一种鉴别哲罗鲑遗传性别的分子标记以及鉴别方法与流程

本发明涉及一种鱼类鉴别遗传性别的分子标记以及鉴别方法。

背景技术：

哲罗鲑huchotaimen(pallas)隶属鲑形目(salmoniformes)、鲑科(salmonidae)，哲罗鱼属(hucho)，是我国珍稀名贵的冷水性鱼类，肉质细嫩、味道鲜美。1998年哲罗鲑被列入中国濒危动物红皮书，濒危等级为易危。近年来哲罗鲑的资源量不断下降，已经很难见到，2004年被列入中国物种红色名录。哲罗鲑是鲑科鱼类中个体最大的鱼类，生长迅速，由于哲罗鲑第一次性成熟需要4～5年，性成熟前无法通过外观形态来判断其性别，性成熟后繁殖期成熟雌雄鱼体从腹部到尾部，包括腹鳍和尾鳍均出现桔红色婚姻色，且部分个体婚姻色不明显，很难通过婚姻色鉴定雌雄，因此如何快速、准确鉴定哲罗鲑的遗传性别，在亲本培育过程中做到合适的雌雄比例，节约养殖成本，现已成为制约哲罗鲑产业发展的重要因素。

技术实现要素：

虽然基于分子标记可以简单、快速、准确地实现遗传性别的鉴别，节省人力和物力，并且在很多物种中已经得到了应用，但是在哲罗鲑中尚未发现相关遗传性别的特异分子标记。本发明的目的是提供一种可用于哲罗鲑遗传性别鉴别的分子标记以及鉴别方法。

本发明鉴别哲罗鲑遗传性别的分子标记的核苷酸序列如seqidno：1所示。

本发明用于鉴别哲罗鲑遗传性别的分子标记引物，分子标记上游引物为5’-tgtcagggttgattacagttcct-3’，分子标记下游引物为5’-ctgcagtctgattcctcatca-3’。

本发明用于鉴别哲罗鲑遗传性别的线粒体辅助分子标记引物，线粒体辅助分子标记上游引物为5’-cgttcaacctcaccacctct-3’，线粒体辅助分子标记下游引物为5’-gcctcagagccagtttcaag-3’。线粒体辅助分子标记的核苷酸序列如seqidno：2所示。

本发明一种鉴别哲罗鲑遗传性别的方法：

一、提取待鉴别样品基因组dna；

二、以步骤一基因组dna为模板进行pcr扩增，pcr扩增体系中分子标记上游引物为5’-tgtcagggttgattacagttcct-3’，分子标记下游引物为5’-ctgcagtctgattcctcatca-3’；

三、pcr产物凝胶电泳，没有条带的出现的为哲罗鲑雌鱼，显示出现1条153bp条带的为哲罗鲑雄鱼。

本发明另一种鉴别哲罗鲑遗传性别的方法：

一、提取待鉴别样品基因组dna；

二、以步骤一基因组dna为模板进行pcr扩增，pcr扩增体系中分子标记上游引物为5’-tgtcagggttgattacagttcct-3’，分子标记下游引物为5’-ctgcagtctgattcctcatca-3’，辅助分子标记上游引物为5’-cgttcaacctcaccacctct-3’，辅助分子标记下游引物为5’-gcctcagagccagtttcaag-3’；

三、pcr产物凝胶电泳，显示出现1条251bp条带的为哲罗鲑雌鱼，显示出现153bp和251bp两条条带的为哲罗鲑雄鱼。

本发明采用分子标记pcr扩增的方法鉴别哲罗鲑的性别，操作方便，且能够在3.5h内完成鉴定，高效快捷，在生产方面具有重要的应用价值。

本发明鉴别哲罗鲑遗传性别的分子标记，为哲罗鲑性别鉴定提供了科学依据。

本发明第二种鉴别方法中加入了线粒体dna作为参照，并对线粒体dna引物和特异性序列的引物比例进行了优化，使二者均扩增条带清晰条带，能够准确区分是否由于扩增过程失误、dna降解等原因造成的条带缺失，提高鉴定的准确性。

