本发明涉及一种可快速固化水凝胶，具体涉及一种三维培养干细胞用的基于逆diels-alder反应的可快速固化水凝胶、其制备方法及应用，属于组织工程材料制备
技术领域：
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背景技术：
：：随着科学技术的发展，组织工程已成为修复损伤组织的一种重要手段。组织工程是应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。组织工程学包括三个基本要素：细胞、支架材料和信号因子。其中，支架材料是热点和难点。目前较常用的支架材料是水凝胶。水凝胶制备方式可以分为物理方式和化学方式，所形成的的水凝胶是物理水凝胶和化学水凝胶。物理方式是指水凝胶的前体聚合物通过各种物理相互作用例如氢键、范德华力、主客体作用、疏水相互作用等瞬时交联形成物理水凝胶。通过物理方式形成的水凝胶，虽然在成胶过程中不需要光照射，也不会使用有机溶剂或交联剂等，但此方式形成的水凝胶存在交联度低、稳定性差以及低的机械强度等缺点。化学水凝胶是通过化学反应在分子间形成共价键构建。通过此方式所制备的水凝胶具有稳定性好等优点，但传统的化学方式在反映过程中会引入化学交联剂等，这可能会对细胞有一定的损害。因此，寻找生物相容性好、反应速率快以及稳定性好的方式制备水凝胶尤为重要。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种基于逆diels-alder反应的可快速固化水凝胶的制备及应用，以克服现有技术的不足。本发明的技术方案是这样实现的：一种基于聚乙二醇的聚合物，所述聚合物为式(3)所示结构的聚合物；其中，ha为透明质酸，其中m为大于或等于2的自然数。优选的技术方案中，其中ha的聚合度n为大于或等于2的自然数，优选的，n取值为107～196。本发明的另一目的在于提供一种水凝胶组合物，包括聚合物基质和水，所述聚合物基质为前述的聚合物。优选的技术方案中，所述水凝胶组合物具有孔洞的多孔结构，其中所含孔洞的孔径为300～400μm。优选的技术方案中，所述水凝胶组合物的机械强度在5000pa～6000pa。本发明的又一目的在于提供一种可快速固化水凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：1)使3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪与四臂聚乙二醇发生反应，获得式(1)所示的四嗪修饰的四臂聚乙二醇，其中，m为大于等于2的自然数；2)使5-降冰片烯-2-甲胺与透明质酸发生反应，获得式(2)所示降冰片烯修饰的透明质酸；其中，n为大于等于2的自然数；3)四嗪修饰的四臂聚乙二醇与降冰片烯修饰的透明质酸进行逆diels-alder反应获得可快速固化水凝胶。优选的技术方案中，步骤1)包括使四臂聚乙二醇、缩合剂在第一溶剂中混合发生缩合反应，然后加入3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪形成第二混合体系发生酰胺化反应获得式(2)所示四嗪修饰的四臂聚乙二醇的步骤；其中缩合反应的反应温度控制在0～8℃，反应时间控制在10～30min；酰胺化反应的反应温度控制在15～30℃，反应时间控制在10～20h。优选的，所述缩合剂包括苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐和n,n-二异丙基乙胺；所述第一溶剂包括二氯甲烷；所述缩合剂与四臂聚乙二醇的摩尔比为1～3:1；所述四臂聚乙二醇与3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪的摩尔比为1:1～3。优选的技术方案中，步骤1)中还包括在第二混合体系发生酰胺化反应之后对反应混合物后处理的步骤。所述后处理步骤包括：在所述第二混合体系的反应结束后，将所获反应混合物加入不良溶剂中，并收集沉淀，随后通过葡聚糖凝胶柱纯化并冷冻干燥，即得到四嗪修饰的四臂聚乙二醇。优选的，所述不良溶剂包括正己烷或乙醚；所述葡聚糖凝胶柱为葡聚糖凝胶柱g-15；所述不良溶剂与第二混合体系的体积比为10～20:1。优选的技术方案中，步骤2)包括使透明质酸、缩合剂在第二溶剂中形成第三混合体系发生缩合反应，然后加入5-降冰片烯-2-甲胺进行还原反应得到式(2)所示降冰片烯修饰的透明质酸的步骤；其中缩合反应的反应温度控制在0～8℃，反应时间控制在10～30min；还原反应的反应温度控制在15～30℃，反应时间控制在10～20h。