一种猪源产气荚膜梭菌致病性试验方法与流程

本发明涉及一种猪源产气荚膜梭菌致病性试验方法，属于生物技术领域。

背景技术：

产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)作为猪消化道疾病的致病菌，在自然界分布广泛。其具有在恶劣环境条件下仍能产生芽孢的能力，广泛存在于大多数动物的消化道内，这也成为它最潜在的威胁之一。主要临床表现包括仔猪腹泻和出血坏死性肠炎等。文献中报道猪的产气荚膜梭菌病主要由猪产气荚膜梭菌c型和a型毒素型引起，而猪c型产气荚膜梭菌病主要发生在0～7日龄仔猪，其它年龄段甚少。a型产气荚膜梭菌病在不同年龄段均有发生，但是以刚断奶仔猪和出生仔猪发病率较高。该病死亡率极高，使畜牧业造成严重的经济损失。此外，产气荚膜梭菌有通过食物链传染给人的危险。

由于抗生素的不合理使用，导致细菌耐药性问题日益严重。临床治疗产气荚膜梭菌病也因为耐药性的产生而变得十分棘手。不同动物源的产气荚膜梭菌对四环素和二甲胺四环素的耐药性分别为33％～73％和17％～40％。研究人员通过对258株猪产气荚膜梭菌进行药敏实验，发现其中200株对四环素耐药，58株对四环素、克林霉素和林可霉素多重耐药。因此，有必要研究和了解产气荚膜梭菌的致病性，以期为临床防治产气荚膜梭菌病提供有效措施。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种猪源产气荚膜梭菌致病性试验方法，以解决上述现有技术存在的问题，研究和了解产气荚膜梭菌的致病性，以期为临床防治产气荚膜梭菌病提供有效措施。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种猪源产气荚膜梭菌的致病性试验方法，包括以下步骤：

(1)攻毒菌株的增菌及传代培养：将猪源产气荚膜梭菌置于ft肉汤中复苏，平板划线于强化布氏血琼脂培养基上传代培养，挑单菌落于液体硫乙醇酸盐培养基(ft培养基)中增菌培养，得增菌培养液；

(2)攻毒与观察：取步骤(1)中的增菌培养液腹腔注射试验动物，观察动物的发病及死亡情况；

(3)攻毒菌株的分离与鉴定：对发病和死亡动物病变部位进行解剖，涂布于选择培养基中分离，并对分离株进行鉴定，当鉴定结果与攻毒菌株相同时，可判定攻毒菌株为致病性产气荚膜梭菌。

优选地，步骤(1)中所述ft培养基的组成为：胰酶消化酪蛋白胨15.0g，胱氨酸0.5g，无水葡萄糖5.0g，酵母膏5.0g，氯化钠2.5g，硫乙醇酸钠0.5g，0.1％刃天青1.0ml，琼脂0.75g，ph值7.1±0.2，蒸馏水1000ml。

优选地，步骤(1)中所述强化布氏血琼脂培养基组成为：蛋白胨10.0g，酵母粉2.0g，胰酪蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖1.0g，亚硫酸氢钠0.1g，琼脂15.0g，ph值7.0±0.2，氯化血红素储藏液1ml，维生素k1工作液1ml，蒸馏水1000ml。

优选地，步骤(1)中培养条件为厌氧培养，培养温度为36±1℃，培养时间为8-12h。细菌在ft培养基中培养后可看到菌液表层有大量气泡，布氏琼脂中平板划线培养后可见菌落中有透亮溶血环形成。

优选地，所述厌氧条件为80％n2、10％co2以及10％h2。

优选地，步骤(2)中试验动物为雄性昆明小白鼠，7-12周龄，体重20-30g，每只腹腔注入增菌培养液0.2ml。注射后6-72h观察小鼠的发病和死亡情况。

优选地，步骤(3)中所述发病和死亡动物病变部位包括小鼠心尖血，病变肠组织等部位。

优选地，步骤(3)中所述攻毒菌株的分离与鉴定，包括以下步骤：

(a)细菌分离培养：将采集的样品置于ft肉汤中厌氧条件培养8～12h；将菌液混匀，接种添加d-环丝氨酸溶液的tsc培养基，36±1℃厌氧培养20～24h；产气荚膜梭菌在tsc选择鉴别培养基上，生长黑色圆形菌落，菌落周围形成浅黄色浊环，挑取特征单菌落于ft肉汤中备用；

(b)鉴定方式为多重pcr鉴定。

优选地，步骤(a)所述添加d-环丝氨酸溶液的tsc培养基，其组成为：胰胨15g，大豆胨5g，酵母膏粉5g，偏亚硫酸氢钠1g，柠檬酸铁铵1g，琼脂15g，0.5％d-环丝氨酸溶液20ml，ph7.6±0.2，蒸馏水1000ml。

