一种猪肌组织发育相关基因MYH7的表达检测方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪肌组织发育相关基因myh7的表达检测方法。

背景技术：

我国是一个猪肉生产和消费大国，猪肉长期占肉类消费的65％以上，是我国居民主要的动物蛋白来源。近几年，人们对生活水平、膳食结构以及对健康状况的认识普遍提高，对猪肉品质的各个方面提出了更高的要求，因此改善猪肉品质成为当前育种工作人员急需解决的关键问题。

猪肉品质的评价指标主要有肉色、嫩度、ph值、系水力、肉质风味、肌内脂肪含量和氨基酸含量等，这些指标共同影响猪肉质品质。研究表明肌纤维直径和密度是影响猪肉嫩度的重要指标，肌束内肌纤维直径越小、密度越大，肉质也相应的越嫩。

肌球蛋白是一种马达蛋白，具有酶活性，末端含有水解atp的磷酸基团，也能水解gtp、ctp等，可将化学能转变为机械能。每种肌球蛋白由两条重链和四条轻链组成。其中重链包括两部分：头部区域和尾部区域。头部区域与肌球蛋白相互作用，长尾区域与其他蛋白相互作用，包括其他肌球蛋白的尾部区域。肌球蛋白重链(myosinheavychain，myhc)由多基因家族编码，在哺乳动物中，至少有十多种不同的肌球蛋白重链。关于肌球蛋白重链基因的研究，大多集中在分离克隆、结构、表达规律以及功能分析。低氧及低氧训练使得肌球蛋白重链基因表达由慢型向快型转化。家族性肥厚型心肌病(familyhypertrophiccardiomyopathy，fhcm)是由myh7基因从头突变p.gly716arg导致，为恶性突变。而三维斑点追踪技术可以敏感的发现由myh7基因突变所导致的fhcm患者的左室早期局部收缩功能的损害等。在肌细胞的正常运作中，myhc作为肌球蛋白的基本组成单位，发挥了不可或缺的重要作用。研究表明，myhcmrna的组成比例可以作为分析肌肉纤维类型的科学指标，并提出育肥后期中对猪肌肉纤维类型组成具有调控。张增荣等使用qpcr技术，研究鸡不同生长发育阶段和组织中myh7基因的表达差异，比较分析后推测该基因在肌肉的生长发育中其重要的调节作用。

因此，寻找一种可对猪肉肌纤维进行可靠精准的定量测定方法，从而能够大大提高猪肉品质形状，则将非常具有实际意义。

技术实现要素：

为了达到上述目的，本发明提供一种猪肌组织发育相关基因myh7的表达检测方法。

本发明的技术方案为：一种猪肌组织发育相关基因myh7的表达检测方法，包括引物设计与合成、rna的提取、cdna的合成、实时荧光定量pcr反应、pcr产物的鉴定，所述引物设计与合成以18s为内参基因，根据ncbigenebank中猪myh7、18s基因的mrna序列进行同源性比对设计合成，其中，所述myh7包括myh7-1、myh7-2、myh7-3，所述myh7-1基因引物序列为f：5＇-tgccaaactcactccttcct-3＇r:5＇-tgtaggccttgaccttcagc-3＇；所述myh7-2基因引物序列为f：5＇-accctggagctctcctccta-3＇r:5＇-tctgcatcagccagattgtc-3＇；所述myh7-3基因引物序列为f：5＇-agacctgtcccagcttcaga-3＇r:5＇-tgctccttcttcagctcctc-3＇；所述18s基因引物序列为f：5＇-cccacggaatcgagaaagag-3＇r:5＇-ttgacggaagggcacca-3＇。