优选的，所述缩合剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺；所述第二溶剂包括2-(n-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液；所述透明质酸与降冰片烯的摩尔比为1:1～3；所述缩合剂与透明质酸羧基的摩尔比为1～3:1。优选的技术方案中，所述方法步骤2)还包括在还原反应后对还原反应产物进行后处理的步骤。所述后处理步骤包括：将所获反应混合物透析1～3天，之后冷冻干燥，获得降冰片烯修饰的透明质酸。本发明的又一目的在于提供一种前述的水凝胶组合物在组织工程领域中的用途。优选的技术方案中，所述的用途包括以所述水凝胶组合物作为三维培养细胞载体进行细胞培养的步骤。优选的技术方案中，所述的用途包括以所述水凝胶组合物作为三维培养细胞载体进行干细胞的培养，并促使所述干细胞进行增殖。优选的技术方案中，以所述水凝胶组合物作为三维培养细胞载体进行干细胞的培养时，干细胞于所述peg-ha水凝胶组合物上的负载量为100～1000万个/ml。本发明聚合物的制备方法采用快速固化的方式进行，水凝胶组合物也可以采用类似如图1的工艺路线获得：如图1，水凝胶的制备方法中先将四臂聚乙二醇与3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪混合，获得四嗪修饰的聚乙二醇；与之并列的，可以将5-降冰片烯-2-甲胺修饰到透明质酸上，获得降冰片烯修饰的透明质酸；最后将所述四嗪修饰的聚乙二醇与降冰片烯修饰的透明质酸于磷酸盐缓冲溶液中发生逆diels-alder反应，获得基于逆diels-alder反应的的可快速固化水凝胶。这样获得的可快速固化的水凝胶，包括聚合物基质和水，所述聚合物基质由结构如式(3)所示的聚合物形成：其中，其中，ha为透明质酸，m为大于或等于2的自然数；ha的聚合度n取值为107～196。该水凝胶可以应用于组织工程领域中的细胞培养领域。应用时，以所水凝胶作为三维培养细胞载体进行细胞的培养。具体的，可以以所述水凝胶作为三维培养细胞载体进行干细胞的培养，并促使所述干细胞进行增殖。与现有技术相比，本发明的有益效果至少在于：1)降冰片烯与四嗪间的反应速率极快，但是3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪不溶于水，从而限制了其在生物医学中的应用，本发明提供的基于降冰片烯与四嗪间逆diels-alder反应成型的可快速固化水凝胶的制备方法，通过将3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪修饰到四臂聚乙二醇后，制备可水溶的且修饰有四嗪的四臂聚乙二醇，从而实现了快速固化水凝胶的形成；2)本发明提供了一种基于逆diels-alder反应制备水凝胶三维支架的方法，并实现与细胞共混凝胶化，此反应具有优异的生物相容性，毒性低，可以提供三维环境以提高干细胞的增殖与分化；干细胞在水凝胶中均匀分布，同时制备方法简单，可大量制备；3)本发明所获基于逆diels-alder反应的可快速固化水凝胶的固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境，提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖，并将其应用于干细胞的增殖研究。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：图1是本发明一典型实施例中所获基于逆diels-alder反应可快速固化水凝胶的制备机理示意图；图2是本发明一典型实施例中所获基于逆diels-alder反应可快速固化水凝胶的微观结构图；图3是本发明一典型实施例中所获基于逆diels-alder反应可快速固化水凝胶流变图；图4是干细胞在本发明一典型实施例中所获基于逆diels-alder反应可快速固化水凝胶中生长共聚焦图；图5是干细胞在本发明一典型实施例中所获基于逆diels-alder反应可快速固化水凝胶中的增殖图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
技术领域：
：的普通技术人员通常理解的相同含义。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。本发明提供了一种可快速固化的水凝胶，包括聚合物基质和水，所述聚合物由结构如式(3)所示的聚合物形成：在一些实施例中，所述制备方法包括：将四臂聚乙二醇、缩合剂在第一溶剂中混合获得第一混合体系，之后所述第一混合体系在0～8℃反应10～30min；然后加入3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪形成第二混合体系，之后所述第二混合体系在15～30℃反应10～20h获得四嗪修饰的四臂聚乙二醇；优选的，第一溶剂包括二氯甲烷。