一种利用米糠水解液发酵制备细菌纤维素的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用米糠水解液发酵制备细菌纤维素的方法。

背景技术：

稻谷是中国主要的粮食作物之一，其加工的副产物米糠虽然仅占稻谷质量的6%～8%，但是却占稻谷大约60%的营养成分。米糠中国每年的米糠产量为1400多万吨，居世界之首。米糠中的淀粉含量28%～42%、蛋白质含量10%～20%、脂肪含量11%～25%、膳食纤维含量23%～30%、灰分含量8%～12%、水分含量7%～15%，以及丰富的维生素和矿物质，开发潜力巨大，但目前精深加工不足，除了少数米糠原料用于提取米糠油和米糠蛋白，一般用来直接蓄养牲畜，极大地降低了米糠资源利用价值。

细菌纤维素（bacteriacellulose，bc）是由一些特殊的细菌产生的纤维素，与其他的纤维素相比，具有很多优良特性，如高结晶度、高纯度、高持水性等。bc可以广泛应用于很多行业中，在食品中，bc可以作为一种膳食纤维直接被食用具有较好的口感，由于其纤维素特性不易被人体所消化，可达到减肥的作用，还可以作为乳化剂和增稠剂。在医药方面，bc可以改善人体的消化环境，具有减少便秘、降低胆固醇、预防癌症等作用。在纺织行业，细菌纤维素可作为人造纤维材料用于衣物等的制作。

目前影响细菌纤维素工业化生产的主要瓶颈之一是较高的原料生产成本。已有研究报道利用木质纤维素、秸秆等生物质原料水解液作为细菌纤维素发酵的碳源，可以降低细菌纤维素的原料生产成本，但是在这些生物质原料水解液的制备过程中，预处理工艺阶段需要用到大量酸或碱液，严重污染环境；而且还需要对水解液进行脱毒处理，工艺复杂；此外，常规生物质原料作为发酵底物过程中，生物质中的淀粉、蛋白质等营养成分尚未充分利用。因此，亟需制备简单、绿色环保的生物质原料预处理工艺，以促进细菌纤维素的高效工业化生产进程。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种利用米糠水解液发酵制备细菌纤维素的方法的技术方案。该方法涉及了先对米糠原料进行高能纳米冲击磨机械预处理，获得米糠纤维粉末，经过糊化后，然后利用多种复合酶对米糠粉末进行液化、糖化酶解，得到富含葡萄糖的米糠水解液，通过添加适量酵母粉、蛋白胨等营养组分制备细菌纤维素发酵培养基，接种木醋杆菌后，进行ph调控的可控发酵制备细菌纤维素，再对发酵液中的细菌纤维素膜进行预处理，得到纯化的细菌纤维素。拓展了细菌纤维素原料的利用范围，使得预处理工艺更加绿色化，为细菌纤维素的大规模工业化绿制备奠定了基础。

所述的一种利用米糠水解液发酵制备细菌纤维素的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）米糠的机械预处理：将米糠经高能纳米冲击磨机械粉碎，得到米糠粉末；

2）米糠粉末的复合酶解：米糠粉末糊化后，利用复合酶对其进行液化、糖化酶解，得到米糠水解液；

3）米糠水解液的可控发酵：以米糠水解液为原料制备发酵培养基，接种木醋杆菌进行可控发酵；

4）细菌纤维素膜的灭菌：对发酵物进行灭菌，经冷却，固液分离后得到无菌细菌纤维素膜；

5）无菌细菌纤维素膜的纯化：利用复合清洗剂对无菌细菌纤维素膜进行洗涤，得到纯化的细菌纤维素膜。

所述的一种利用米糠水解液发酵制备细菌纤维素的方法，其特征在于所述高能纳米冲击磨条件为：工作腔体温度10～50℃，粉碎时间0.5～2.5h，得到米糠粉为50～100目。

所述的一种利用米糠水解液发酵制备细菌纤维素的方法，其特征在于所述复合酶进行液化、糖化酶解条件为：米糠底物的浓度为20～50g/l，在100℃条件下糊化30～60min；加入液化酶5～10u/g，85～90℃反应1～2h；反应结束后冷却至40～60℃，向水解液中加入纤维素酶10～20fpu/g、糖化酶100～300u/g，50℃，ph5～6，酶解12～24h，酶解后经抽滤得到米糠水解液。

