一种检测绵羊SPATA6基因单核苷多态性的方法及应用与流程

本发明涉及绵羊单核苷多态性(snp)分子标记的筛选与检测领域，具体是一种检测绵羊spata6基因单核苷多态性的方法及应用。

背景技术：

单核苷多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)作为一种最普遍的遗传变异形式，是指在基因组水平，由于单个碱基的转换、颠换、插入和缺失，而引起的dna序列的多态性。这种分子标记数量多且分布广，根据是否处于蛋白编码区，可分为编码snp和非编码snp，位于编码区内的csnp比较少，但却在遗传性疾病研究中具有重要意义，因此，编码区内的csnp的研究更受关注。基因编码区内的csnp又可分为2种：一种是编码区内的同义csnp(synonymouscsnp)，即snp所致编码序列的改变并不会影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列的改变；另一种是编码区内的非同义csnp(non-synonymouscsnp)，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而导致蛋白质中氨基酸序列的改变，可能最终影响蛋白质的功能。

目前，主要采用几种不同的路线来发现snps：即dna序列测定方法、聚合酶链反应—单链构象多态(polymerasechainreaction-singlestrandconformationpolymorphism，pcr-sscp)与dna测序结合法、等位特异性pcr(allelespecificpcr，as-pcr)方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些snp检测技术中，dna序列测定法是最为准确的snp检测方法，但是，其检测费用昂贵，且需要有dna测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，dna序列测定法不是一种广泛应用于生产实际的理想snp检测方法；pcr-sscp的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的snp检测手段；as-pcr方法作为一种新型的snp检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；且引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测snp位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。

本研究检测基因snps所使用的imldr(improvedmultiplexligationdetectionreaction)荧光多重酶连接反应技术是一种基于传统的连接酶反应经过改进后的，具有天昊自主知识产权的多重snp分型技术，相比于传统的连接酶反应技术，imldr提高了准确性和分型的成功率，经过重复实验和双盲样本的初步验证，该技术的数据准确性超过98％，仅次于测序和snapshot。imldr技术是该技术适合大样本(数百个以上)多位点(15-30个)的分型，能够提高snp分型的通量，大大降低分型成本。

睾丸作为雄性动物最主要的生殖腺，主要有精子生成和雄性激素分泌的作用，共同影响雄性动物生殖生理过程。研究发现，睾丸大的公畜精子产量高、精液品质好。因此，睾丸的发育对公畜的繁殖性能有显著影响。研究影响睾丸大小的基因可为分子育种提供一定的理论依据，曾有研究发现敲除ehd4基因，小鼠在出生后31天时生殖细胞达到凋亡高峰，睾丸重量下降50％，同时生精管直径变小，且生精上皮失调，精子头部异常。胰岛素受体底物(insulinreceptorsubstrate，irs)作为睾丸发育的重要基因，可通过调节支持细胞的增殖控制睾丸大小，irs基因缺乏的小鼠睾丸的体积和重量减少。由此可见，研究睾丸发育相关基因具有很重要的意义。

精子发生相关基因6(spermatogenesis-associatedprotein6，spata6)又名srf-1，是一个睾丸特异性基因，位于精子头颈部，对正常精子的头尾连接起重要作用。spata6基因最先在小鼠上被研究，编码三种mrna(-2.6，-1.8和-1.2kb)，2.6kb转录物在睾丸、卵巢、胸腺和胎盘中低表达，而1.8和1.2kbmrna在睾丸中特异性表达。研究发现spata6在精子细胞中的mrna表达高于精母细胞和精原细胞。spata6基因定位于小鼠的5号染色体34-35q区域，由15个外显子组成，编码488个氨基酸，分子量为53kda。定位于人的1号染色体p32-35区域，人类spata6氨基酸序列与小鼠、鸡和斑马鱼的相似性分别为88％、50％和33％，是一个进化上比较保守的基因。在小鼠上的研究表明spata6蛋白会干扰肌球蛋白合成，影响精子颈部节柱的形成，对完整精子的连接很重要，spata6失活可能会导致男性不育症和无头精子。通过研究spata6在睾丸生殖细胞肿瘤中的作用，发现spata6表达下降会通过增加凋亡相关基因蛋白的表达而抑制细胞增殖，同时诱导细胞凋亡。在多样性远交小鼠群体中，通过全基因组关联分析发现spata6基因是影响睾丸重量的候选基因，影响睾丸发育。综上所述，spata6基因在精子发生中有很重要的作用，对其的研究可为进一步揭示雄性不育及低繁殖力提供理论依据。