进一步地，所述缩合剂包括苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐和n,n-二异丙基乙胺。进一步地，所述缩合剂与四臂聚乙二醇的摩尔比为1～3:1。进一步地，所述四臂聚乙二醇与3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪的摩尔比为1:1～3。进一步地，所述制备方法还包括：在所述第二混合体系的反应结束后，将所获反应混合物加入不良溶剂中，并收集沉淀，随后通过葡聚糖凝胶柱纯化并冷冻干燥，即得到四嗪修饰的四臂聚乙二醇。进一步地，所述不良溶剂包括乙醚。进一步地，所述葡聚糖凝胶柱为葡聚糖凝胶柱g-15。进一步地，所述不良溶剂与第二混合体系的体积比为10～20:1。在一些实施例中，所述制备方法包括：使透明质酸、缩合剂在第二溶剂中形成第三混合体系于0～8℃反应10～30min，然后加入5-降冰片烯-2-甲胺混合均匀形成第四混合体系，使所述第四混合体系于15～30℃反应10～20h，获得降冰片烯修饰的透明质酸。进一步地，所述缩合剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺。进一步地，所述第二溶剂包括2-(n-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液。进一步地，所述透明质酸与降冰片烯的摩尔比为1:1～3。进一步地，所述缩合剂与透明质酸羧基的摩尔比为1:3:1。进一步地，制备方法还包括：将所获反应混合物透析1～3天，之后冷冻干燥，获得降冰片烯修饰的透明质酸。作为优选方案之一，所述水凝胶具有多孔结构，其中所含孔洞的孔径为300～400μm。藉由上述技术方案，本发明的基于逆diels-alder反应可快速固化水凝胶将常用材料四臂聚乙二醇与生物来源的透明质酸分别进行四嗪与降冰片烯化修饰，之后复合并与细胞共混，将四臂聚乙二醇和透明质酸相结合，提高细胞的粘附作用、细胞的存活率，所获基于逆diels-alder反应的可快速固化水凝胶的固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境，提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖；同时制备方法简单，可大量制备。实施例1步骤一：将4armpeg-cooh(mw＝10000)溶解在二氯甲烷中，随后加入苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐以及n,n-二异丙基乙胺，冰浴活化15min，然后加入3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪，过夜反应。其中，4armpeg-cooh上的羧基，3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪，1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐以及n,n-二异丙基乙胺的反应摩尔比为1:1.2:2.5:2.5。步骤一的反应结束后，在乙醚中沉淀，得到粉色沉淀，7000rpm离心5min收沉淀，用水溶解上述沉淀，通过g15葡聚糖凝胶色谱柱纯化，最后冻干，得到四嗪修饰的peg，四嗪修饰的peg结构式如式(1)所示：步骤二：将透明质酸钠(mw＝36kda)溶解在ph为5-6的mes缓冲溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，n-羟基琥珀酰亚胺冰浴活化15min，然后将5-降冰片烯-2-甲胺加进去，过夜反应。随后，将反应液置于截留分子量为3500da的透析袋中，在去离子水中透析3天，最后冻干,可得到被降冰片烯修饰的ha(ha-nb)。其中，透明质酸上的羧基、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺和5-降冰片烯-2-甲胺的摩尔比为1:2:2:1.5。步骤二反应结束后，用3500da截留量透析除去未反应的5-降冰片烯-2-甲胺，-80℃冷冻过夜，然后冻干，获得降冰片烯修饰的透明质酸，降冰片烯修饰的透明质酸的结构式如(2)所示：步骤三：将上述四嗪修饰的四臂聚乙二醇配成质量体积比为10wt％的pbs溶液，将降冰片烯修饰的透明质酸配成8wt％的pbs溶液，将二者混合30s便可成胶；其中，四嗪修饰的四臂聚乙二醇与降冰片烯修饰的透明质酸的体积比为1:1。步骤三的反应结束后，获得的水凝胶如式(3)所示：其中，ha为透明质酸。对本实施例所获基于逆diels-alder反应的可快速固化水凝胶进行表征，其中，四嗪修饰的四臂聚乙二醇的表征数据为：δ：8.5,7.5(单峰,四嗪苯环上的氢)，3.65,(单峰,四臂聚乙二醇上的氢)。