一种增强成骨细胞能力的牦牛胶制备方法与流程

文档序号:18670321发布日期:2019-09-13 21:04阅读:426来源:国知局

本发明涉及ⅰ型胶原和角蛋白的制备工艺,尤其涉及一种增强成骨细胞能力的牦牛胶制备方法。



背景技术:

成骨细胞起源于多能的骨髓基质中的间充质干细胞,是骨形成的主要功能细胞,具有骨基质的合成、分泌和矿化功能。成骨细胞在体外培养系统中要经历细胞增殖、细胞外基质成熟和基质矿化3个时期。ⅰ型胶原蛋白(col-ⅰ)和一些非胶原蛋白是成骨细胞分化的标记物,能反映成骨细胞分化表型特征。成骨细胞可被不同种类的激素及生长因子激活,刺激dna和胶原的合成(aronow等,1990)。成骨细胞是体内造血诱导微循环的重要成分,可表达多种黏附分子。

col-ⅰ是由成骨细胞分泌且受力学调控的一种最基本的基质蛋白。在骨折愈合过程中,col-ⅰ通过酶介导方式起到抵抗组织应变的作用,从而增强骨强度。当成骨细胞处于矿化阶段时,col-ⅰ,ocn与opn等基因表达水平达到峰值,细胞外基质成熟后形成钙沉积,成骨细胞被包埋其中形成骨组织。

col-ⅰ对维持骨结构的完整及骨生物力学特性非常重要。骨质疏松症是以低骨量、微结构改变、骨脆性增加为特点的全身性代谢性骨病。胶原,尤其是col-ⅰ结构及数量的改变与骨质疏松症发生、发展、严重程度密切相关。col-ⅰ构成结缔组织的骨架,在祖细胞形成新骨过程中具有重要作用。

角蛋白具有独特的分子结构,并具有可降解性和生物相容性,与骨骼有很好的亲和力,胱氨酸和极性氨基酸含量高。牛毛主要是由角蛋白组成,具有氨基酸长链,角蛋白类似于胶原,有两种主要蛋白,一种为含硫元素较多的细胞间质蛋白,含有胱氨酸;另一种为含硫较少的纤维质蛋白。胱氨酸是一种含硫氨基酸,多含于角蛋白中,是人体必需的氨基酸之一,对人体没有不良效果。医药上有促进机体细胞氧化和还原机能,增加白血球和阻止病原菌发育等作用,也用于痢疾、伤寒、流感等急性传染病、气喘、神经痛、湿疹以及各种中毒疾患等,并有维持蛋白质构型的作用。

骨髓基质细胞起源于胚胎发育的间充质干细胞,是成体骨髓中的一类多能干细胞,具有多向分化潜能,并具有分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和其他几种结缔组织细胞的潜能。

牦牛是青藏高原特有牛种,目前,对于牦牛皮的研究一直是以脱毛后的皮进行,忽略了牦牛毛的作用。



技术实现要素:

本发明所要解决的技术问题是提供一种方法简单、易于实施的增强成骨细胞能力的牦牛胶制备方法。

为解决上述问题,本发明所述的一种增强成骨细胞能力的牦牛胶制备方法,包括以下步骤:

⑴将新鲜带离皮1~2厘米毛的青藏高原牦牛皮清洗干净,经紫外灯照射,得到辐照后的牦牛皮;

⑵所述辐照后的牦牛皮切割成1~3cm的块,沸水中提取5~30分钟后取出,用多刺板刺穿牦牛皮;

⑶将所述步骤⑵所得的牦牛皮放入质量浓度为1%~10%的酶解液中酶解,过滤,分别得到酶解后的牦牛皮和第一次酶解溶液;所述牦牛皮与所述酶解液的质量比为1:10~1:20;

⑷所述酶解后的牦牛皮中加入其质量8~15倍的水煮沸5~40分钟,得到滤液;

⑸所述滤液中加入其质量3~10%的活性炭,充分搅拌后静置0.5~8小时,过滤,得到滤渣;

⑹所述滤渣放入质量浓度为0.5%~8%的酶解液中酶解,过滤,得到第二次酶解溶液;所述滤渣与所述酶解液的质量比为1:8~1:15;

⑺将所述第一次酶解溶液与所述第二次酶解溶液合并后煮沸5~40分钟,经离心分离,得到上清液;

⑻所述上清液采用串联式膜分离,截取分子量为72~130kda的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白,该牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白经干燥,即得牦牛胶。