综上，spata6基因在睾丸发育中起着十分重要的作用。关于目前对该基因的研究大多集中在小鼠和人类上，在绵羊中鲜有报道。由于目前spata6基因与绵羊睾丸大小的研究匮乏，使该基因的功能研究及该基因遗传变异与睾丸发育关联的研究成为空白。因此，对绵羊spata6基因单核苷多态性的研究至关重要，并且将该基因的多态性与绵羊睾丸大小关联分析，可为绵羊分子育种提供理论依据

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测绵羊spata6基因单核苷多态性的方法及其在绵羊睾丸大小性状早期筛选中的应用，以至少达到利用精子发生相关基因6筛选绵羊睾丸大小的目的。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种检测绵羊spata6基因单核苷多态性的方法，包括以下步骤：

s1样品选取：采集299只饲养条件相同的6月龄湖羊屠宰后的睾丸、附睾，并测定睾丸、附睾的重量和体积；

s2cdna池的构建：

a)利用氯仿提取睾丸组织中的rna；

b)将提取出的rna进行rna的琼脂糖凝胶电泳，应用核酸蛋白浓度测定仪nanodrop2000测260/280nmod值及浓度；

c)参照transscriptone-stepgdnaremovalandcdnasythesissupermix试剂盒说明书中方法进行反转录(rt)，得到cdna第1链，所得即为cdna第一链；

d)利用氯仿与酚提取睾丸组织dna；

c)cdna池的构建：100个体rna经质量检测合格后，反转录为cdna，取出一定的量稀释至50ng/μl，然后随机每10个个体cdna样本混合，共构建10个cdna混池。

s3pcr扩增：以ncbi所公布的绵羊mrna(xm_012136817.2)序列为参考，利用primer5.0软件设计能够扩增包含绵羊精子发生相关基因6的第7外显子区域的pcr引物，对s3中的cdna进行pcr扩增；

s4产物测序与单核苷多态性分型：将s3中混池扩增的pcr产物双向测序；将质量和浓度检测合格的299个dna样品，统一稀释至50ng/μl，分装至1ml的离心管中，提供此单核苷多态性位点上下游各15bpdna序列的具体信息，应用荧光多重酶连接反应技术对299个样品进行单核苷多态性分型；

s5绵羊spata6基因单核苷多态性位点的频率统计及其与睾丸表型的关联分析。

优选的，所述的s3中引物f与引物r为：

引物f：5’-aactacgaacagcctacaat-3’20nt

引物r：5’-tgacaaggacactcatacag-3’20nt

通过针对绵羊精子发生相关基因6的第7外显子区域，设计特异性引物，进而方便pcr扩增。

优选的，所述的rt反应体系为20μl：rna2μl，1μlanchoredoligo(dt)18primer(0.5μg/μl)，10μl2×tsreactionmix，1μltransscriptrt/tienzymemix，加rnase-freewater5μl至20μl，混合物在pcr仪上进行反转录，所得即为cdna第一链。

优选的，所述的pcr扩增方法：以cdna混池为模板，进行pcr扩增，pcr总反应体系为25.5μl，95℃预变性5min，95℃变性30s，60.2℃退火30s，72℃延伸30s，72℃再延伸10min，进行34个循环，扩增出充分的dna片段。

优选的，所述的s2中a)利用氯仿提取睾丸组织中的rna具体步骤为：

ⅰ)在229个样品中随机选取100个样品，分别取约0.2g，然后迅速放入用液氮预冷的灭过菌的研钵中，往研钵中倒入液氮，快速研磨成细末状；1mltranszol加到灭过菌的含50～100mg磨细组织的1.5mlep管中。剧烈摇匀，室温放置10min；