优选地，步骤(b)中所述多重pcr鉴定方法为：pcr引物的合成，pcr模板的制备，pcr体系及反应，电泳以及紫外凝胶成像分析。所述pcr引物的合成由金斯瑞生物科技有限公司合成，所述四种毒力基因引物为：

cpa(402bp)上游gttgatagcgcaggacatgttaag

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cpb(236bp)上游actatacagacagatcattcaacc

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引物在使用时用无菌超纯水稀释成10μmol/l。

所述pcr模板的制备过程为：挑取tsc培养基上特征性单菌落，接种于ft肉汤中，厌氧培养8-12h，此菌液可直接作为模板进行鉴定。或用接种环从tsc培养基上挑选纯培养物，置于0.5ml灭菌水中，12000r/min离心2min，弃上清，再加0.5ml灭菌水，悬浮并涡旋混匀，100℃沸水中煮沸10min后，移至冰上，冷却后以12000r/min离心2min，取上清液为pcr模板。

所述pcr反应体系为：12.5μl2×taqmastermix，引物各0.125μl，模板2μl，无菌超纯水补至25μl。pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，增30个循环；72℃终延伸10min，同时设立阴性和阳性对照。

电泳过程为：取5μlpcr扩增产物和5μlmarker加入加样孔，每次电泳时，各做阳性对照对照孔和阴性对照对照孔。电泳条件：电压110v，电泳时间30min。

结果判定：电泳结束后，取出胶块置于紫外投射仪上打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像分析。反应结果应同时符合以下7个条件，否则实验无效：

a)阴性对照未出现特异性条带；

b)a型产气荚膜梭菌阳性对照出现402bp的α毒素；

c)b型产气荚膜梭菌阳性对照出现402bp的α毒素、236bp的β毒素和541bp的ε毒素。

d)c型产气荚膜梭菌阳性对照出现402bp的α毒素和236bp的β毒素；

e)d型产气荚膜梭菌阳性对照出现402bp的α毒素和541bp的ε毒素；

f)e型产气荚膜梭菌阳性对照出现402bp的α毒素和317bp的ι毒素；

如果某一待检样品扩增产物的条带与产气荚膜梭菌阳性对照的条带在一条直线上，即条带与加样孔的距离相同，而阴性对照无此条带，则该样品分离到的菌株可初步判定为产气荚膜梭菌，必要时可通过测序来进一步确证。

优选地，步骤(3)中攻毒判定指标包括培养特性，菌落形态以及pcr鉴定结果。

本发明中猪源产气荚膜梭菌致病性试验方法包括攻毒菌株的增菌传代培养，试验动物的攻毒与观察，细菌的分离与鉴定三个步骤。其中细菌增菌培养基选择液体硫乙醇酸盐培养基(ft)，传代培养基选择强化布氏血琼脂培养基，可有效增加细菌攻毒菌液数量并且缩短细菌培养时间。攻毒方式为攻毒菌液腹腔注射法，攻毒8h后即观察到动物的发病和死亡现象，攻毒时间迅速有效。解剖发病及死亡动物病变组织，接种于选择性培养基胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基(tsc)进行分离培养，该培养基为产气荚膜梭菌的选择性培养基，在平板上可形成特定形态，能快速准确的分离出目标菌落。pcr鉴定采用多毒素分型方法，既能准确鉴定出产气荚膜梭菌，又同时根据细菌毒素类型进行细菌分型。该方法简单且成本低，试验方法可行，试验结果准确可靠。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为细菌传代培养时在布氏血琼脂中的菌落形态图。

图2为细菌分离时在tsc培养基中的菌落形态图。

图3为细菌多重pcr鉴定结果图，其中m：dnamarker；1-5：阳性对照(a、b、c、d、e五种不同分型)；6：实测样品；7：阴性对照为分离菌株，毒力分型为a型菌株。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

本发明所述猪源产气荚膜梭菌购自于中国兽医药品监察所微生物菌种保藏中心。

实施例1

(1)试验动物的准备：健康昆明小鼠，7-12周龄，体重20g～30g，体重差异不超过平均体重的20％，雌雄各半，购买于武汉大学实验动物中心。全价小鼠饲料，购自武汉大学实验动物研究中心。