降冰片烯修饰的透明质酸的表征数据为：δ：4.0-3.0(多重峰,透明质酸糖环上的质子)，6.0-6.33(多重峰，降冰片烯上乙烯基质子的峰)。实施例2步骤一：将4armpeg-cooh(mw＝10000)溶解在二氯甲烷中，随后加入氯甲酸异丁酯以及n-甲基吗啉，4℃活化30min，然后加入3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪，过夜反应。其中，4armpeg-cooh上的羧基，3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪，1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐以及n,n-二异丙基乙胺的反应摩尔比为1:2:3:3。步骤一的反应结束后，在乙醚中沉淀，得到粉色沉淀，8000rpm离心5min收沉淀，用水溶解上述沉淀，通过g-15葡聚糖凝胶色谱柱纯化，最后冻干，得到四嗪修饰的四臂聚乙二醇，四嗪修饰的四臂聚乙二醇结构式如式(1)所示：步骤二：将透明质酸钠(mw＝36kda)溶解在ph为5-6的mes缓冲溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，n-羟基琥珀酰亚胺，4℃活化30min，然后将5-降冰片烯-2-甲胺加进去，过夜反应。随后，将反应液置于截留分子量为3500da的透析袋中，在去离子水中透析3天，最后冻干,可得到被降冰片烯修饰的ha(ha-nb)。其中，透明质酸上的羧基、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺和5-降冰片烯-2-甲胺的摩尔比为1:1.5:1.5:1.2。步骤二反应结束后，用3500da截留量透析除去未反应的5-降冰片烯-2-甲胺，-80℃冷冻过夜，然后冻干，获得降冰片烯修饰的透明质酸，降冰片烯修饰的透明质酸的结构式如(2)所示：步骤三：将上述四嗪修饰的peg配成质量体积比为10wt％的pbs溶液，将降冰片烯修饰的透明质酸配成8wt％的pbs溶液，将二者混合30s便可成胶；其中，四嗪修饰的peg与降冰片烯修饰的透明质酸的体积比为1:1。步骤三的反应结束后，获得所述水凝胶如式(3)所示：其中，ha为透明质酸。实施例3步骤一：将4armpeg-cooh(mw＝5000)溶解在二氯甲烷中，随后加入1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐以及n,n-二异丙基乙胺，8℃活化20min，然后加入3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪，过夜反应。其中，4armpeg-cooh上的羧基，3-(4-苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪，1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐以及n,n-二异丙基乙胺的反应摩尔比为1:1.5:3:3。步骤一的反应结束后，在乙醚中沉淀，得到粉色沉淀，5000rpm离心10min收沉淀，用水溶解上述沉淀，通过g15葡聚糖凝胶色谱柱纯化，最后冻干，得到四嗪修饰的四臂聚乙二醇，四嗪修饰的四臂聚乙二醇结构式如式(1)所示：步骤二：将透明质酸钠(mw＝74kda)溶解在ph为5-6的mes缓冲溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，n-羟基琥珀酰亚胺，8℃活化20min，然后将5-降冰片烯-2-甲胺加进去，过夜反应。随后，将反应液置于截留分子量为3500da的透析袋中，在去离子水中透析3天，最后冻干,可得到被降冰片烯修饰的ha(ha-nb)。其中，透明质酸上的羧基、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺和5-降冰片烯-2-甲胺的摩尔比为1:1.2:1.2:2。步骤二反应结束后，用3500da截留量透析除去未反应的5-降冰片烯-2-甲胺，-80℃冷冻过夜，然后冻干，获得降冰片烯修饰的透明质酸，降冰片烯修饰的透明质酸的结构式如(2)所示：步骤三：将上述四嗪修饰的四臂聚乙二醇配成质量体积比为10wt％的pbs溶液，将降冰片烯修饰的透明质酸配成8wt％的pbs溶液，将二者混合30s便可成胶；其中，四嗪修饰的四臂聚乙二醇与降冰片烯修饰的透明质酸的体积比为1:1。步骤三反应结束后，获得所述水凝胶如式(3)所示：其中，ha为透明质酸。实施例1所获水凝胶可作为三维培养细胞载体在组织工程中应用。