本发明涉及ⅰ型胶原和角蛋白的制备工艺，尤其涉及一种增强成骨细胞能力的牦牛胶制备方法。
背景技术：
成骨细胞起源于多能的骨髓基质中的间充质干细胞，是骨形成的主要功能细胞，具有骨基质的合成、分泌和矿化功能。成骨细胞在体外培养系统中要经历细胞增殖、细胞外基质成熟和基质矿化3个时期。ⅰ型胶原蛋白（col－ⅰ）和一些非胶原蛋白是成骨细胞分化的标记物，能反映成骨细胞分化表型特征。成骨细胞可被不同种类的激素及生长因子激活，刺激dna和胶原的合成(aronow等，1990)。成骨细胞是体内造血诱导微循环的重要成分，可表达多种黏附分子。
col－ⅰ是由成骨细胞分泌且受力学调控的一种最基本的基质蛋白。在骨折愈合过程中，col－ⅰ通过酶介导方式起到抵抗组织应变的作用，从而增强骨强度。当成骨细胞处于矿化阶段时，col－ⅰ，ocn与opn等基因表达水平达到峰值，细胞外基质成熟后形成钙沉积，成骨细胞被包埋其中形成骨组织。
col－ⅰ对维持骨结构的完整及骨生物力学特性非常重要。骨质疏松症是以低骨量、微结构改变、骨脆性增加为特点的全身性代谢性骨病。胶原，尤其是col－ⅰ结构及数量的改变与骨质疏松症发生、发展、严重程度密切相关。col－ⅰ构成结缔组织的骨架，在祖细胞形成新骨过程中具有重要作用。
角蛋白具有独特的分子结构，并具有可降解性和生物相容性，与骨骼有很好的亲和力，胱氨酸和极性氨基酸含量高。牛毛主要是由角蛋白组成，具有氨基酸长链，角蛋白类似于胶原，有两种主要蛋白，一种为含硫元素较多的细胞间质蛋白，含有胱氨酸；另一种为含硫较少的纤维质蛋白。胱氨酸是一种含硫氨基酸，多含于角蛋白中，是人体必需的氨基酸之一，对人体没有不良效果。医药上有促进机体细胞氧化和还原机能，增加白血球和阻止病原菌发育等作用，也用于痢疾、伤寒、流感等急性传染病、气喘、神经痛、湿疹以及各种中毒疾患等，并有维持蛋白质构型的作用。
骨髓基质细胞起源于胚胎发育的间充质干细胞，是成体骨髓中的一类多能干细胞，具有多向分化潜能，并具有分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和其他几种结缔组织细胞的潜能。
牦牛是青藏高原特有牛种，目前，对于牦牛皮的研究一直是以脱毛后的皮进行，忽略了牦牛毛的作用。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种方法简单、易于实施的增强成骨细胞能力的牦牛胶制备方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种增强成骨细胞能力的牦牛胶制备方法，包括以下步骤：
⑴将新鲜带离皮1~2厘米毛的青藏高原牦牛皮清洗干净，经紫外灯照射，得到辐照后的牦牛皮；
⑵所述辐照后的牦牛皮切割成1~3cm的块，沸水中提取5~30分钟后取出，用多刺板刺穿牦牛皮；
⑶将所述步骤⑵所得的牦牛皮放入质量浓度为1%~10%的酶解液中酶解，过滤，分别得到酶解后的牦牛皮和第一次酶解溶液；所述牦牛皮与所述酶解液的质量比为1：10~1：20；
⑷所述酶解后的牦牛皮中加入其质量8~15倍的水煮沸5~40分钟，得到滤液；
⑸所述滤液中加入其质量3~10%的活性炭，充分搅拌后静置0.5~8小时，过滤，得到滤渣；
⑹所述滤渣放入质量浓度为0.5%~8%的酶解液中酶解，过滤，得到第二次酶解溶液；所述滤渣与所述酶解液的质量比为1：8~1：15；
⑺将所述第一次酶解溶液与所述第二次酶解溶液合并后煮沸5~40分钟，经离心分离，得到上清液；
⑻所述上清液采用串联式膜分离，截取分子量为72~130kda的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白，该牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白经干燥，即得牦牛胶。
所述步骤⑴中紫外灯照射条件是指辐射波长为200nm~275nm，照射时间为0.3~2.0小时。
所述步骤⑶中质量浓度为1%~10%的酶解液是指在1l去离子水中加入10~100g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。
所述步骤⑶中酶解条件是指温度为30~45℃，时间为0.5~8小时。
所述步骤⑹中质量浓度为0.5%~8%的酶解液是指在1l去离子水中加入5~80g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。
所述步骤⑹中酶解条件是指温度为30~60℃，时间为0.5~12小时。
所述蛋白酶是指菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、巯基蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、链霉菌角质蛋白酶、酵母菌酶中的一种或两种及以上的复合物。
所述步骤⑺中离心分离的条件是指速率为15000~25000rpm，时间为5~60min。
