专利名称：哲罗鲑c型溶菌酶HtLysC基因及其编码蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及哲罗鲑c型溶菌酶HtLysC基因及其编码蛋白。
背景技术：
溶菌酶是一种能水解粘多糖的碱性酶，它能催化细菌细胞壁中粘多糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的P _1，4糖苷键的水解，导致细菌细胞壁破裂、内容物逸出而使细菌死亡。目前，一般将溶菌酶分为六类:(1)鸡型溶菌酶，又称c型溶菌酶(c-type)，包括来自于胃的溶菌酶和结合钙离子的溶菌酶；(2)鹅型溶菌酶，又称g型溶菌酶(g-type) ； (3)植物溶菌酶；(4)细菌溶菌酶；(5)T4噬菌体溶菌酶；(6)无脊椎动物溶菌酶。此外溶菌酶还可诱导调节机体其他免疫因子的合成与分泌、协同其它免疫因子进行防御免疫。哲罗鲑，Huchotaimen (pallas),属鲑形目 Samoniformes、鲑科 Salmonidea、哲罗鱼属Hucho，是冷水性的凶猛肉食性鱼类，也是鲑科鱼类中个体最大、生长速度最快的鱼类。目前哲罗鱼的野生资源基本枯竭，1998年被我国列入中国濒危动物红皮书，属于易危物种，2004年被列入中国物种红色名录 ，受到全世界的关注。
发明内容
本发明的目的是提供哲罗鲑c型溶菌酶HtLysC基因及其编码蛋白。本发明的哲罗鲑c型溶菌酶HtLysC基因的基因序列如序列表Seq ID No:l所示。本发明的哲罗鲑c型溶菌酶HtLysC基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表SeqID No:2 所示。本发明的有益效果:本发明通过RT-PCR和RACE技术从哲罗鲑中克隆到一种c型溶菌酶基因，命名为HtLysC，并对其结构、同源性、进化以及编码蛋白特性进行分析。鉴于该基因在哲罗鲑非特异性免疫防御方面具有重要功能，可用于溶菌酶的重组表达和基因转移，并为哲罗鲑的病害防治、基因辅助选育及进一步开发为医药产品奠定基础，具有广阔的应用前景。
图1为哲罗鲑c型溶菌酶HtLysC基因序列及其演绎的氨基酸序列分析图；图2为哲罗鲑溶菌酶氨基酸序列比对结果；图3为基于NJ法构建的不同生物c型溶菌酶系统进化树。
具体实施例方式具体实施方式
一:本实施方式的哲罗鲑c型溶菌酶HtLysc基因的基因序列如序列表 Seq ID No:1 所示。本实施方式的有益效果:
本实施方式通过RT-PCR和RACE技术从哲罗鲑中克隆到一种c型溶菌酶基因，命名为HtLysC，并对其结构、同源性、进化以及编码蛋白特性进行分析。鉴于该基因在哲罗鲑非特异性免疫防御方面具有重要功能，可用于溶菌酶的重组表达和基因转移，并为哲罗鲑的病害防治、基因辅助选育及进一步开发为医药产品奠定基础，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
二:本实施方式的哲罗鲑c型溶菌酶HtLysC基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No:2所不。通过以下试验验证本发明的效果:UHtLysc基因序列的获得一、取哲罗鲑脾脏并用Trizol(Invitrogen)试剂提取总RNA,反转录合成cDNA ；二、以获得的cDNA为模板通过F与R引物扩增哲罗鲑溶菌酶基因，PCR反应条件如下:95°C预变性3min，94°C变性30s，58。。退火30s，72。。延伸lmin，共30循环，再72°C延伸IOmin,琼脂糖凝胶电泳检测结果后将PCR产物回收，并将其连接到载体pMD18-T (TAKARA)上，转化大肠杆菌感受态细胞(DH5 a )，PCR鉴定后送至上海生工测序；其中，引物F的序列为ACTGGATCCATGAGAGCTGT TGTT ;引物R的序列为ATTGAATTCTTAGACCCCGC AGCCA ;哲罗鲑为黑龙江水产研究所渤海试验站冷水鱼养殖基地提供。