一种促进血小板活化的动物胶制备方法与流程

本发明涉及一种胶原蛋白的制备工艺，尤其涉及一种促进血小板活化的动物胶制备方法。

背景技术：

目前，对于牦牛皮的研究一直是以脱毛后的胶原蛋白进行，忽略了牦牛毛的作用。牛毛主要是由角蛋白组成，具有氨基酸长链，角蛋白类似于胶原，有两种主要蛋白，一种为含硫元素较多的细胞间质蛋白，含有胱氨酸；另一种为含硫较少的纤维质蛋白。

胱氨酸是一种含硫氨基酸，多含于角蛋白中，是人体必需的氨基酸之一，对人体没有不良效果。医药上有促进机体细胞氧化和还原机能，增加白血球和阻止病原菌发育等作用，也用于痢疾、伤寒、流感等急性传染病、气喘、神经痛、湿疹以及各种中毒疾患等，并有维持蛋白质构型的作用。

血小板聚集涉及多种粘附分子，包括gpⅱb/ⅲa、vonwillebrand因子、p-selection等（massberg等，1998；frenette等，2000）。其中，内皮细胞的weibel-palade体和血小板颗粒中存在p-selection（skinner等，1990；frenette等，1995；romo等，1999）。在血小板聚集过程中p-selection首先快速地动员到细胞表面，然后与p-selection蛋白配体-1(pgp-1)结合到活化的血小板上（larsen等，1989）。由于p-selection具有较高的敏感性和特异性，已成为公认的检测血小板活化的指标之一。

gpⅰa/ⅱa是血小板表面与胶原蛋白结合的胶原蛋白受体之一，止血的第一步就是由gpⅰa/ⅱa启动，导致内外信号转导，激活胶原受体，进而激活血小板（nieswandt等，2001；arthur等，2007）。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种方法简单、易于实施的促进血小板活化的动物胶制备方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种促进血小板活化的动物胶制备方法，包括以下步骤：

⑴将新鲜带离皮1~2厘米毛的青藏高原白牦牛皮清洗干净，经紫外灯照射，得到辐照后的白牦牛皮；

⑵所述辐照后的白牦牛皮切割成1~3cm的块，沸水中提取5~30分钟后取出，用多刺板刺穿牦牛皮；

⑶将所述步骤⑵所得的白牦牛皮放入质量浓度为0.5%~5.5%的酶解液中酶解，然后煮沸5~40分钟，过滤，分别得到滤渣和第一次酶解溶液；所述白牦牛皮与所述酶解液的质量比为1：5~1：20；

⑷所述滤渣放入质量浓度为1%~10%的酶解液中酶解，过滤，得到第二次酶解溶液；所述滤渣与所述酶解液的质量比为1：8~1：20；

⑸将所述第一次酶解溶液与所述第二次酶解溶液合并后煮沸5~40分钟，经离心分离，得到上清液；

⑹所述上清液采用中空纤维膜超滤，得到牦牛皮胶原蛋白溶液，该牦牛皮胶原蛋白溶液经冷冻干燥，即得。

所述步骤⑴中紫外灯照射条件是指辐射波长为200nm~275nm，照射时间为0.3~2.0小时。

所述步骤⑶中质量浓度为0.5%~8%的酶解液是指在1l去离子水中加入5~80g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。

所述步骤⑶中酶解条件是指温度为30~60℃，时间为0.5~36小时。

所述步骤⑷中质量浓度为1%~10%的酶解液是指在1l去离子水中加入10~100g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。

所述步骤⑷中酶解条件是指温度为30~55℃，时间为0.5~24小时。

所述蛋白酶是指巯基蛋白酶、菠萝蛋白酶、链霉菌角质蛋白酶、酵母菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶中的一种或两种及以上的复合物。

所述步骤⑸中离心分离的条件是指速率为15000~25000rpm，时间为5~60min。

所述步骤⑹中中空纤维膜的孔径为3.5~7.0μm。

所述步骤⑹中冷冻干燥的条件是指温度为-10~-50℃，时间为2~48小时。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明中的牦牛皮胶原蛋白是以青藏高原特有牛种白牦牛带毛的皮为原料，经分离后得到的分子量为10~20kda的纯天然的胶原蛋白。牦牛皮胶原蛋白的开发，使青藏高原的特有资源白牦牛得到更好利用。

2、本发明所制备的牦牛皮胶原蛋白经药效学实验证明，可通过促进血小板颗粒内容物释放，加速血小板粘附-变构-释放-聚集的过程完成血小板活化，在早期激活血小板促进血小板粘附，增加血清gpⅰa/ⅱa、gpⅱb/ⅲa和gpⅳ、p-selection的表达量，cd62p活化率达到22.43%。