进一步地，所述rna的提取包括以下步骤：

(1)从液氮中取冷冻保存的组织，立即放入用冷氮预冷过的研钵中研磨至粉末状，转移到离心管中，加入适量trizol，置于15℃～30℃约15min，使细胞完全裂解；

(2)确保完全裂解后加入200μl氯仿溶液，经漩涡仪振荡，室温下静置15min；

(3)以12000rpm4℃离心15min，液体分层，取上清液至离心管中，加等量异丙醇，上下颠倒混匀，-70℃沉淀过夜；

(4)再次以12000rpm4℃离心15min，弃去上清后加75％的乙醇洗涤rna；

(5)7500rpm4℃离心5min，重复2次；

(6)自然晾干，加30μldepc水溶解沉淀；

(7)用核算蛋白测定仪测定rna的浓度及od值；

(8)取5μlrna70℃水浴30min，1％的琼脂糖凝胶电泳对rna的稳定性和完整性进行检测。

进一步地，所述cdna的合成包括以下步骤：

(1)去除基因组dna：取500ng所述rna、2.0μl5×gdnaeraserbutter、1.0μlgdnaeraser，补充rnasefreedh2o至总体积至10.0μl，构建基因组去除反应体系，所述基因组去除反应体系的反应条件为42℃2min，4℃5min；

(2)反转录反应：在冰上进行反转录混合液的配置，取10.0μl步骤(1)的反应液、4.0μl5×primerscriptbutter2、1.0μlprimerscriptrtenzymemix、1.0μlrtprimermix，补充rnasefreedh2o至总体积至20.0μl，构建反转录反应体系，所述反转录反应体系的反应条件为37℃15min，85℃5sec。

进一步地，所述实时荧光定量pcr反应包括：以合成cdna的第一链为模板，进行pcr扩增反应，所述pcr扩增反应体系包括：7.5μlsybrpremixextaqtmⅱ、0.3μlrox、1.5μlcdna、1.0μlprimer、4.7μlddh2o。

更进一步地，所述pcr扩增反应条件分为以下三个阶段：

s1：预变性阶段，95℃30sec；

s2：循环阶段，95℃30sec，60℃30sec，设定循环数为40；

s2：溶解阶段，95℃15sec，,60℃1min，95℃15sec。

进一步地，所述pcr产物的鉴定包括以下步骤：

(1)称取1g琼脂糖加98ml蒸馏水于锥形瓶中，配制1％的琼脂糖凝胶，冷却至不烫手；

(2)选择适当大小的的电泳槽和梳子摆放正确后，倒入配置好的琼脂糖凝胶液，制成一定厚度的凝胶；

(3)凝胶凝固后，拔掉梳子，小心地将其放入电泳槽内，倒入适量tae电泳缓冲液，以刚浸没胶面为宜；

(4)取6μl样品与1μl上样缓冲液混合后点样，同时取3μlmaker作对照；

(5)通电，110v电压下进行恒压电泳；

(6)待30min后，紫外光照射下进行观察，并用凝胶成像系统检测pcr电泳结果，拍照记录。

进一步地，所述检测方法还包括数据处理与分析，用于将pcr产物鉴定的结果由7500realtimepcrsystem导出，并根据导出的ct值计算目的基因的相对表达量。

更进一步地，所述目的基因的相对表达量采用2-△△ct，其中，△△ct＝(ct实验组目的基因-实验组内参基因)-(ct对照组目的基因-对照组内参基因)。

本发明还提供了一种猪肌组织发育相关基因myh7的表达检测方法的应用，所述表达检测方法能够用于制作检测猪肌肉品质的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1中所述的myh7-1、myh7-2、myh7-3、18s的基因引物序列。

本发明的有益效果为：

本发明利用qpcr技术检测myh7基因三个转录本在两个品种不同生长发育阶段和三种肌肉组织中的表达变化，对该基因在两个品种中的时序性表达变化趋势以及组织差异进行分析，结果表明本发明采用这种方法可以准确可靠的检测出不同品种猪的不同部位肌肉纤维的品质，可用于在养殖过程中根据不同品种猪的肌肉发育进行分子调控的理论指导，给瘦肉型猪品种选育提供了可行性参考。