所述步骤⑴中紫外灯照射条件是指辐射波长为200nm~275nm,照射时间为0.3~2.0小时。

所述步骤⑶中质量浓度为1%~10%的酶解液是指在1l去离子水中加入10~100g蛋白酶,混合均匀而得的溶液。

所述步骤⑶中酶解条件是指温度为30~45℃,时间为0.5~8小时。

所述步骤⑹中质量浓度为0.5%~8%的酶解液是指在1l去离子水中加入5~80g蛋白酶,混合均匀而得的溶液。

所述步骤⑹中酶解条件是指温度为30~60℃,时间为0.5~12小时。

所述蛋白酶是指菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、巯基蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、链霉菌角质蛋白酶、酵母菌酶中的一种或两种及以上的复合物。

所述步骤⑺中离心分离的条件是指速率为15000~25000rpm,时间为5~60min。

所述步骤⑻中串联式膜分离是指将数个孔径为0.01~200μm的超滤膜设备串联在一起。

所述步骤⑻中冷冻干燥的条件是指温度为-10~-50℃,时间为2~48小时。

本发明与现有技术相比具有以下优点:

1、本发明中的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白是以青藏高原特有牛种牦牛带毛的皮为原料,经分离后得到的分子量为72~130kda的纯天然的ⅰ型胶原和角蛋白。牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白的开发,使青藏高原的特有资源牦牛得到更好利用。

2、本发明所制备的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白,可通过影响骨髓基质细胞的周期、黏附和迁移能力达到促进骨髓基质细胞增殖的作用,能显著促进骨髓基质细胞的黏附和迁移能力,使得更多的骨髓基质细胞进入分裂期。其完成成骨细胞周期循环全过程为53.22%,显著促进成骨细胞增殖,对骨髓有核细胞数增加到2.47×107个/l,对骨髓细胞粘附力为55.4%,对骨髓基细胞迁移能力24小时达到17.07%,48小时达到21.68%。

3、本发明所制备的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白经药效学实验证明,牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白在g2/m期的分布比例明显升高,利于细胞黏附、增值及分化能力增强,大鼠成骨细胞增殖能力提高,细胞活性增强.具有提高大鼠成骨细胞增殖能力以及增强其细胞活性的作用。

①牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对成骨细胞增殖能力的影响:

取200mg/ml的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白预先加入6孔板中预热,每组3个复孔,接种细胞悬液接至内含盖玻片的6孔板中;co2培养箱中培养过夜,使细胞长在盖片上;取出盖片,pbs漂洗3次,每次3min,加入固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)固定30min,pbs漂洗3次,每次3min,加入giemsa液染色10min后检测。

结果如表1所示,模型组和空白组相比,成骨细胞的增殖能力显著下降(p<0.01),给药牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白后,能够显著促进成骨细胞增殖,牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白2组和模型组相比有显著性差异。

表1牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对成骨细胞增殖能力的影响(n=10,)

注:与空白组相比*p<0.05,**p<0.01;与模型组相比#p<0.05,##p<0.01。

②牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对成骨细胞周期的影响:

取成骨细胞悬液接种96孔板,接种不同细胞密度,每孔100μl,每组3个复孔,置于co2培养箱。第三天全数换液,以后每三天半数换液。细胞培养3d后,mtt法测定成骨细胞的增殖能力连续测五天。细胞的生命过程就是不断地新生和死亡,重要过程就是细胞周期的循环,分为间期和分裂期两个过程。实验结果如表2所示,和空白组相比,牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白处于分裂期的细胞更多(p<0.01),表明牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白能增强成骨细胞的增殖能力,通过促进g2/s期的百分含量促进细胞增殖。

表2牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对成骨细胞周期的影响(n=6,)

注:与空白组相比*p<0.05,**p<0.01。

③牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对骨髓有核细胞数的影响:

小鼠随机分成4组,即空白对照组,牦牛皮全胶组,牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白1组,牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白2组,每组10只。于给药7d后末次给药30min后,颈椎脱臼处死小鼠,游离洁净股骨、胫骨,置于4℃、10mlpbs液培养皿中,5mlpbs冲洗两遍;分别于骨两端剪去约2mm,暴露骨髓腔,用10ml注射器、0.5ml注射器针头,插入髓腔,以4℃、8mlimdm培养基冲出骨髓细胞于15ml离心管中,10mlpbs洗涤,250g,10min,弃上清,5mlpbs洗涤,250g,10min离心,弃上清,得到骨髓单核细胞悬液,计数各组小鼠的骨髓有核细胞数。接种骨髓单核细胞至96孔板,37℃,5%co2培养24h后,加入10μlmtt(5mg/ml)后继续培养4h加入三联液,放置过夜,于570nm处测定吸光度值。