①牦牛皮胶对小鼠p-selection的影响：

牦牛皮胶能干预凝血作用，血小板参与止血与凝血过程，血小板在受损的血管壁的位置上粘附和激活。血小板活化是止血过程从血管破裂开始，在纤维蛋白、凝血酶的参与下，血小板受到刺激后迅速发生转化、干燥、释放、聚集等一系列生理反应（ye等，2004）。

将60只km小鼠随机分为6组，空白对照组、牦牛皮胶a1、a2、a3、a4给药组（2g/kg/d），云南白药胶囊给药组（1405.62mg/kg/d），连续给药7天。摘除眼球法取血，3000r/min，4℃离心20min，吸取上清后，按照小鼠p-selection酶联免疫测定小鼠血清中p-selection的含量。

由图1可知，和对照组相比，不同分子量牦牛皮胶给药组p-selection升高表达显著升高(p<0.01)，和云南白药胶囊给药组相比没有差异(p>0.05)。提示各组牦牛皮胶给药后，血小板膜上p-selection动员数增加，血小板膜上p-selection的表达可代表血小板σ颗粒的释放量（cauwenberghs等.，2000），这些血小板迅速参与原发性血小板聚集，然后与许多配体结合，促进级联反应。这一结果与出血和凝血时间缩短的结果一致，p-selection在分子量分布较低的牦牛皮胶组表达较高，说明牦牛皮胶的有效部位是分子量分布较低的段。

②牦牛皮胶对大鼠血小板gpⅰa/ⅱa、gpⅱb/ⅲa及gpⅳ的影响：

将40只sd大鼠随机分为4组，空白对照组、牦牛皮胶1、2给药组，云南白药胶囊给药组，连续给药7天，末次给药30min后，采用10%水合氯醛麻醉大鼠，心脏取血，抗凝，1000r离心10min制备富含血小板血浆，按照大鼠gpⅰa/ⅱa、gpⅱb/ⅲa及gpiv酶联免疫书测定大鼠血清中gpⅰa/ⅱa、gpⅱb/ⅲa及gpiv的含量。

血小板膜蛋白的表达与血小板的活化有关，尤其是gpⅰa/ⅱa、gpⅱb/ⅲa和gpⅳ都直接反应止血过程中早期粒子释放和血小板激活与否。

当内皮下的胶原促进血小板粘附和活化时，血小板被捕获，血小板膜蛋白ⅰa/ⅱa、gpⅱb/ⅲa和ⅳ参与其中（fuster等，1992）。表1结果表明，和对照组相比，牦牛皮胶给药组gpⅰa/ⅱa表达升高(p<0.01)，且与云南白药胶囊组趋势一致。

gpⅱb/ⅲa通过vonwillebrand因子间接与胶原受体结合，可与维甲酸、血小板反应蛋白、纤维蛋白和纤连蛋白结合（peter等，2004）。gpⅱb/ⅲa在血小板上大量表达，每个血小板有5~8万个，约占血小板蛋白总量的1%~2%（phillips等，1988；wagner等，1996）。gpⅱb/ⅲa主要在存在明显的凝块收缩和促凝剂等条件时产生由外向内信号，使得gpⅱb/ⅲa信号具有高度的敏感性和特异性（pello等，2012）。表1显示，和对照组相比，牦牛皮胶能增加gpⅱb/ⅲa的表达(p<0.05)。

gpⅳ广泛存在于各种细胞和组织中，比如血小板、血管内皮细胞和平滑肌细胞等。血小板膜表面约有12000~15000个gpⅳ，分子量为88kd。gpⅳ通过作用于fyn、lyn和yes蛋白酪氨酸激酶，参与血小板聚集和血小板与单核诱导血小板信号传导的相互作用（sarratt等，2005；mo.，2012）。gpⅳ在早期血小板粘附时发生构象变化，暴露结合位点，协助血小板结合胶原蛋白。表1显示，和对照组相比，牦牛皮胶能增加gpⅳ的表达(p<0.05)。

表1牦牛皮的给药后大鼠血小板gpia/iia、gpiib/iiia及gpiv的影响

注：含有相同字母的表示差异不显著（p＞0.05），含有不同字母的表示差异显著（p<0.05）。

③牦牛皮胶对大鼠血小板cd62p的影响：

运用流式细胞术检测cd62p和血小板-单核细胞复合物等受体来快速评估（ramström等.，2016）。cd62p是存储在血小板α颗粒和weibel-palade内皮细胞中的ca²⁺依赖受体（furie等，2001；mcever等，2002）。