附图说明

图1是本发明rna样品的电泳结果；

图2是本发明的扩增产物电泳图；

图3a是本发明myh7-1的扩增曲线图；

图3b是本发明myh7-2的扩增曲线图；

图3c是本发明myh7-3的扩增曲线图；

图4a是本发明myh7-1的熔解曲线图；

图4b是本发明myh7-2的熔解曲线图；

图4c是本发明myh7-3的熔解曲线图；

图5是本发明myh7-1在大白猪和山西黑猪肌组织中的的时序性表达检测结果；其中，a表示背最长肌；b表示腰大肌；c表示股二头肌；图中所出现的小写字母表示0.05水平，大写字母表示0.01水平；

图6是本发明myh7-1基因在大白猪和山西黑猪肌组织间的差异表达检测结果；其中，bj表示背最长肌；yj表示腰大肌；gj表示股二头肌；

图7是本发明myh7-2在大白猪和山西黑猪肌组织中的的时序性表达检测结果；其中，a表示背最长肌；b表示腰大肌；c表示股二头肌；

图8是本发明myh7-2基因在大白猪和山西黑猪肌组织间的差异表达检测结果；其中，bj表示背最长肌；yj表示腰大肌；gj表示股二头肌；

图9是本发明myh7-3在大白猪和山西黑猪肌组织中的的时序性表达检测结果；其中，a表示背最长肌；b表示腰大肌；c表示股二头肌；

图10是本发明myh7-3在大白猪和黑猪肌组织间的的差异表达结果图；其中，bj表示背最长肌；yj表示腰大肌；gj表示股二头肌；

具体实施方式

(一)试验材料、仪器和试剂

1.1试验材料

本实施例以大白猪和山西黑猪为研究对象，实验猪群饲养于山西省乡宁县永新康生态养殖有限公司。选择两个品种同日出生的仔猪各10头(公母各半)组建试验猪群，统一饲养。分别在仔猪25日龄、70日龄、150日龄各屠宰两头(一公一母)，将背最长肌、腰肌、股二头肌的肌肉组织，切成直径约2.5mm大小后，用铝箔进行包裹并放入液氮中保存。

1.2.主要仪器

实时荧光定量pcr仪(美国，ab,ab17500)

高速冷冻离心机(德国，eppendorf,centrifuge5415r)

核算蛋白测定仪(美国，nanodrop,nd—1000)

电泳仪(美国，ab,dyy-3)

高压蒸汽灭菌锅(日本，sanyo,mls-3020)

超低温冰箱(美国，thermo,forma700)

漩涡仪(江苏海门ql-901)

1.3主要试剂

rna酶固相清除剂、primerscripttmrt-pcrregentkit(takapa公司)、reagent(美国invitrogen)、sybrpremixextaqtmⅱkit(takapa公司)等一些常规试剂。

(二)试验方法

2.1引物设计与合成

本试验以18s为内参基因，根据ncbigenebank中猪myh7-1、myh7-2、myh7-3、18s基因的mrna序列进行同源性比对，通过primer5以及oligo软件设计引物，还需委托上海生物工程有限公司合成引物。其中基因的引物序列及产物长度见表1.

表1基因的引物序列及产物长度

2.2rna的提取

rnase在生物体内广泛存在，而其活性又很难被抑制，因此在提取rna之前要注意：清洗手术刀、镊子、手术剪后需用锡箔纸包裹，108℃烘烤4h，冷却待用；离心管、枪头等不耐高温，需1000倍稀释过的rnaase固相清除剂浸泡10分钟后，进行高压灭菌。而提取的过程中一定要注意无菌操作，严格遵照trizol试剂说明进行操作，就过程如下：

(1)从液氮中取冷冻保存的组织，立即放入用冷氮预冷过的研钵中研磨至粉末状，转移到离心管中，加入适量trizol，置于15℃～30℃约15min，使细胞完全裂解；

(2)确保完全裂解后加入200μl氯仿溶液，经漩涡仪振荡，室温下静置15min；

(3)以12000rpm4℃离心15min，液体分层，取上清液至离心管中，加等量异丙醇，上下颠倒混匀，-70℃沉淀过夜；

(4)再次以12000rpm4℃离心15min，弃去上清后加75％的乙醇洗涤rna；

(5)7500rpm4℃离心5min，重复2次；

(6)自然晾干，加30μldepc水溶解沉淀；

(7)用核算蛋白测定仪测定rna的浓度及od值；

(8)取5μlrna70℃水浴30min，1％的琼脂糖凝胶电泳对rna的稳定性和完整性进行检测。

2.3cdna的合成

遵照相关试剂说明书规定的进行操作，就过程如下：

(1)去除基因组dna

设计总反应体系为10μl，所需rna的体积为500ng，然后用rnasefreedh2o补齐剩余差量。具体如表，反应条件：42℃2min，4℃5min。其中，基因组去除反应体系如表2所示。