附图说明

图1是实施例1中选取4条雌鱼和4条雄鱼的凝胶电泳鉴别图。

图2是实施例2中选取5条雌鱼和5条雄鱼的凝胶电泳鉴别图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式鉴别哲罗鲑遗传性别的方法：

一、提取待鉴别样品基因组dna；

二、以步骤一基因组dna为模板进行pcr扩增，pcr扩增体系中分子标记上游引物为5’-tgtcagggttgattacagttcct-3’，分子标记下游引物为5’-ctgcagtctgattcctcatca-3’；

三、pcr产物凝胶电泳，没有条带的出现的为哲罗鲑雌鱼，显示出现1条153bp条带的为哲罗鲑雄鱼。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中pcr扩增反应体系为20μl：2×pcrtaqmix10μl，待鉴别样品基因组dna2μl，分子标记引物浓度为10μm、分子标记上下游引物各1μl，余其用超纯水补足；pcr反应为：95℃预变性3min，然后进行30个循环95℃变性30sec、60℃退火30sec、72℃延伸30sec；最后72℃延伸5min。其它与实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是：

步骤一：取待鉴别哲罗鲑0.4cm²的鳍条样本，用100μl裂解液裂解，然后用pcr仪消化样本，消化过程为55℃消化50min、98℃消化10min；之后混匀、再1000～2000rpm离心1-2min，取上清液即得到样品基因组dna。其它与实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一的不同点是：裂解液中蛋白酶k浓度为0.5mg/ml、ph8.0的tris浓度为10mm、kcl浓度为50mm、tween20浓度为0.3％(w/v)、np-40浓度为0.3％(w/v)。其它与实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式鉴别哲罗鲑遗传性别的方法：

一、提取待鉴别样品基因组dna；

二、以步骤一基因组dna为模板进行pcr扩增，pcr扩增体系中分子标记上游引物为5’-tgtcagggttgattacagttcct-3’，分子标记下游引物为5’-ctgcagtctgattcctcatca-3’，辅助分子标记上游引物为5’-cgttcaacctcaccacctct-3’，辅助分子标记下游引物为5’-gcctcagagccagtttcaag-3’；

三、pcr产物凝胶电泳，显示出现1条251bp条带的为哲罗鲑雌鱼，显示出现153bp和251bp两条条带的为哲罗鲑雄鱼。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤二中pcr扩增反应体系为20μl：2×taqpcrmix10μl，待鉴别样品基因组dna2μl，分子标记引物浓度为10μm、分子标记上下游引物各1μl，辅助分子标记引物浓度为1μm、辅助分子标记上下游引物各1μl；余其用超纯水补足；pcr反应为：95℃预变性3min，然后进行30个循环95℃变性30sec、60℃退火30sec、72℃延伸30sec；最后72℃延伸5min。其它与实施方式五相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式五或六的不同点是：

步骤一：取待鉴别哲罗鲑0.4cm²的鳍条样本，用100μl裂解液裂解，然后用pcr仪消化样本，消化过程为55℃消化50min、98℃消化10min；之后混匀、再1000～2000rpm离心1-2min，取上清液即得到样品基因组dna。其它与实施方式五或六相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式五至七之一的不同点是：裂解液中蛋白酶k浓度为0.5mg/ml、ph8.0的tris浓度为10mm、kcl浓度为50mm、tween20浓度为0.3％(w/v)、np-40浓度为0.3％(w/v)。其它与实施方式五至七之一相同。

实施例1

1、已知性别的群体获得

中国水产科学研究院黑龙江水产研究所渤海冷水鱼实验站产卵时鉴定雌雄，雌雄鱼样本各30尾，剪取鳍条样本贴在滤纸上阴干。

2、提取待鉴别样品基因组dna：

取待鉴别哲罗鲑0.4cm²的鳍条样本，用100μl裂解液裂解，然后用pcr仪消化样本，消化过程为55℃消化50min、98℃消化10min；之后用vortex混匀、再1000～2000rpm离心1～2min，取上清液即得到样品基因组dna。裂解液中蛋白酶k浓度为0.5mg/ml、ph8.0的tris浓度为10mm、kcl浓度为50mm、tween20浓度为0.3％(w/v)、np-40浓度为0.3％(w/v)。。