所述步骤⑻中串联式膜分离是指将数个孔径为0.01~200μm的超滤膜设备串联在一起。
所述步骤⑻中冷冻干燥的条件是指温度为-10~-50℃，时间为2~48小时。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明中的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白是以青藏高原特有牛种牦牛带毛的皮为原料，经分离后得到的分子量为72~130kda的纯天然的ⅰ型胶原和角蛋白。牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白的开发，使青藏高原的特有资源牦牛得到更好利用。
2、本发明所制备的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白，可通过影响骨髓基质细胞的周期、黏附和迁移能力达到促进骨髓基质细胞增殖的作用，能显著促进骨髓基质细胞的黏附和迁移能力，使得更多的骨髓基质细胞进入分裂期。其完成成骨细胞周期循环全过程为53.22%，显著促进成骨细胞增殖，对骨髓有核细胞数增加到2.47×107个/l，对骨髓细胞粘附力为55.4%，对骨髓基细胞迁移能力24小时达到17.07%，48小时达到21.68%。
3、本发明所制备的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白经药效学实验证明，牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白在g2/m期的分布比例明显升高，利于细胞黏附、增值及分化能力增强，大鼠成骨细胞增殖能力提高，细胞活性增强.具有提高大鼠成骨细胞增殖能力以及增强其细胞活性的作用。
①牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对成骨细胞增殖能力的影响：
取200mg/ml的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白预先加入6孔板中预热，每组3个复孔，接种细胞悬液接至内含盖玻片的6孔板中；co2培养箱中培养过夜，使细胞长在盖片上；取出盖片，pbs漂洗3次，每次3min，加入固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）固定30min,pbs漂洗3次，每次3min，加入giemsa液染色10min后检测。
结果如表1所示，模型组和空白组相比，成骨细胞的增殖能力显著下降（p<0.01），给药牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白后，能够显著促进成骨细胞增殖，牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白2组和模型组相比有显著性差异。
表1牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对成骨细胞增殖能力的影响(n=10，
注：与空白组相比*p<0.05，**p<0.01；与模型组相比#p<0.05，##p<0.01。
②牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对成骨细胞周期的影响：
取成骨细胞悬液接种96孔板，接种不同细胞密度，每孔100μl，每组3个复孔，置于co2培养箱。第三天全数换液，以后每三天半数换液。细胞培养3d后，mtt法测定成骨细胞的增殖能力连续测五天。细胞的生命过程就是不断地新生和死亡，重要过程就是细胞周期的循环，分为间期和分裂期两个过程。实验结果如表2所示，和空白组相比，牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白处于分裂期的细胞更多（p<0.01），表明牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白能增强成骨细胞的增殖能力，通过促进g2/s期的百分含量促进细胞增殖。
表2牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对成骨细胞周期的影响(n=6,
注：与空白组相比*p<0.05，**p<0.01。
③牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对骨髓有核细胞数的影响：