表2基因组去除反应体系

(2)反转录反应

在冰上进行反转录混合液的配置，反应总体积20μl，具体如表。其次，为了保证反应的准确性，应先配置反应混合液在进行分装。反应条件：37℃15min，85℃5sec。其中，反转录反应体系如表3所示。

表3反转录反应体系

2.4实时荧光定量pcr反应

(1)反应体系及反应条件的优化

依照所需试剂规定的反应体系及反应条件进行反转录，合成cdna第一链，并以此为模板进行pcr扩增，模条件确定引物合适的退火温度后，qrt-pcr检测不同引物的溶解曲线、扩增曲线及扩增效率。其中，荧光定量pcr反应体系如表4所示。

表4荧光定量pcr反应体系

(2)荧光定量反应

qrt-pcr主要分为三个阶段：首先是预变性阶段，95℃30sec；其次是循环阶段，95℃30sec，60℃30sec，设定循环数为40；最后为溶解阶段，95℃15sec，,60℃1min，95℃15sec。荧光定量检测完成后，查看相应的熔解曲线、扩增曲线以及ct值是否符合要求。

2.5pcr产物的鉴定

采用琼脂糖凝胶电泳法，操作步骤如下：

(1)称取1g琼脂糖加98ml蒸馏水于锥形瓶中，配制1％的琼脂糖凝胶，冷却至不烫手；

(2)选择适当大小的的电泳槽和梳子摆放正确后，倒入配置好的琼脂糖凝胶液，制成一定厚度的凝胶；

(3)凝胶凝固后，拔掉梳子，小心地将其放入电泳槽内，倒入适量tae电泳缓冲液，以刚浸没胶面为宜；

(4)取6μl样品与1μl上样缓冲液混合后点样，同时取3μlmaker作对照；

(5)通电，110v电压下进行恒压电泳；

(6)待30min后，紫外光照射下进行观察，并用凝胶成像系统检测pcr电泳结果，拍照记录。

2.6数据处理与分析

实验结果由7500realtimepcrsystem导出，并根据导出的ct值计算基因的相对表达量。

实时荧光定量的方法分为：比较ct法相对定量法、标准曲线相对定量法以及绝对定量法。采用2^-△△ct法计算目的基因的相对表达量，其中，

△△ct＝(ct实验组目的基因-实验组内参基因)-(ct对照组目的基因-对照组内参基因)

用spss22.0软件对得到的数据对同一品种同一组织中三个时间点的表达量进行进行各个水平间的单因素方差分析，并选用邓肯法进行多重比较，对两个品种间的差异分析采用独立样本t检验完成。用graphpadprism5进行图表的绘制。

(三)结果与分析

3.1总rna的提取与检测

通过核算蛋白仪检测后发现，如图1所示，所有rna样品的od值分布在1.9-2.1之间；而进行琼脂糖凝胶电泳检测发现5.8s、18s、28s带清晰可见。因此可得，试验rna样品具有很高的稳定性与完整性，在后续试验中使用可靠。

3.2pcr结果电泳图

如图2所示，pcr扩增后显示目的基因条带在maker所标度的100bp上，与我们所预估的产物长度相接近，而且没有二聚体，也说明引物选择的效果较好，具有特异性。

3.3qrt-pcr的扩增曲线和熔解曲线

myh7-1、myh7-2、myh7-3与18s基因的部分扩增曲线如图3a、3b、3c所示，显而易见的是目的基因和内参基因(18s)的扩增曲线拐点极为清晰，基线呈水平，“s”曲线佳。

myh7-1、myh7-2和myh7-3的熔解曲线如图4a、4b、4c所示，观察到3对基因的熔解曲线均表现为单峰，可知在扩增过程中并未出现非特异扩增和引物二聚体现象。