结果如表3所示,和空白组相比,模型组小鼠骨髓有核细胞的数目显著减少(p<0.01),各给药组和模型组相比,骨髓有核细胞数目显著增多(p<0.05),尤其是牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白2组,骨髓有核细胞数目增多明显。

表3牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对骨髓有核细胞数的影响(n=10,)

注:与空白组相比*p<0.05,**p<0.01;与模型组相比#p<0.05,##p<0.01。

④牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对骨髓基细胞粘附力的影响:

取180mg/ml的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白预先加入6孔板中预热,将单个骨髓细胞以以每孔2ml的体积培养于加药的6孔板中,分别于培养的第3天半量换液、第5天全量换液,在第4天时吸出培养液,pbs轻轻冲洗2次除去悬浮细胞,各孔加入细胞密度5×105/ml正常小鼠制备的单个细胞悬液1ml,37℃、5%co2培养箱培养2h后,用培养液轻轻冲洗2次,收集并计数未粘附的骨髓细胞。

细胞粘附指活细胞内一些和细胞骨架有关的蛋白发生重组,从而使得细胞发生聚集形成细胞团或者组织的过程,反映了细胞在体外培养逐渐趋于稳定,对进一步的细胞增殖和运动具有重要的作用。实验结果如表4所示,和空白对照组相比,牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白能显著增强骨髓基质细胞的黏附能力(p<0.01)。

表4牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对骨髓细胞粘附力的影响(n=6,)

注:与空白组相比*p<0.05,**p<0.01。

⑤牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对骨髓基细胞迁移能力的影响

取骨髓单核细胞悬液以每孔2ml的体积接种于做好标记的6孔板,加入180mg/ml的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白,培养至80%的细胞贴壁,取出6孔板,用10μl枪头比着直尺,垂直于底面的横线横线划痕;用pbs缓冲液清洗细胞3次,洗去划痕产生的细胞碎片;加入无血清培养基,置于co2培养箱培养24、48h时拍照,计算细胞迁移率。

细胞的迁移能力对活细胞至关重要,是在细胞黏附作用发挥的基础上,骨髓基质细胞黏附和迁移能力的增强意味着骨髓细胞增殖、分化、成熟的进程加快。

实验结果如表5所示,空白组在培养24h和48h后,划痕宽度几乎没有变化,细胞迁移能力弱,但各给药组在培养24h和48h后,划痕不同程度上都有变窄,尤其2组,划痕中迁移的细胞明显增多,2组在培养48h后,划痕愈合明显。牦牛皮胶给药后,骨髓基质细胞培养24h和48h后迁移能力和空白对照组相比增强明显(p<0.01),说明牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白能增强骨髓基质细胞的迁移能力,其中2组迁移能力增加显著(p<0.01)。

表5牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白对骨髓细胞迁移能力的影响(n=6,)

注:与空白组相比*p<0.05,**p<0.01。

4、本发明方法简单,易于实施。

具体实施方式

实施例1一种增强成骨细胞能力的牦牛胶制备方法,包括以下步骤:

⑴将新鲜带毛的青藏高原牦牛皮(保留距离皮2厘米的毛)清洗干净,以275nm辐射波长经紫外灯照射,照射时间为2.0小时,得到辐照后的牦牛皮。

⑵辐照后的牦牛皮切割成3cm的块,沸水中提取30分钟后取出,用多刺板刺穿牦牛皮。

⑶将步骤⑵所得的牦牛皮放入质量浓度为10%的酶解液中,于45℃酶解8小时,过滤,分别得到酶解后的牦牛皮和第一次酶解溶液。

其中:质量浓度为10%的酶解液是指在1l去离子水中加入100g蛋白酶,混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指65g巯基蛋白酶、2g碱性蛋白酶、10g复合蛋白酶、18g链霉菌角质蛋白酶、5g酵母菌酶混合而成。