凝血过程开始时,α颗粒中的糖蛋白迅速释放到血浆中，而cd62p在血小板表面表达，用荧光标记的抗体检测cd62p的水平，是血小板活化的最特异、最敏感的指标（hamburger等，1990；leytin等，2000；conway等，2003；lee等，2008；wachowicz等，2002；kutlar等，2014）。

表2所示，牦牛皮胶cd62p的表达水平明显高于对照组(p<0.01)。

表2牦牛皮胶对大鼠血小板cd62p的影响(n=8,)

注：与空白组相比^*p<0.05，^**p<0.01。

3、本发明方法简单，易于实施。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明牦牛皮胶对小鼠p-selection的影响（n=10，），与空白组相比*p<0.05，**p<0.01。

具体实施方式

实施例1一种促进血小板活化的动物胶制备方法，包括以下步骤：

⑴将新鲜带离皮2厘米毛的青藏高原白牦牛皮清洗干净，以275nm的辐射波长经紫外灯照射2.0小时，得到辐照后的白牦牛皮。

⑵辐照后的白牦牛皮切割成3cm的块，沸水中提取30分钟后取出，用多刺板刺穿牦牛皮。

⑶将步骤⑵所得的白牦牛皮放入质量浓度为0.5%的酶解液中，于60℃酶解36小时，然后煮沸40分钟，过滤，分别得到滤渣和第一次酶解溶液。

其中：质量浓度为0.5%的酶解液是指在1l去离子水中加入5g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指2.5g巯基蛋白酶、0.25g碱性蛋白酶、1.5g复合蛋白酶、0.5g链霉菌角质蛋白酶、0.25g酵母菌酶的混合物。

白牦牛皮与酶解液的质量比（g/g）为1：5。

⑷滤渣放入质量浓度为10%的酶解液中，于55℃酶解24小时，过滤，得到第二次酶解溶液。

其中：质量浓度为10%的酶解液是指在1l去离子水中加入100g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指30g菠萝蛋白酶、10g胃蛋白酶、5g胰蛋白酶、20g组织蛋白酶、10g木瓜蛋白酶、25g枯草杆菌蛋白酶的混合物。

滤渣与酶解液的质量比（g/g）为1：8。

⑸将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸40分钟，以15000rpm的速率离心分离5min，得到上清液。

⑹上清液采用孔径为7.0μm的中空纤维膜超滤，得到牦牛皮胶原蛋白溶液，该牦牛皮胶原蛋白溶液于-10℃冷冻干燥2小时，即得。

实施例2一种促进血小板活化的动物胶制备方法，包括以下步骤：

⑴将新鲜带离皮1厘米毛的青藏高原白牦牛皮清洗干净，以200nm的辐射波长经紫外灯照射0.3小时，得到辐照后的白牦牛皮。

⑵辐照后的白牦牛皮切割成1cm的块，沸水中提取5分钟后取出，用多刺板刺穿牦牛皮。

⑶将步骤⑵所得的白牦牛皮放入质量浓度为0.5%的酶解液中，于30℃酶解0.5小时，然后煮沸5分钟，过滤，分别得到滤渣和第一次酶解溶液。

其中：质量浓度为0.5%的酶解液是指在1l去离子水中加入5g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指1g菠萝蛋白酶、0.5g胃蛋白酶、0.5g胰蛋白酶、2g组织蛋白酶、0.5g木瓜蛋白酶、0.5g枯草杆菌蛋白酶的混合物。

白牦牛皮与酶解液的质量比（g/g）为1：20。

⑷滤渣放入质量浓度为1%的酶解液中，于30℃酶解0.5小时，过滤，得到第二次酶解溶液。

其中：质量浓度为1%的酶解液是指在1l去离子水中加入10g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指2g巯基蛋白酶、0.5g碱性蛋白酶、1.5g复合蛋白酶、3g链霉菌角质蛋白酶、3g酵母菌酶的混合物。

滤渣与酶解液的质量比（g/g）为1：20。

⑸将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸5分钟，以25000rpm的速率离心分离60min，得到上清液。