(2)攻毒菌株的传代培养：选取1株猪源产气荚膜梭菌分别接种于ft肉汤中复苏，后平板划线传代强化布氏血琼脂(见图1)，再经过ft培养基中增菌培养，以上培养步骤均于37℃厌氧培养8-12h。所述ft培养基的组成为：胰酶消化酪蛋白胨15.0g，胱氨酸0.5g，无水葡萄糖5.0g，酵母膏5.0g，氯化钠2.5g，硫乙醇酸钠0.5g，0.1％刃天青1.0ml，琼脂0.75g，ph值7.1±0.2，蒸馏水1000ml。所述强化布氏血琼脂组成为：蛋白胨10.0g，酵母粉2.0g，胰酪蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖1.0g，亚硫酸氢钠0.1g，琼脂15.0g，ph值7.0±0.2，氯化血红素储藏液1ml，维生素k1工作液1ml，蒸馏水1000ml。对数期菌落浓度达到1×10⁹cfu/ml。

(3)试验动物的攻毒与观察：取上述对数期菌液腹腔注射接种小白鼠4只，0.2ml/只，同时设对照鼠4只，每只腹腔注入新鲜增菌培养液0.2ml。观察小白鼠发病与死亡情况。

注射8h后，试验组小鼠出现精神萎靡，状态不活跃，个别死亡现象，8-72h内小鼠死亡率高达80％以上。

(4)细菌分离鉴定：取小鼠心尖血，病变肠组织等部位作为样品，将采集的样品置于ft肉汤中厌氧条件(80％n2、10％co2以及10％h2)培养8～12h；将菌液混匀，接种添加d-环丝氨酸溶液的tsc培养基，36±1℃厌氧培养20～24h；产气荚膜梭菌在tsc选择培养基上，生长黑色圆形菌落，菌落周围形成浅黄色浊环。挑取特征单菌落于ft肉汤中备用。死亡小鼠剖检结果显示，小鼠内脏伴有出血现象，个别小鼠肠壁变薄，肠粘膜脱落等现象。取病变心尖血，病变肠组织等接种于tsc平板上，37℃培养18-24h，观察结果。具体操作方式为：将采集的样品接种添加d-环丝氨酸溶液的tsc培养基，36±1℃厌氧培养；产气荚膜梭菌在tsc选择培养基上，生长黑色圆形菌落，菌落周围形成浅黄色浊环。挑取tsc培养基上特征性单菌落，接种于ft肉汤中，厌氧培养8～12h备用。结果表明：分离出的菌落符合产气荚膜梭菌的菌落形态(见图2)。

(5)pcr鉴定结果判定：以上述菌液直接作为模板进行鉴定。已知的四种毒力基因引物，由金斯瑞生物科技有限公司合成：

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cpb(236bp)上游actatacagacagatcattcaacc

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引物在使用时用无菌超纯水稀释成10μmol/l。

pcr模板的制备过程为：挑取tsc培养基上特征性单菌落，接种于ft肉汤中，厌氧培养8-12h，此菌液可直接作为模板进行鉴定。或用接种环从tsc培养基上挑选纯培养物，置于0.5ml灭菌水中，12000r/min离心2min，弃上清，再加0.5ml灭菌水，悬浮并涡旋混匀，100℃沸水中煮沸10min后，移至冰上，冷却后以12000r/min离心2min，取上清液为pcr模板。

pcr反应体系为：12.5μl2×taqmastermix，引物各0.125μl，模板2μl，无菌超纯水补至25μl。pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，增30个循环；72℃终延伸10min，同时设立阴性和阳性对照。

电泳过程为：取5μlpcr扩增产物和5μlmarker加入加样孔，每次电泳时，各做阳性对照对照孔和阴性对照对照孔。电泳条件：电压110v，电泳时间30min。

结果判定：电泳结束后，取出胶块置于紫外投射仪上打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像分析。反应结果应同时符合以下7个条件，否则实验无效：

a)阴性对照未出现特异性条带；

b)a型产气荚膜梭菌阳性对照出现402bp的α毒素；

c)b型产气荚膜梭菌阳性对照出现402bp的α毒素、236bp的β毒素和541bp的ε毒素。

d)c型产气荚膜梭菌阳性对照出现402bp的α毒素和236bp的β毒素；

e)d型产气荚膜梭菌阳性对照出现402bp的α毒素和541bp的ε毒素；

f)e型产气荚膜梭菌阳性对照出现402bp的α毒素和317bp的ι毒素；

如果某一待检样品扩增产物的条带与产气荚膜梭菌阳性对照的条带在一条直线上，即条带与加样孔的距离相同，而阴性对照无此条带，则该样品分离到的菌株可初步判定为产气荚膜梭菌。

结果表明：该株菌为产气荚膜梭菌且菌株根据pcr毒素分型结果显示条带大小约为402bp，为a型菌。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。