3.4myh7-1在大白猪和山西黑猪肌组织中的的发育性表达

如图5中a所示，myh7-1在两品种的背最长肌中都具有先降低后升高的表达趋势。两个品种中，myh7-1基因在25d和150d的表达量极显著高于70d的表达量(p<0.01)。在三个采样点对两个品种间的表达量进行比较发现，25d、70d和150d大白猪和山西黑猪的表达差异极为显著(p<0.01)。

如图5中b所示，大白猪和山西黑猪腰大肌中myh7-1基因具有相反的表达趋势，前者表现为先降低后升高，后者表现为先升高后降低。大白猪中，25d腰大肌myh7-1的表达水平极显著高于70d和150d(p<0.01)，150d的表达量极显著高于70d(p<0.01)。在山西黑猪中，70d和150d腰大肌中myh7-1的表达量不存在差异，但极显著高于25d的表达量。在对两个品种间的表达量进行比较发现，三个采样点大白猪与山西黑猪的腰大肌myh7-1的表达量均存在极显著差异，其中25d大白猪腰大肌myh7-1的表达量极显著高于山西黑猪的表达量(p<0.01)，而70d和150d的表达恰好相反，山西黑猪腰大肌myh7-1的表达量极显著高于大白猪(p<0.01)。

如图5中c所示，与背最长肌和腰大肌相比，股二头肌中myh7-1的时序变化均表现为降低趋势，具有极显著的正相关(r＝0.990,p<0.01)即前期表达较高，随着日龄的不断增加，表达量出现极显著的下降(p<0.01)。两品种间myh7-1基因表达差异极显著(p<0.01)，在大白猪股二头肌中的表达极显著高于山西黑猪。

3.5myh7-1在大白猪和山西黑猪肌组织间的差异表达

同一日龄的同一品种中三种肌肉组织间myh7-1表达差异分析结果见图6。在大白猪中，myh7-1在股二头肌肌中表达极显著高于背最长肌和腰大肌(p<0.01)。山西黑猪发育前期与之相类似，而在发育后期(70d和150d)腰大肌中的表达量却极显著高于背最长肌和股二头肌中的表达量。

3.6myh7-2在大白猪和山西黑猪肌组织中的的发育性表达

如图7中a所示，大白猪总体上表现为先降低后升高的趋势，myh7-2基因在25d时表达最高，极显著高于70d和150d(p<0.01)；而在山西黑猪中myh7-2基因几乎不表达，只有在25d时存在极微量表达。

如图7中b所示，大白猪表现为先降低后升高，山西黑猪总体呈升高的表达趋势。myh7-2在25d大白猪腰大肌中的表达量极显著高于70d和150d(p<0.01)，山西黑猪腰大肌中在70d和150d的表达水平却极显著高于25d(p<0.01)，而70d和150d腰大肌中的表达差异不显著。同时通过两品种间的表达量对比发现，25d和150d的大白猪和山西黑猪的表达差异极显著，25d大白猪极显著高于山西黑猪，70d与之相反，而150d时大白猪和山西黑猪的背最长肌中的表达量无显著差异(p>0.05)。

如图7中c所示，大白猪和山西黑猪股二头肌中myh7-2基因与myh7-1具有类似的表达趋势，前期表达量较高，后随日龄增加表达量降低。在大白猪中，myh7-2在25d股二头肌中的表达量极显著高于70d和150d(p<0.01)，而后者差异不显著；在山西黑猪中，25d和70d股二头肌中的表达量极显著高于150d(p<0.01)，而前这差异不显著。

3.7myh7-2在大白猪和山西黑猪肌组织间的差异表达

同一日龄的同一品种中三种肌肉组织间myh7-2表达差异分析结果见图8。两品种不同组织间的表达结果相类似，在不同生长发育阶段，myh7-2基因总是在股二头肌中表达量极高，不过山西黑猪在发育后期70d的表达量也相对较高。