下面通过测试例中项目性能测试展示本实施例所获水凝胶作为细胞三维培养载体的应用优势。性能测试一在场环扫描电镜测试仪上测试本实施例所获光固化水凝胶内部结构及孔径大小，其操作方法包括：将上述实施例1所获水凝胶液氮冷冻后，固定到导电胶上，20ma喷金3min，通过扫描电镜观察水凝胶的孔径结构(如图2所示)。通过扫描电镜可以看出，该peg-ha水凝胶微观结构多孔，孔径约300～400μm。性能测试二将四嗪修饰的四臂聚乙二醇配成质量体积比为10wt％的pbs溶液，将降冰片烯修饰的透明质酸配成8wt％的pbs溶液，将二者按体积比为1:1混合30s便可成胶，将该水凝胶在流变仪测试仪上测试本实施例所获水凝胶的机械性能，通过流变结果图3可以看出，g’>g”且呈线性，说明已成凝胶状态。性能测试三实施例1所获水凝胶对干细胞增殖检测用钙黄绿素染色法染色法和四唑盐比色法(wst法)来测定本实施例水凝胶中的人脐带间充质干细胞(ucmscs)的存活和增殖，其操作方法包括：将10代ucmscs通过胰酶消化、计数，1000rpm离心3min，待用。将四嗪修饰的四臂聚乙二醇与降冰片烯修饰的透明质酸通过钴60射线灭菌后，分别用dmem/f12完全培养基溶解，然后将ucmscs与四嗪修饰的四臂聚乙二醇溶液共混后，再与ha-nb溶液混合成胶。将水凝胶转移到24孔板中，并向每孔加入适量培养基，然后将孔板置于37℃，5％co2培养箱中培养，每2-3天换一次液。之后分别在培养的1d，3d，5d和7d通过加入wst-1试剂孵育4小时，以检测该水凝胶中的ucmscs的增殖情况；培养1天和5天后将培养基取出，pbs清洗3次，利用live/dead试剂盒测定，在激光共聚焦488/561激发下观察细胞活性；活细胞被钙黄绿素染色发出绿色荧光，死细胞被染色发出红色荧光。如图4所示ucmscs在本实施例所获光固化水凝胶中存活较好并显示三维结构和明显增殖，表明本发明对细胞增殖无影响且能为细胞提供三维生长环境。培养1d，3d，5d和7d后将培养基取出，每孔加入450μl新鲜培养基，加50μlwst-1充分混匀，放入5％co2、37℃培养箱中孵育4h，取100μl于96孔板中酶标仪450nm处测试od值。如图5所示ucmsc与实施例一所获水凝胶共混后，培养3d细胞存活较好，培养第7d细胞呈现明显增殖，表明实施例一所获水凝胶毒性低、生物相容性好。同样，本案发明人对实施例2和3所获基于降冰片烯与四嗪间逆diels-alder反应形成的水凝胶也同样进行了性能测试一至三，并且得到了与实施例1相近的测试结果。对照例1：在liy等人撰写的injectableandbiodegradablehydrogels:gelation,biodegradationandbiomedicalapplications综述中，阐述了生物医学应用水凝胶应具有适当的胶凝速率。一般情况下，常规方法制备水凝胶的固化时间为数分钟，难以实现快速成型，无法实现细胞在其内的精确定位，限制了其在生物医学中的应用。与对照例1相比，本发明实施例1所获水凝胶基于降冰片烯与四嗪间的逆diels-alder反应成型，该反应速率极快，水凝胶可在30s内成型，较上述常规成型的水凝胶有更广泛的生物应用，例如，本发明实现与细胞共混凝胶化，细胞在其内可精确定位。对照例2：在henninkwe等人撰写的novelcrosslinkingmethodstodesignhydrogels综述中，描述了在制备水凝胶的化学和物理方法中，会引入交联剂(如：催化剂、引发剂等)，这对细胞具有一定的毒性，不利于细胞的生长与增殖。与对照例2相比，本发明实施例1所获水凝胶基于逆diels-alder反应成型，此反应属于生物正交反应，生物正交反应是一类在活体细胞或组织中不干扰生物体自身性质下可以进行的化学反应，具有优异的生物相容性，毒性低，可以提供三维环境以提高干细胞的生长，增殖与分化。综上所述，藉由本发明的上述技术方案，本发明的基于降冰片烯与四嗪间的逆diels-alder反应可快速固化水凝胶的固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境，提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖；同时制备方法简单，可大量制备。此外，本案发明人还参照实施例1-3的方式，以本说明书中列出的其它原料和条件等进行了试验，并同样制得了固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境的基于降冰片烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶。以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12