⑹上清液采用孔径为3.5μm的中空纤维膜超滤，得到牦牛皮胶原蛋白溶液，该牦牛皮胶原蛋白溶液于-50℃冷冻干燥48小时，即得。

实施例3一种促进血小板活化的动物胶制备方法，包括以下步骤：

⑴将新鲜带离皮1.5厘米毛的青藏高原白牦牛皮清洗干净，以223nm的辐射波长经紫外灯照射1.0小时，得到辐照后的白牦牛皮。

⑵辐照后的白牦牛皮切割成2cm的块，沸水中提取15分钟后取出，用多刺板刺穿牦牛皮。

⑶将步骤⑵所得的白牦牛皮放入质量浓度为5%的酶解液中，于40℃酶解12小时，然后煮沸20分钟，过滤，分别得到滤渣和第一次酶解溶液。

其中：质量浓度为5%的酶解液是指在1l去离子水中加入50g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指20g枯草杆菌蛋白酶、10g巯基蛋白酶、20g碱性蛋白酶的混合物。

白牦牛皮与酶解液的质量比（g/g）为1：15。

⑷滤渣放入质量浓度为6%的酶解液中，于50℃酶解8小时，过滤，得到第二次酶解溶液。

其中：质量浓度为6%的酶解液是指在1l去离子水中加入60g复合蛋白酶，混合均匀而得的溶液。

滤渣与酶解液的质量比（g/g）为1：10。

⑸将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸30分钟，以15000rpm的速率离心分离30min，得到上清液。

⑹上清液采用孔径为5.0μm的中空纤维膜超滤，得到牦牛皮胶原蛋白溶液，该牦牛皮胶原蛋白溶液于-10℃冷冻干燥48小时，即得。

实施例4一种促进血小板活化的动物胶制备方法，包括以下步骤：

⑴将新鲜带离皮2厘米毛的青藏高原白牦牛皮清洗干净，以245nm的辐射波长经紫外灯照射0.5小时，得到辐照后的白牦牛皮。

⑵辐照后的白牦牛皮切割成3cm的块，沸水中提取10分钟后取出，用多刺板刺穿牦牛皮。

⑶将步骤⑵所得的白牦牛皮放入质量浓度为4%的酶解液中，于45℃酶解24小时，然后煮沸25分钟，过滤，分别得到滤渣和第一次酶解溶液。

其中：质量浓度为4%的酶解液是指在1l去离子水中加入40g巯基蛋白酶，混合均匀而得的溶液。

白牦牛皮与酶解液的质量比（g/g）为1：10。

⑷滤渣放入质量浓度为7%的酶解液中，于40℃酶解8小时，过滤，得到第二次酶解溶液。

其中：质量浓度为7%的酶解液是指在1l去离子水中加入70g菠萝蛋白酶，混合均匀而得的溶液。

滤渣与酶解液的质量比（g/g）为1：15。

⑸将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸15分钟，以20000rpm的速率离心分离45min，得到上清液。

⑹上清液采用孔径为4.5μm的中空纤维膜超滤，得到牦牛皮胶原蛋白溶液，该牦牛皮胶原蛋白溶液于-50℃冷冻干燥2小时，即得。

实施例5一种促进血小板活化的动物胶制备方法，包括以下步骤：

⑴将新鲜带离皮2厘米毛的青藏高原白牦牛皮清洗干净，以225nm的辐射波长经紫外灯照射1.5小时，得到辐照后的白牦牛皮。

⑵辐照后的白牦牛皮切割成1cm的块，沸水中提取25分钟后取出，用多刺板刺穿牦牛皮。

⑶将步骤⑵所得的白牦牛皮放入质量浓度为5.5%的酶解液中，于45℃酶解8小时，然后煮沸10分钟，过滤，分别得到滤渣和第一次酶解溶液。

其中：质量浓度为5.5%的酶解液是指在1l去离子水中加入55g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指7g菠萝蛋白酶、26g链霉菌角质蛋白酶、11g酵母菌酶、2g胃蛋白酶、4g胰蛋白酶、3g组织蛋白酶、1g木瓜蛋白酶、1g枯草杆菌蛋白酶的混合物。

白牦牛皮与酶解液的质量比（g/g）为1：16。

⑷滤渣放入质量浓度为8.5%的酶解液中，于55℃酶解16小时，过滤，得到第二次酶解溶液。

其中：质量浓度为8.5%的酶解液是指在1l去离子水中加入85g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指39g巯基蛋白酶、14g碱性蛋白酶、32g复合蛋白酶的混合物。

滤渣与酶解液的质量比（g/g）为1：13。

⑸将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸20分钟，以18000rpm的速率离心分离10min，得到上清液。

⑹上清液采用孔径为6.0μm的中空纤维膜超滤，得到牦牛皮胶原蛋白溶液，该牦牛皮胶原蛋白溶液于-35℃冷冻干燥24小时，即得。

上述实施例1~5中，蛋白酶可以是巯基蛋白酶、菠萝蛋白酶、链霉菌角质蛋白酶、酵母菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶中的一种或两种及以上的复合物。