牦牛皮与酶解液的质量比(g/g)为1:10。

⑷酶解后的牦牛皮中加入其质量8倍的水煮沸40分钟,得到滤液。

⑸滤液中加入其质量3%的活性炭,充分搅拌后静置0.5小时,过滤,得到滤渣。

⑹滤渣放入质量浓度为8%的酶解液,于60℃酶解12小时,过滤,得到第二次酶解溶液。

其中:质量浓度为8%的酶解液是指在1l去离子水中加入80g蛋白酶,混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指7g菠萝蛋白酶、14g胃蛋白酶、23g胰蛋白酶、18g组织蛋白酶、6g木瓜蛋白酶、12g枯草杆菌蛋白酶混合而成。

滤渣与酶解液的质量比(g/g)为1:8。

⑺将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸40分钟,以15000rpm的速率离心分离5min,得到上清液。

⑻上清液采用串联式膜分离,截取分子量为95~120kda的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白,该牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白于-10℃冷冻干燥2小时,即得牦牛胶。

其中:串联式膜分离是指将数个孔径为0.01~50μm的超滤膜设备串联在一起。

实施例2一种增强成骨细胞能力的牦牛胶制备方法,包括以下步骤:

⑴将新鲜带毛的青藏高原牦牛皮(保留距离皮1厘米的毛)清洗干净,以200nm辐射波长经紫外灯照射,照射时间为0.3小时,得到辐照后的牦牛皮。

⑵辐照后的牦牛皮切割成1cm的块,沸水中提取5分钟后取出,用多刺板刺穿牦牛皮。

⑶将步骤⑵所得的牦牛皮放入质量浓度为1%的酶解液中,于30℃酶解0.5小时,过滤,分别得到酶解后的牦牛皮和第一次酶解溶液。

其中:质量浓度为1%的酶解液是指在1l去离子水中加入10g蛋白酶,混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指1g菠萝蛋白酶、2g胃蛋白酶、0.5g胰蛋白酶、2.5g组织蛋白酶、3g木瓜蛋白酶、1g枯草杆菌蛋白酶混合而成。

牦牛皮与酶解液的质量比(g/g)为1:20。

⑷酶解后的牦牛皮中加入其质量15倍的水煮沸5分钟,得到滤液。

⑸滤液中加入其质量10%的活性炭,充分搅拌后静置8小时,过滤,得到滤渣。

⑹滤渣放入质量浓度为0.5%的酶解液,于30℃酶解0.5小时,过滤,得到第二次酶解溶液。

其中:质量浓度为0.5%的酶解液是指在1l去离子水中加入5g蛋白酶,混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指3.5g巯基蛋白酶、0.1g碱性蛋白酶、0.2g复合蛋白酶、0.8g链霉菌角质蛋白酶、0.4g酵母菌酶混合而成。

滤渣与酶解液的质量比(g/g)为1:15。

⑺将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸5分钟,以25000rpm的速率离心分离60min,得到上清液。

⑻上清液采用串联式膜分离,截取分子量为75~100kda的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白,该牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白于-50℃冷冻干燥48小时,即得牦牛胶。

其中:串联式膜分离是指将数个孔径为0.01~100μm的超滤膜设备串联在一起。

实施例3一种增强成骨细胞能力的牦牛胶制备方法,包括以下步骤:

⑴将新鲜带毛的青藏高原牦牛皮(保留距离皮1.5厘米的毛)清洗干净,以223nm辐射波长经紫外灯照射,照射时间为1.0小时,得到辐照后的牦牛皮。

⑵辐照后的牦牛皮切割成2cm的块,沸水中提取15分钟后取出,用多刺板刺穿牦牛皮。

⑶将步骤⑵所得的牦牛皮放入质量浓度为5%的酶解液中,于40℃酶解4小时,过滤,分别得到酶解后的牦牛皮和第一次酶解溶液。

其中:质量浓度为5%的酶解液是指在1l去离子水中加入50g蛋白酶,混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指10g枯草杆菌蛋白酶、18g巯基蛋白酶、22g碱性蛋白酶混合而成。

牦牛皮与酶解液的质量比(g/g)为1:15。

⑷酶解后的牦牛皮中加入其质量12倍的水煮沸20分钟,得到滤液。

⑸滤液中加入其质量5%的活性炭,充分搅拌后静置4小时,过滤,得到滤渣。

⑹滤渣放入质量浓度为6%的复合蛋白酶酶解液,于50℃酶解6小时,过滤,得到第二次酶解溶液。

其中:质量浓度为6%的复合蛋白酶酶解液是指在1l去离子水中加入60g复合蛋白酶,混合均匀而得的溶液。

滤渣与酶解液的质量比(g/g)为1:10。

⑺将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸30分钟,以20000rpm的速率离心分离20min,得到上清液。