测序结果表明哲罗鲑c型溶菌酶HtLysC基因具有序列表中Seq ID No:1的核苷酸序列，序列表中的Seq ID No:1由792个碱基组成，并编码具有序列表中Seq ID No:2的氨基酸序列的蛋白质。2、HtLysC基因序列的分析将获得的哲罗鲑溶菌酶的全长cDNA用ORF Finder确定正确的开放阅读框，并翻译成氨基酸序列；用B LAST程序与GenBank、EMBL、DDBJ及PDB数据库中的序列进行比较；用CDD软件来分析哲罗鲑溶菌酶结构域；用PSORT II软件预测溶菌酶亚细胞定位情况；用Signal P4.0来分析哲罗鲑溶菌酶的信号肽及切割位点；用ProtParam来预测序列的分子式、分子量和理论等电点；将获得的哲罗鲑溶菌酶氨基酸序列和其它动物c型溶菌酶序列进行Clustal W比对，然后用MEGA4.0构建不同生物基于c型溶菌酶序列的分子系统发育树。序列分析的结果如下:(I)利用RT-PCR和RACE技术得到的哲罗鲑c型溶菌酶基因序列及其演绎的氨基酸序列分析图如图1所示，从图1可以得出，从哲罗鲑中扩增到c型溶菌酶的全长cDNA序列792bp，其中完整开放阅读框435bp，5’非编码区129bp，3’非编码区228bp，在3’端的非编码区中有真核基因PolyA加尾信号序列AATAA的出现，其编码蛋白含有144个氨基酸，成熟肽包括129个氨基酸，其中含有c型溶菌酶特有的两个活性中心Glu50和Asp67，以及8个保守结构Cys残基。成熟肽分子式为C617H961N185O191S9,分子量为14.3kDa，理论等电点为
8.66。经SMART分析，该基因具有I个溶菌酶(LYZl)结构域(16_140aa)。(2)经Clustal W比对分析，哲罗鲑溶菌酶氨基酸序列比对结果如图2所示，从图2可以看出，哲罗鲑溶菌酶氨基酸序列与大西洋鲑、虹鳟的溶菌酶具有高度同源性，其序列一致性分别为93%和96.5% ;与美洲红点鲑溶菌酶一致性为71.5% ;与斑马鱼溶菌酶一致性仅为37.4%。(3)基于NJ法构建的不同生物c型溶菌酶系统进化树如图3所示，图3表明HtLysC与虹鳟和大西洋鲑单独聚成一支，与大西洋鲷遗传距离最远。
权利要求
1.哲罗鲑C型溶菌酶HtLysC基因，其特征在于哲罗鲑c型溶菌酶HtLysC基因的基因序列如序列表Seq ID No: I所不。
2.如权利要求1所述的哲罗鲑c型溶菌酶HtLysC基因的编码蛋白，其特征在于哲罗鲑c型溶菌酶HtLysC基因编 码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No:2所示。
全文摘要
哲罗鲑c型溶菌酶HtLysC基因及其编码蛋白，它涉及哲罗鲑c型溶菌酶HtLysC基因及其编码蛋白。本发明提供了哲罗鲑c型溶菌酶HtLysC基因及其编码蛋白。本发明的哲罗鲑c型溶菌酶HtLysC基因的基因序列如序列表Seq ID No1所示。本发明的哲罗鲑c型溶菌酶HtLysC基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No2所示。本发明哲罗鲑c型溶菌酶HtLysC基因在哲罗鲑非特异性免疫防御方面具有重要功能，可用于溶菌酶的重组表达和基因转移，并为哲罗鲑的病害防治、基因辅助选育及进一步开发为医药产品奠定基础，具有广阔的应用前景。
文档编号C12N9/36GK103074352SQ20131004787
公开日2013年5月1日 申请日期2013年2月6日 优先权日2013年2月6日
发明者李绍戊, 王荻, 刘红柏, 卢彤岩, 佟广香, 尹家胜 申请人:中国水产科学研究院黑龙江水产研究所