所述的一种利用米糠水解液发酵制备细菌纤维素的方法，其特征在于所述发酵培养基含有酵母粉1～5g/l，蛋白胨1～5g/l，无水乙醇2～4ml/l，葡萄糖20～40g/l，葡萄糖含量为2～5%。

所述的一种利用米糠水解液发酵制备细菌纤维素的方法，其特征在于所述可控发酵条件：置于25～35℃恒温培养箱中，静置培养7d。

所述的一种利用米糠水解液发酵制备细菌纤维素的方法，其特征在于所述可控发酵采用ph恒定法，通过自动补加酸或碱，将ph控制在4.0～4.5。

所述的一种利用米糠水解液发酵制备细菌纤维素的方法，其特征在于所述木醋杆菌接种量为4-10%。

所述的一种利用米糠水解液发酵制备细菌纤维素的方法，其特征在于灭菌采用高压蒸汽灭菌，121℃，30min。

所述的一种利用米糠水解液发酵制备细菌纤维素的方法，其特征在于所述利用复合清洗剂对无菌细菌纤维素膜进行洗涤的步骤为：将灭菌后的细菌纤维素浸入1%的naoh溶液中煮沸30min，再利用稀醋酸溶液调节ph为中性，然后利用去离子水洗涤数次。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明方法制备工艺简单，米糠粉经机械预处理后，再经过复合酶系降解，不用经过脱毒处理工艺，即可将得到的米糠水解液用于制备细菌纤维素的发酵培养基。

2、本发明利用机械方法对米糠进行预处理，避免酸液和碱液的使用，具有安全、环保等特点，符合绿色制备工艺的要求，因此本发明具有较高的实用价值。

3、本发明采用多种酶系对米糠进行水解制备米糠水解液，充分保持了米糠中的淀粉、葡萄糖等多种营养组分，可以实现米糠生物质资源的高效利用和综合化利用。

4、本发明提供了一种以米糠水解液作为碳源制备细菌纤维素的方法，米糠来源丰富，价格低廉，既保护了环境，又创造了显著的经济效益。

附图说明

图1米糠水解液还原糖含量对细菌纤维素生产的影响；

图2接种量对细菌纤维素生产的影响；

图3温度对细菌纤维素生产的影响；

图4米糠水解液还原糖含量为4%时的细菌纤维素sem图；

图5接种量为8%时的细菌纤维素sem图；

图6发酵温度为30℃的细菌纤维素sem图；

图7细菌纤维素的xrd晶体衍射。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应当指出的是，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。

实施例1

步骤1）：米糠的机械预处理。将米糠经高能纳米冲击磨机械粉碎，工作腔体温度10℃，粉碎时间0.5h，得到50目的米糠粉末。

步骤2）：米糠粉末的复合酶解。米糠底物的浓度为20g/l，在100℃条件下糊化30min；加入液化酶（5u/g），85℃反应1h；反应结束后冷却至40℃，向水解液中加入纤维素酶（10fpu/g）、糖化酶（100u/g），50℃，ph5，酶解12h，酶解后经抽滤得到米糠水解液。

步骤3）：米糠水解液的可控发酵。以米糠水解液为原料，分别制备含有1%、2%、3%、4%和5%葡萄糖的发酵培养基，含有酵母粉1g/l，蛋白胨1g/l，无水乙醇2ml/l；接种2%已活化的木醋杆菌，置于30℃的恒温培养箱中进行发酵，静置培养7d。发酵过程中采用ph恒定法，通过自动补加酸或碱，将ph控制在4.0左右。

步骤4）：细菌纤维素膜的灭菌。对发酵物采用高压蒸汽灭菌，121℃，30min。经冷却，过滤分离后得到无菌细菌纤维素膜。

步骤5）：无菌细菌纤维素膜的纯化。将灭菌后的细菌纤维素浸入1%的naoh溶液中煮沸30min，再利用稀醋酸溶液调节ph为中性，然后利用去离子水洗涤数次，干燥后得到纯化的细菌纤维素膜。