3.8myh7-3在大白猪和山西黑猪肌组织中的的发育性表达

如图9中a所示，myh7-3基因在山西黑猪和大白猪表达趋势相反。myh7-3基因在25d大白猪中的表达极显著高于70d和150d(p<0.01)，而山西黑猪在150d的表达极显著高于25d和70d(p<0.01)；在三个采样点对两品种间的表达量进行比较发现，25d和70d的大白猪和山西黑猪的表达差异极显著(p<0.01)，大白猪极显著高于山西黑猪，而150d时山西黑猪的表达水平极显著高于大白猪(p<0.01)。

如图9中b所示，大白猪和山西黑猪腰大肌中myh7-3基因与myh7-2具有类似的表达趋势，大白猪表现为先降低后升高，山西黑猪总体呈升高趋势。在大白猪中，25d腰大肌myh7-3的表达水平极显著高于70d和150d(p<0.01)，而150d的表达量又极显著高于70d(p<0.01)；在山西黑猪中，在150d时达到最高表达量。在三个采样点对两个品种间的表达量进行比较发现，三个采样点大白猪与山西黑猪的腰大肌中myh7-3的表达量均极显著差异，25d是大白猪腰大肌myh7-3的表达量极显著高于山西黑猪中的表达量(p<0.01)，而70d和150d的表达差异与之正好相反，大白猪腰大肌myh10的表达量极显著低于山西黑猪(p<0.01)。

如图9中c所示，山西黑猪的股二头肌中myh7-3的表达检测结果表现为先降低后升高，大白猪总体降低的表达趋势。两品种间相比，大白猪和山西黑猪在不同采样点的myh7-3表达量均存在显著差异，在25d和70d时大白猪的相对表达量极显著高于黑猪(p<0.01)，150d时山西黑猪却极显著高于大白猪(p<0.01)。在大白猪中，myh7-3基因在25d时表达量最高，极显著高于其他日龄(p<0.01)；山西黑猪中myh7-3基因在150d时表达量最高，极显著高于其他日龄(p<0.01)。

3.9myh7-3在大白猪和山西黑猪肌组织间的的差异表达

同一日龄的同一品种中三种肌肉组织间myh7-3表达差异分析结果见图10。两品种不同组织间的表达结果相类似，整个发育阶段myh7-3大部分在腰大肌和股二头肌中高表达，极显著高于背最长肌(p<0.01)。

3.10大白猪和山西黑猪肌肉组织中myh7-1、myh7-2和myh7-3基因的相关性

表5大白猪和山西黑猪肌肉组织中myh7-1、myh7-2和myh7-3基因的表达相关性

注：表右上角部分和左下角部分分别表示大白猪和山西黑猪肌肉组织中myh7-1、myh7-2和myh7-3基因的表达相关性；大白猪b表示背最长肌；y表示腰大肌；g表示股二头肌；1表示myh7-1；2表示myh7-2；3表示myh7-3。

由表5可知，对大白猪三种组织中myh7三个转录本的表达结果进行相关性分析发现，除背最长肌中myh7-1和myh7-3没有相关性，三个转录本在同一种组织中的表达趋势非常一致，都具有极显著的正相关(p<0.01)。

山西黑猪背最长肌中myh7-1和myh7-3存在极显著的负相关(p<0.01)，而大白猪中没有检测到相关性。myh7-1与myh7-2在腰大肌中存在极显著的正相关(p<0.01)。而在股二头肌中发现，myh7-1与myh7-2具有极显著的正相关(p<0.01)，而myh7-1、myh7-2与myh7-3之间是负相关关系。

有上述试验可知，利用相关基因myh7检测猪肌组织发育是可行的，并且基于此检测方法可制备含有myh7-1、myh7-2、myh7-3、18s的基因引物序列的试剂盒，以此检测猪肌肉品质，推测肌肉的鲜嫩程度。

本发明不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本发明的保护范围之内。