ⅱ)加入200μl氯仿，剧烈摇匀，室温放置3min，4℃条件下16099r/min离心15min；

ⅲ)吸取上清400μl于另一离心管中，加入预冷的异丙醇500μl，室温放置10min，4℃条件下16099r/min离心10min；

ⅳ)弃上清，加入1ml预冷的75％乙醇(depc处理水配制)，重悬rna，室温放置10min，4℃条件下16099r/min离心10min；

ⅴ)移弃乙醇，于超净工作台中风干rna；

ⅵ)加入50μldepc水，溶解rna；

优选的，所述的s2中d)利用氯仿与酚提取睾丸组织dna的具体步骤为：

ⅰ)229个睾丸组织样品用研钵在液氮中研磨至粉末状，称取10mg至1.5ml的离心管中；

ⅱ)加入750μl组织裂解液置于37℃温育1-2h；

ⅲ)加入7.5μl的10mg/ml蛋白酶k(pek)，充分混匀，用封口膜封住，置于55℃水浴消化过夜，这期间将其取出轻摇几次，使沉淀块散开，有利于酶解；

ⅳ)反应液冷却至室温，加入1倍体积(800μl-1000μl)的tris饱和酚，放置冰上温和摇动15min；4℃条件下12000r/min离心10min；将上层水相用移液枪移到另一灭菌离心管中；

ⅴ)加入0.5倍体积(0.5ml)的酚和0.5倍体积(0.5ml)的氯仿，放置冰上温和摇动15min；4℃条件下12000r/min离心10min；将上层水相用移液枪移到另一灭菌离心管中；

ⅵ)加入1倍体积(1ml)的氯仿，放置冰上温和摇动15min；4℃条件下12000r/min离心10min；将上层水相用移液枪移到另一灭菌离心管中；

ⅶ)加入2倍体积的预冷无水乙醇(-20℃)，轻轻口底摇晃多次至dna析出，然后-20℃放置30min；4℃条件下12000r/min离心10min；

ⅷ)弃上清液，加入70％乙醇1ml，温和摇动10min；4℃条件下12000r/min离心10min，弃乙醇，重复漂洗一次；

ⅸ)真空干燥或室温下使乙醇挥发干净；加入60μl灭菌超纯水溶解，4℃条件下保存并待检测。

本发明还提供一种检测绵羊spata6基因单核苷多态性的应用，所述的s5中绵羊精子发生相关基因6的单核苷多态性位点的频率统计及其与睾丸表型的关联分析包括：基因和基因型频率计算、相关性分析。

优选的，所述的基因和基因型频率计算公式分别为：

基因频率计算公式：

pb＝(2nbb+nbb1+nbb2+nbb3+nbb4+……+nbbn)/2n，

式中，pb表示等位基因b频率，nbb表示群体中具有bb基因型的个体数量，nbbi表示群体中具有bbi基因型个体数量，b1～bn为等位基因b的n个互不相同的复等位基因；

基因型频率计算公式：

pbb＝nbb/n，

式中，pbb代表某一位点的bb基因型频率，nbb表示群体中具有bb基因型的个体数，n为检测群体的总数量；

所述的相关性分析为：荧光多重酶连接反应技术的分型结果、睾丸表型数据、sas(9.2)软件分析数据

优选的，所述sas(9.2)软件分析数据分析基因位点与睾丸表型数据的相关性，分析模型如下：

yijk＝μ+gj+eijk

式中，yijk为个体表型记录；μ为群体均值；gj为各位点的基因型效应；eijk为随机误差，进而通过构建的模型推出基因位点进而筛选出绵羊睾丸大小性状，同时佐证检测绵羊精子发生相关基因6组的第72272位t>c突变的单核苷多态性对绵羊睾丸早期性状的影响。