小鼠随机分成4组，即空白对照组，牦牛皮全胶组，牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白1组，牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白2组，每组10只。于给药7d后末次给药30min后，颈椎脱臼处死小鼠，游离洁净股骨、胫骨，置于4℃、10mlpbs液培养皿中，5mlpbs冲洗两遍；分别于骨两端剪去约2mm，暴露骨髓腔，用10ml注射器、0.5ml注射器针头，插入髓腔，以4℃、8mlimdm培养基冲出骨髓细胞于15ml离心管中，10mlpbs洗涤，250g，10min，弃上清，5mlpbs洗涤，250g,10min离心，弃上清，得到骨髓单核细胞悬液，计数各组小鼠的骨髓有核细胞数。接种骨髓单核细胞至96孔板，37℃，5%co2培养24h后，加入10μlmtt（5mg/ml）后继续培养4h加入三联液，放置过夜，于570nm处测定吸光度值。
结果如表3所示，和空白组相比，模型组小鼠骨髓有核细胞的数目显著减少（p<0.01），各给药组和模型组相比，骨髓有核细胞数目显著增多（p<0.05），尤其是牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白2组，骨髓有核细胞数目增多明显。
表3牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对骨髓有核细胞数的影响(n=10,
注：与空白组相比*p<0.05，**p<0.01；与模型组相比#p<0.05，##p<0.01。
④牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对骨髓基细胞粘附力的影响：
取180mg/ml的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白预先加入6孔板中预热，将单个骨髓细胞以以每孔2ml的体积培养于加药的6孔板中，分别于培养的第3天半量换液、第5天全量换液，在第4天时吸出培养液，pbs轻轻冲洗2次除去悬浮细胞，各孔加入细胞密度5×105/ml正常小鼠制备的单个细胞悬液1ml，37℃、5%co2培养箱培养2h后，用培养液轻轻冲洗2次，收集并计数未粘附的骨髓细胞。
细胞粘附指活细胞内一些和细胞骨架有关的蛋白发生重组，从而使得细胞发生聚集形成细胞团或者组织的过程，反映了细胞在体外培养逐渐趋于稳定，对进一步的细胞增殖和运动具有重要的作用。实验结果如表4所示，和空白对照组相比，牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白能显著增强骨髓基质细胞的黏附能力（p<0.01）。
表4牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对骨髓细胞粘附力的影响(n=6,
注：与空白组相比*p<0.05，**p<0.01。
⑤牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对骨髓基细胞迁移能力的影响
取骨髓单核细胞悬液以每孔2ml的体积接种于做好标记的6孔板，加入180mg/ml的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白，培养至80%的细胞贴壁，取出6孔板，用10μl枪头比着直尺，垂直于底面的横线横线划痕；用pbs缓冲液清洗细胞3次，洗去划痕产生的细胞碎片；加入无血清培养基，置于co2培养箱培养24、48h时拍照，计算细胞迁移率。
细胞的迁移能力对活细胞至关重要，是在细胞黏附作用发挥的基础上，骨髓基质细胞黏附和迁移能力的增强意味着骨髓细胞增殖、分化、成熟的进程加快。
实验结果如表5所示，空白组在培养24h和48h后，划痕宽度几乎没有变化，细胞迁移能力弱，但各给药组在培养24h和48h后，划痕不同程度上都有变窄，尤其2组，划痕中迁移的细胞明显增多，2组在培养48h后，划痕愈合明显。牦牛皮胶给药后，骨髓基质细胞培养24h和48h后迁移能力和空白对照组相比增强明显（p<0.01），说明牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白能增强骨髓基质细胞的迁移能力，其中2组迁移能力增加显著（p<0.01）。
表5牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对骨髓细胞迁移能力的影响(n=6,
注：与空白组相比*p<0.05，**p<0.01。
4、本发明方法简单，易于实施。
具体实施方式
实施例1一种增强成骨细胞能力的牦牛胶制备方法，包括以下步骤：
⑴将新鲜带毛的青藏高原牦牛皮（保留距离皮2厘米的毛）清洗干净，以275nm辐射波长经紫外灯照射，照射时间为2.0小时，得到辐照后的牦牛皮。
⑵辐照后的牦牛皮切割成3cm的块，沸水中提取30分钟后取出，用多刺板刺穿牦牛皮。
⑶将步骤⑵所得的牦牛皮放入质量浓度为10%的酶解液中，于45℃酶解8小时，过滤，分别得到酶解后的牦牛皮和第一次酶解溶液。
其中：质量浓度为10%的酶解液是指在1l去离子水中加入100g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指65g巯基蛋白酶、2g碱性蛋白酶、10g复合蛋白酶、18g链霉菌角质蛋白酶、5g酵母菌酶混合而成。