⑻上清液采用串联式膜分离,截取分子量为85~130kda的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白,该牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白于-30℃冷冻干燥24小时,即得牦牛胶。

其中:串联式膜分离是指将数个孔径为0.01~200μm的超滤膜设备串联在一起。

实施例4一种增强成骨细胞能力的牦牛胶制备方法,包括以下步骤:

⑴将新鲜带毛的青藏高原牦牛皮(保留距离皮2厘米的毛)清洗干净,以245nm辐射波长经紫外灯照射,照射时间为0.5小时,得到辐照后的牦牛皮。

⑵辐照后的牦牛皮切割成3cm的块,沸水中提取10分钟后取出,用多刺板刺穿牦牛皮。

⑶将步骤⑵所得的牦牛皮放入质量浓度为4%的巯基蛋白酶酶解液中,于45℃酶解7小时,过滤,分别得到酶解后的牦牛皮和第一次酶解溶液。

其中:质量浓度为4%的巯基蛋白酶酶解液是指在1l去离子水中加入40g巯基蛋白酶蛋白酶,混合均匀而得的溶液。

牦牛皮与酶解液的质量比(g/g)为1:16。

⑷酶解后的牦牛皮中加入其质量12倍的水煮沸10分钟,得到滤液。

⑸滤液中加入其质量8%的活性炭,充分搅拌后静置2.5小时,过滤,得到滤渣。

⑹滤渣放入质量浓度为7%的菠萝蛋白酶酶解液,于60℃酶解8小时,过滤,得到第二次酶解溶液。

其中:质量浓度为7%的菠萝蛋白酶酶解液是指在1l去离子水中加入70g菠萝蛋白酶,混合均匀而得的溶液。

滤渣与酶解液的质量比(g/g)为1:15。

⑺将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸15分钟,以23000rpm的速率离心分离10min,得到上清液。

⑻上清液采用串联式膜分离,截取分子量为85~125kda的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白,该牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白于-45℃冷冻干燥36小时,即得牦牛胶。

其中:串联式膜分离是指将数个孔径为0.01~0.22μm的超滤膜设备串联在一起。

实施例5一种增强成骨细胞能力的牦牛胶制备方法,包括以下步骤:

⑴将新鲜带毛的青藏高原牦牛皮(保留距离皮2厘米的毛)清洗干净,以225nm辐射波长经紫外灯照射,照射时间为1.5小时,得到辐照后的牦牛皮。

⑵辐照后的牦牛皮切割成1cm的块,沸水中提取25分钟后取出,用多刺板刺穿牦牛皮。

⑶将步骤⑵所得的牦牛皮放入质量浓度为5.5%的酶解液中,于40℃酶解0.5小时,过滤,分别得到酶解后的牦牛皮和第一次酶解溶液。

其中:质量浓度为5.5%的酶解液是指在1l去离子水中加入55g蛋白酶,混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指2.5g菠萝蛋白酶、12g链霉菌角质蛋白酶、5g酵母菌酶、3.5g胃蛋白酶、8.5g胰蛋白酶、7g组织蛋白酶、11g木瓜蛋白酶、5.5g枯草杆菌蛋白酶混合而成。

牦牛皮与酶解液的质量比(g/g)为1:18。

⑷酶解后的牦牛皮中加入其质量11倍的水煮沸10分钟,得到滤液。

⑸滤液中加入其质量7.5%的活性炭,充分搅拌后静置6小时,过滤,得到滤渣。

⑹滤渣放入质量浓度为2%的酶解液,于55℃酶解12小时,过滤,得到第二次酶解溶液。

其中:质量浓度为2%的酶解液是指在1l去离子水中加入20g蛋白酶,混合均匀而得的溶液。

蛋白酶是指6.5g巯基蛋白酶、3.5g碱性蛋白酶、10g复合蛋白酶混合而成。

滤渣与酶解液的质量比(g/g)为1:15。

⑺将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸20分钟,以18000rpm的速率离心分离17min,得到上清液。

⑻上清液采用串联式膜分离,截取分子量为72~130kda的牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白,该牦牛皮ⅰ型胶原和角蛋白于-26℃冷冻干燥12小时,即得牦牛胶。

其中:串联式膜分离是指将数个孔径为0.01~0.5μm的超滤膜设备串联在一起。

上述实施例1~5中,蛋白酶是指菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、巯基蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、链霉菌角质蛋白酶、酵母菌酶中的一种或两种及以上的复合物。

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