结果如图1，当米糠水解液还原糖含量为4%时，bc产量达到最大值为0.295g/l，随着米糠水解液培养基中还原糖含量的上升，bc的产量反而下降。还原糖含量为4%时的细菌纤维素扫描电镜图（sem）见图4。

实施例2

步骤1）：米糠的机械预处理。将米糠经高能纳米冲击磨机械粉碎，工作腔体温度25℃，粉碎时间2h，得到100目的米糠粉末。

步骤2）：米糠粉末的复合酶解。米糠底物的浓度为30g/l，在100℃条件下糊化40min；加入液化酶（8u/g），90℃反应2h；反应结束后冷却至50℃，向水解液中加入纤维素酶（15fpu/g）、糖化酶（200u/g），50℃，ph5，酶解12h，酶解后经抽滤得到米糠水解液。

步骤3）：米糠水解液的可控发酵。以米糠水解液为原料，分别制备含有葡萄糖4%、酵母粉2g/l，蛋白胨3g/l，无水乙醇3ml/l的发酵培养基；接种2%～10%不同接种量已活化的木醋杆菌，置于30℃的恒温培养箱中进行发酵，静置培养7d。发酵过程中采用ph恒定法，通过自动补加酸或碱，将ph控制在4.5。

步骤4）：细菌纤维素膜的灭菌。对发酵物采用高压蒸汽灭菌，121℃，30min。经冷却，过滤分离后得到无菌细菌纤维素膜。

步骤5）：无菌细菌纤维素膜的纯化。将灭菌后的细菌纤维素浸入1%的naoh溶液中煮沸30min，再利用稀醋酸溶液调节ph为中性，然后利用去离子水洗涤数次，干燥后得到纯化的细菌纤维素膜。

结果如图2，随着接种量的增加bc产量也在随之增加，在8%时产量最大0.362g/l，其后随着接种量的增加反而呈下降趋势。接种量为8%时的细菌纤维素扫描电镜图（sem）见图5。

实施例3

步骤1）：米糠的机械预处理。将米糠经高能纳米冲击磨机械粉碎，工作腔体温度10℃，粉碎时间0.5h，得到50目的米糠粉末。

步骤2）：米糠粉末的复合酶解。米糠底物的浓度为30g/l，在100℃条件下糊化60min；加入液化酶（10u/g），85℃反应1h；反应结束后冷却至60℃，向水解液中加入纤维素酶（20fpu/g）、糖化酶（300u/g），50℃，ph5，酶解24h，酶解后经抽滤得到米糠水解液。

步骤3）：米糠水解液的可控发酵。以米糠水解液为原料，分别制备含有葡萄糖4%、酵母粉5g/l，蛋白胨5g/l，无水乙醇4ml/l的发酵培养基；接种2%~10%不同接种量已活化的木醋杆菌，置于不同温度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）的恒温培养箱中进行发酵，静置培养7d。发酵过程中采用ph恒定法，通过自动补加酸或碱，将ph控制在4.0。

步骤4）：细菌纤维素膜的灭菌。对发酵物采用高压蒸汽灭菌，121℃，30min。经冷却，过滤分离后得到无菌细菌纤维素膜。

步骤5）：无菌细菌纤维素膜的纯化。将灭菌后的细菌纤维素浸入1%的naoh溶液中煮沸30min，再利用稀醋酸溶液调节ph为中性，然后利用去离子水洗涤数次，干燥后得到纯化的细菌纤维素膜。

结果如图3，随着温度的上升，bc的产量逐步上升，在30℃达到最大产量0.558g/l，之后随着温度的上升呈现下降的趋势，40℃后醋酸菌将不再生产细菌纤维素。发酵温度为30℃时的细菌纤维素扫描电镜图（sem）见图6，此时细菌纤维素的xrd晶体衍射图如图7，布拉格角在14.34°、22.51°、29.43°有三个主峰。

项目资助：浙江省重点研发计划项目（2015c02031）。

以上对发明的具体实施例进行了描述。需要注意的是，本发明并不局限于上述特定的实施方式，本领域技术人员可以在权利要求范围内作出变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。