牦牛皮与酶解液的质量比（g/g）为1：10。
⑷酶解后的牦牛皮中加入其质量8倍的水煮沸40分钟，得到滤液。
⑸滤液中加入其质量3%的活性炭，充分搅拌后静置0.5小时，过滤，得到滤渣。
⑹滤渣放入质量浓度为8%的酶解液，于60℃酶解12小时，过滤，得到第二次酶解溶液。
其中：质量浓度为8%的酶解液是指在1l去离子水中加入80g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指7g菠萝蛋白酶、14g胃蛋白酶、23g胰蛋白酶、18g组织蛋白酶、6g木瓜蛋白酶、12g枯草杆菌蛋白酶混合而成。
滤渣与酶解液的质量比（g/g）为1：8。
⑺将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸40分钟，以15000rpm的速率离心分离5min，得到上清液。
⑻上清液采用串联式膜分离，截取分子量为95~120kda的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白，该牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白于-10℃冷冻干燥2小时，即得牦牛胶。
其中：串联式膜分离是指将数个孔径为0.01~50μm的超滤膜设备串联在一起。
实施例2一种增强成骨细胞能力的牦牛胶制备方法，包括以下步骤：
⑴将新鲜带毛的青藏高原牦牛皮（保留距离皮1厘米的毛）清洗干净，以200nm辐射波长经紫外灯照射，照射时间为0.3小时，得到辐照后的牦牛皮。
⑵辐照后的牦牛皮切割成1cm的块，沸水中提取5分钟后取出，用多刺板刺穿牦牛皮。
⑶将步骤⑵所得的牦牛皮放入质量浓度为1%的酶解液中，于30℃酶解0.5小时，过滤，分别得到酶解后的牦牛皮和第一次酶解溶液。
其中：质量浓度为1%的酶解液是指在1l去离子水中加入10g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指1g菠萝蛋白酶、2g胃蛋白酶、0.5g胰蛋白酶、2.5g组织蛋白酶、3g木瓜蛋白酶、1g枯草杆菌蛋白酶混合而成。
牦牛皮与酶解液的质量比（g/g）为1：20。
⑷酶解后的牦牛皮中加入其质量15倍的水煮沸5分钟，得到滤液。
⑸滤液中加入其质量10%的活性炭，充分搅拌后静置8小时，过滤，得到滤渣。
⑹滤渣放入质量浓度为0.5%的酶解液，于30℃酶解0.5小时，过滤，得到第二次酶解溶液。
其中：质量浓度为0.5%的酶解液是指在1l去离子水中加入5g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指3.5g巯基蛋白酶、0.1g碱性蛋白酶、0.2g复合蛋白酶、0.8g链霉菌角质蛋白酶、0.4g酵母菌酶混合而成。
滤渣与酶解液的质量比（g/g）为1：15。
⑺将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸5分钟，以25000rpm的速率离心分离60min，得到上清液。
⑻上清液采用串联式膜分离，截取分子量为75~100kda的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白，该牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白于-50℃冷冻干燥48小时，即得牦牛胶。
其中：串联式膜分离是指将数个孔径为0.01~100μm的超滤膜设备串联在一起。
实施例3一种增强成骨细胞能力的牦牛胶制备方法，包括以下步骤：
⑴将新鲜带毛的青藏高原牦牛皮（保留距离皮1.5厘米的毛）清洗干净，以223nm辐射波长经紫外灯照射，照射时间为1.0小时，得到辐照后的牦牛皮。
⑵辐照后的牦牛皮切割成2cm的块，沸水中提取15分钟后取出，用多刺板刺穿牦牛皮。
⑶将步骤⑵所得的牦牛皮放入质量浓度为5%的酶解液中，于40℃酶解4小时，过滤，分别得到酶解后的牦牛皮和第一次酶解溶液。
其中：质量浓度为5%的酶解液是指在1l去离子水中加入50g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指10g枯草杆菌蛋白酶、18g巯基蛋白酶、22g碱性蛋白酶混合而成。
牦牛皮与酶解液的质量比（g/g）为1：15。
⑷酶解后的牦牛皮中加入其质量12倍的水煮沸20分钟，得到滤液。
⑸滤液中加入其质量5%的活性炭，充分搅拌后静置4小时，过滤，得到滤渣。
⑹滤渣放入质量浓度为6%的复合蛋白酶酶解液，于50℃酶解6小时，过滤，得到第二次酶解溶液。
其中：质量浓度为6%的复合蛋白酶酶解液是指在1l去离子水中加入60g复合蛋白酶，混合均匀而得的溶液。
滤渣与酶解液的质量比（g/g）为1：10。