3、pcr扩增：

以上一步骤基因组dna为模板进行pcr扩增，pcr扩增体系中分子标记上游引物为5’-tgtcagggttgattacagttcct-3’，分子标记下游引物为5’-ctgcagtctgattcctcatca-3’；pcr扩增反应体系为20μl：2×taqpcrmix10μl，待鉴别样品基因组dna2μl，分子标记引物浓度为10μm、分子标记上下游引物各1μl，余其用超纯水补足；pcr反应为：95℃预变性3min，然后进行30个循环95℃变性30sec、60℃退火30sec、72℃延伸30sec；最后72℃延伸5min。

4、pcr产物凝胶电泳，取8μlpcr产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，30条雌鱼均没有条带的出现，30条雄鱼均扩增出1条153bp的条带。

其中4条雌鱼(泳道1～4)和4条雄鱼(泳道5～8)的凝胶电泳鉴别结果如图1所示。本发明方法鉴别结论与实际情况完全吻合，证明本发明方法准确。

实施例2

1、已知性别的群体获得

中国水产科学研究院黑龙江水产研究所渤海冷水鱼实验站产卵时鉴定雌雄，雌雄鱼样本各50尾，剪取鳍条样本贴在滤纸上阴干。

2、提取待鉴别样品基因组dna：

取待鉴别哲罗鲑0.4cm²的鳍条样本，用100μl裂解液裂解，然后用pcr仪消化样本，消化过程为55℃消化50min、98℃消化10min；之后用vortex混匀、再1000～2000rpm离心1～2min，取上清液即得到样品基因组dna。裂解液中蛋白酶k浓度为0.5mg/ml、ph8.0的tris浓度为10mm、kcl浓度为50mm、tween20浓度为0.3％(w/v)、np-40浓度为0.3％(w/v)。

3、pcr扩增：

以上一步骤基因组dna为模板进行pcr扩增，pcr扩增体系中分子标记上游引物为5’-tgtcagggttgattacagttcct-3’，分子标记下游引物为5’-ctgcagtctgattcctcatca-3’，辅助分子标记上游引物为5’-cgttcaacctcaccacctct-3’，辅助分子标记下游引物为5’-gcctcagagccagtttcaag-3’；pcr扩增反应体系为20μl：2×pcrmix10μl，待鉴别样品基因组dna2μl，分子标记引物浓度为10μm、分子标记上下游引物各1μl，辅助分子标记引物浓度为1μm、辅助分子标记上下游引物各1μl；余其用超纯水补足；pcr反应为：95℃预变性3min，然后进行30个循环95℃变性30sec、60℃退火30sec、72℃延伸30sec；最后72℃延伸5min。

4、pcr产物凝胶电泳，取8μlpcr产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，50条雌鱼均扩增出条1条251bp的条带，50条雄鱼扩增出1条251bp和1条153bp的两条条带。

其中5条雌鱼(泳道1～5)和5条雄鱼(泳道6～10)的凝胶电泳鉴别结果如图2所示。本发明方法鉴别结论与实际情况完全吻合，证明本发明方法准确。

序列表

<110>中国水产科学研究院黑龙江水产研究所

<120>一种鉴别哲罗鲑遗传性别的分子标记以及鉴别方法

<130>线1

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>153

<212>dna

<213>哲罗鱼属(hucho)

<400>1

tgtcagggttgattacagttcctaaggcatttgcattttatctcatggtagtggttgtgt60

cctgcagcctcccaacagccttgtcgttctgtggagttcatgtgggatgtatatcaatca120

tggctggaggtgtgatgaggaatcagactgcag153

<210>2

<211>251

<212>dna

<213>哲罗鱼属(hucho)

<400>2

cgttcaacctcaccacctcttgttttccccgcctatataccaccgtcgtcagcttaccct60

gtgaaggccctatagtaagcaaaatgggcaaaacccaaaacgtcaggtcgaggtgtagcg120

catggggtgggaagaaatgggctacattctctaaattagagcactacgaaccacgctgtg180

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