的引物进行pcr的电泳结果，b为使用针对中型无绿藻基因2型cob基因设计的引物进行pcr的电泳结果。

由图3中a图可知，中型无绿藻基因1型cob基因质粒成功扩增目的片段(361bp)，而中型无绿藻基因2型菌株未扩增出目的片段。

由图3中b图可知，中型无绿藻基因1型cob基因质粒未扩增出目的片段，而中型无绿藻基因2型菌株成功扩增目的片段(361bp)。

3、cytbpcr结果见图4，泳道1和2：中型无绿藻基因1型cytb基因质粒；泳道3和4：中型无绿藻基因2型菌株；泳道5：大肠杆菌；泳道6：阴性对照。m：dl1000markers。

中型无绿藻基因1型cytb基因质粒及中型无绿藻基因2型菌株均成功扩增目的片段(644bp)。

4、cytbpcr-rflp结果见图5，泳道1：中型无绿藻基因1型cytb目的片段；泳道2：中型无绿藻基因2型cytb目的片段。m：dl500markers。

结果显示，经纯化回收的中型无绿藻基因1型cytbpcr目的片段经taiⅰ酶切后呈50、300和350bp大小的片段分化，经纯化回收的中型无绿藻基因2型cytbpcr目的片段经taiⅰ酶切后呈50、200和450bp大小的片段分化。上述结果表明，本实验建立的分子生物学方法可成功用于中型无绿藻的鉴定。

实施例3应用

本研究成功从1096份乳样中分离出49份阳性样品(4.5％)，从某中型无绿藻阳性奶牛场90份环境样品中分离出20份阳性样品(22.2％)。按照实施例1的鉴定方法进行实验。

1、部分样品的18srrnapcr结果见图6，泳道1-16：所有分离株18srrnapcr成功扩增目的片段1549bp(仅显示8株分离株，各设平行对照1组)，泳道17：阴性对照。m：dl2000markers。

所有分离株成功扩增目的片段(1549bp)，将所有分离株pcr产物测序后进行ncbiblast同源性分析，结果所有分离株与中型无绿藻基因2型有99％以上的同源性。

2、cob基因型特异性pcr结果见图7，a为使用针对中型无绿藻基因1型cob基因设计的引物进行pcr的电泳结果，b为使用针对中型无绿藻基因2型cob基因设计的引物进行pcr的电泳结果。泳道1-8：所有分离株中型无绿藻基因2型特异性pcr成功扩增目的片段361bp(仅显示8株分离株)，泳道9：阴性对照。m：dl1000markers。

结果显示，所有分离株中型无绿藻基因1型特异性pcr未扩增出目的片段,而中型无绿藻基因2型特异性pcr成功扩增目的片段(361bp)。

3、cytbpcr结果见图8，泳道1-16：所有分离株cytbpcr成功扩增目的片段644bp(仅显示8株分离株，各设平行对照1组)，泳道17：阴性对照。m：dl1000markers。

结果显示，所有分离株成功扩增目的片段(644bp)。

4、cytbpcr-rflp结果见图9，泳道1-8：所有分离株cytbpcr-rflp结果呈50、200和450bp大小的片段分化(仅显示8株分离株)。m：dl500markers。

结果显示，所有分离株目的片段经taiⅰ酶切后呈50、200和450bp大小的片段分化。上

述结果表明，中型无绿藻阳性乳样及环境中的分离株均被鉴定为基因2型。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>武汉市农业科学院

<120>一种中型无绿藻分子生物学鉴定方法及应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1551

<212>dna

<213>中型无绿藻基因1型18srrna(medium-sizednon-greenalgae)

<400>1

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<213>中型无绿藻基因2型18srrna(medium-sizednon-greenalgae)

<400>2

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<210>3

<211>1158

<212>dna

<213>中型无绿藻基因1型cob基因序列(medium-sizednon-greenalgae)

<400>3

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<210>4

<211>1158

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<213>中型无绿藻基因2型cob基因序列(medium-sizednon-greenalgae)

<400>4

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cctgcgaaccctatgtcaactccagcacatattgtaccagaatggtatttcttatgggta840

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<210>5

<211>27

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<213>人工序列(18srrna-f)

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<213>人工序列(18srrna-r)

<400>6

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<213>人工序列(2021cob-f)

<400>7

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<213>人工序列(2021cob-r)

<400>8

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<210>9

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(2063cob-f)

<400>9

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<210>10

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(2063cob-r)

<400>10

tgcagctacacctgctaatttatttgga28

<210>11

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(cytb-f)

<400>11

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<210>12

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(cytb-r)

<400>12

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