⑺将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸30分钟，以20000rpm的速率离心分离20min，得到上清液。
⑻上清液采用串联式膜分离，截取分子量为85~130kda的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白，该牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白于-30℃冷冻干燥24小时，即得牦牛胶。
其中：串联式膜分离是指将数个孔径为0.01~200μm的超滤膜设备串联在一起。
实施例4一种增强成骨细胞能力的牦牛胶制备方法，包括以下步骤：
⑴将新鲜带毛的青藏高原牦牛皮（保留距离皮2厘米的毛）清洗干净，以245nm辐射波长经紫外灯照射，照射时间为0.5小时，得到辐照后的牦牛皮。
⑵辐照后的牦牛皮切割成3cm的块，沸水中提取10分钟后取出，用多刺板刺穿牦牛皮。
⑶将步骤⑵所得的牦牛皮放入质量浓度为4%的巯基蛋白酶酶解液中，于45℃酶解7小时，过滤，分别得到酶解后的牦牛皮和第一次酶解溶液。
其中：质量浓度为4%的巯基蛋白酶酶解液是指在1l去离子水中加入40g巯基蛋白酶蛋白酶，混合均匀而得的溶液。
牦牛皮与酶解液的质量比（g/g）为1：16。
⑷酶解后的牦牛皮中加入其质量12倍的水煮沸10分钟，得到滤液。
⑸滤液中加入其质量8%的活性炭，充分搅拌后静置2.5小时，过滤，得到滤渣。
⑹滤渣放入质量浓度为7%的菠萝蛋白酶酶解液，于60℃酶解8小时，过滤，得到第二次酶解溶液。
其中：质量浓度为7%的菠萝蛋白酶酶解液是指在1l去离子水中加入70g菠萝蛋白酶，混合均匀而得的溶液。
滤渣与酶解液的质量比（g/g）为1：15。
⑺将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸15分钟，以23000rpm的速率离心分离10min，得到上清液。
⑻上清液采用串联式膜分离，截取分子量为85~125kda的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白，该牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白于-45℃冷冻干燥36小时，即得牦牛胶。
其中：串联式膜分离是指将数个孔径为0.01~0.22μm的超滤膜设备串联在一起。
实施例5一种增强成骨细胞能力的牦牛胶制备方法，包括以下步骤：
⑴将新鲜带毛的青藏高原牦牛皮（保留距离皮2厘米的毛）清洗干净，以225nm辐射波长经紫外灯照射，照射时间为1.5小时，得到辐照后的牦牛皮。
⑵辐照后的牦牛皮切割成1cm的块，沸水中提取25分钟后取出，用多刺板刺穿牦牛皮。
⑶将步骤⑵所得的牦牛皮放入质量浓度为5.5%的酶解液中，于40℃酶解0.5小时，过滤，分别得到酶解后的牦牛皮和第一次酶解溶液。
其中：质量浓度为5.5%的酶解液是指在1l去离子水中加入55g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指2.5g菠萝蛋白酶、12g链霉菌角质蛋白酶、5g酵母菌酶、3.5g胃蛋白酶、8.5g胰蛋白酶、7g组织蛋白酶、11g木瓜蛋白酶、5.5g枯草杆菌蛋白酶混合而成。
牦牛皮与酶解液的质量比（g/g）为1：18。
⑷酶解后的牦牛皮中加入其质量11倍的水煮沸10分钟，得到滤液。
⑸滤液中加入其质量7.5%的活性炭，充分搅拌后静置6小时，过滤，得到滤渣。
⑹滤渣放入质量浓度为2%的酶解液，于55℃酶解12小时，过滤，得到第二次酶解溶液。
其中：质量浓度为2%的酶解液是指在1l去离子水中加入20g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。
蛋白酶是指6.5g巯基蛋白酶、3.5g碱性蛋白酶、10g复合蛋白酶混合而成。
滤渣与酶解液的质量比（g/g）为1：15。
⑺将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸20分钟，以18000rpm的速率离心分离17min，得到上清液。
⑻上清液采用串联式膜分离，截取分子量为72~130kda的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白，该牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白于-26℃冷冻干燥12小时，即得牦牛胶。
其中：串联式膜分离是指将数个孔径为0.01~0.5μm的超滤膜设备串联在一起。
上述实施例1~5中，蛋白酶是指菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、巯基蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、链霉菌角质蛋白酶、酵母菌酶中的一种或两种及以上的复合物。