本发明的有益效果是：

1.通过针对绵羊spata6基因的第7外显子区域，设计特异性引物，进而方便pcr扩增。

2.通过pcr高温变性、退火，方便dna双链解链，同时有利于延伸的进行，采取循环34次，进而充分扩增出足够数量的dna。

3.通过分析基因位点与睾丸表型数据，建立相关模型，通过绵羊睾丸大小形状早期筛选，进而为选育高繁殖力的绵羊提供筛选标记。

附图说明

图1为绵羊睾丸组织基因组dna电泳检测图；

图2为绵羊睾丸组织rna电泳检测图；

图3为绵羊spata6基因的pcr扩增850bp片段的电泳；

图4为绵羊spata6基因的第72272位单核苷酸的不同基因型个体的测序峰图。

具体实施方式

下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

一种检测绵羊spata6基因单核苷多态性的方法，包括以下步骤：

s1样品选取：采集299只饲养条件相同的6月龄湖羊屠宰后的睾丸、附睾，并测定睾丸、附睾的重量和体积；

s2cdna池的构建：

a)利用氯仿提取睾丸组织中的rna，具体步骤如下：ⅰ)在229个样品中随机选取100个样品，分别取约0.2g，然后迅速放入用液氮预冷的灭过菌的研钵中，往研钵中倒入液氮，快速研磨成细末状；1mltranszol加到灭过菌的含50～100mg磨细组织的1.5mlep管中。剧烈摇匀，室温放置10min；

ⅱ)加入200μl氯仿，剧烈摇匀，室温放置3min，4℃条件下16099r/min离心15min；

ⅲ)吸取上清400μl于另一离心管中，加入预冷的异丙醇500μl，室温放置10min，4℃条件下16099r/min离心10min；

ⅳ)弃上清，加入1ml预冷的75％乙醇(depc处理水配制)，重悬rna，室温放置10min，4℃条件下16099r/min离心10min；

ⅴ)移弃乙醇，于超净工作台中风干rna；

ⅵ)加入50μldepc水，溶解rna；

b)将提取出的rna进行rna的琼脂糖凝胶电泳，如图2所示，应用核酸蛋白浓度测定仪nanodrop2000测260/280nmod值及浓度；

c)参照transscriptone-stepgdnaremovalandcdnasythesissupermix试剂盒说明书中方法进行反转录(rt)，具体步骤为：采用rna2μl，1μlanchoredoligo(dt)18primer(0.5μg/μl)，10μl2×tsreactionmix，1μltransscriptrt/tienzymemix，加rnase-freewater5μl至20μl，混合物在pcr仪上进行反转录，所得即为cdna第1链；

d)利用氯仿与酚提取睾丸组织dna，具体步骤如下：ⅰ)229个睾丸组织样品用研钵在液氮中研磨至粉末状，称取10mg至1.5ml的离心管中；

ⅱ)加入750μl组织裂解液置于37℃温育1-2h；

ⅲ)加入7.5μl的10mg/ml蛋白酶k(pek)，充分混匀，用封口膜封住，置于55℃水浴消化过夜，这期间将其取出轻摇几次，使沉淀块散开，有利于酶解；

ⅳ)反应液冷却至室温，加入1倍体积(800μl-1000μl)的tris饱和酚，放置冰上温和摇动15min；4℃条件下12000r/min离心10min；将上层水相用移液枪移到另一灭菌离心管中；

ⅴ)加入0.5倍体积(0.5ml)的酚和0.5倍体积(0.5ml)的氯仿，放置冰上温和摇动15min；4℃条件下12000r/min离心10min；将上层水相用移液枪移到另一灭菌离心管中；

ⅵ)加入1倍体积(1ml)的氯仿，放置冰上温和摇动15min；4℃条件下12000r/min离心10min；将上层水相用移液枪移到另一灭菌离心管中；

ⅶ)加入2倍体积的预冷无水乙醇(-20℃)，轻轻口底摇晃多次至dna析出，然后-20℃放置30min；4℃条件下12000r/min离心10min；

ⅷ)弃上清液，加入70％乙醇1ml，温和摇动10min；4℃条件下12000r/min离心10min，弃乙醇，重复漂洗一次；

ⅸ)真空干燥或室温下使乙醇挥发干净；加入60μl灭菌超纯水溶解，4℃条件下保存并待检测；

c)cdna池的构建：100个体rna经质量检测合格后，反转录为cdna，取出一定的量稀释至50ng/μl，然后随机每10个个体cdna样本混合，共构建10个cdna混池。

s3pcr扩增：以ncbi所公布的绵羊mrna(xm_012136817.2)序列为参考，利用primer5.0软件设计能够扩增包含绵羊精子发生相关基因6的第7外显子区域的pcr引物f与引物r：引物f：5’-aactacgaacagcctacaat-3’20nt

引物r：5’-tgacaaggacactcatacag-3’20nt

反应体系为：12.5μl的2xeasytagsupermix(2.5u/μl)、0.5μl上游引物(10pmol/μl)、0.5μl下游引物(10pmol/μl)、10.5μl灭菌的双蒸水、1.5μldna模板(50ng/μl)

操作步骤为：以cdna混池为模板，进行pcr扩增，pcr总反应体系为25.5μl，95℃预变性5min，95℃变性30s，60.2℃退火30s，72℃延伸30s，72℃再延伸10min，进行34个循环，扩增出充分的dna片段，将扩增出的850bp片段进行电泳，得到图3；

s4产物测序与单核苷多态性分型：将s3中混池扩增的pcr产物双向测序；将质量和浓度检测合格的299个dna样品，统一稀释至50ng/μl，分装至1ml的离心管中，提供此单核苷多态性位点上下游各15bpdna序列的具体信息，应用荧光多重酶连接反应技术对299个样品进行单核苷多态性分型，得到图4所示的绵羊精子发生相关基因6第72272位单核苷多态性的不同基因型个体的测序峰图；

s5绵羊spata6基因单核苷多态性位点的频率统计及其与睾丸表型的关联分析。

本发明还提供一种检测绵羊spata6基因单核苷多态性的应用，所述的s5中绵羊spata6基因单核苷多态性位点的频率统计及其与睾丸表型的关联分析包括：基因和基因型频率计算、相关性分析；所述的基因和基因型频率计算公式分别为：

基因频率计算公式：

pb＝(2nbb+nbb1+nbb2+nbb3+nbb4+……+nbbn)/2n，

式中，pb表示等位基因b频率，nbb表示群体中具有bb基因型的个体数量，nbbi表示群体中具有bbi基因型个体数量，b1～bn为等位基因b的n个互不相同的复等位基因，如表1所示：

表1绵羊精子发生相关基因6等位基因频率与基因型频率

基因型频率计算公式：

pbb＝nbb/n，

式中，pbb代表某一位点的bb基因型频率，nbb表示群体中具有bb基因型的个体数，n为检测群体的总数量；

所述的相关性分析为：荧光多重酶连接反应技术的分型结果、睾丸表型数据、sas(9.2)软件分析数据

所述sas(9.2)软件分析数据分析基因位点与睾丸表型数据的相关性，分析模型如下：

yijk＝μ+gj+eijk

式中，yijk为个体表型记录；μ为群体均值；gj为各位点的基因型效应；eijk为随机误差，进而通过构建的模型推出基因位点进而筛选出绵羊睾丸大小性状，同时佐证检测绵羊spata6基因的第72272位t>c突变的单核苷多态性对绵羊睾丸早期性状的影响，相关数据如表2所示：

表2绵羊精子发生相关基因6单核苷多态性与绵羊睾丸表型之间的关联分析

注：具有相同字母肩标的平均值间差异不显著(p>0.05)，具有不同字母肩标的平均值间差异显著(p<0.05)。

对于荧光多重酶连接反应技术分型的第72272位的单核苷多态性位点，c为优势等位基因；关联分析表明，tt基因型个体的睾丸总重量显著高于ct基因型个体，tt基因型个体的右侧睾丸重量显著高于ct基因型。根据这个研究结果，人们可以通过选择，建立基因型为tt的绵羊群体，通过绵羊睾丸大小形状早期筛选，进而为选育高繁殖力的绵羊提供筛选标记。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。