滑液囊支原体和鸡毒支原体的四重PCR检测试剂盒的制作方法

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种利用多重pcr技术快速检测滑液囊支原体和鸡毒支原体以及鸡毒支原体疫苗株f与野毒株的试剂盒。

背技景术

在我国禽类的养殖场中禽支原体感染率很高，禽支原体不仅可以进行水平传播，也可经种蛋垂直传播，长期存在于鸡群中，反复感染，常继发和或混合感染其它病原，给养禽业造成比较严重的隐性经济损失，也给养殖场的疾病防控带来隐患。目前国内外重要的禽支原体主要有鸡毒支原体(mycoplasmagallisepticum，mg)和滑液囊支原体(mycoplasmasynoviae，ms)。mg是引起鸡慢性呼吸道病和火鸡传染性窦炎的主要病原，感染鸡群常出现啰音、咳嗽、呼吸道粘膜卡他性炎症等症状，造成肉鸡胴体品质下降，种鸡产蛋率、受精率和孵化率下降等，而且经常与其它病原如大肠杆菌等细菌或(和)病毒混合感染，加重病情，使疾病复杂化，从而造成较大的经济损失。滑液囊支原体(mycoplasmasynoviae，ms)主要引起鸡的呼吸道感染，主要表现为亚临床性，一般不易察觉，如果并发感染鸡新城疫和传染性支气管炎，则引起气囊病变，但其程度远比mg感染引起的低。但ms感染可引起鸡的传染性滑膜炎，呈慢性感染过程，导致关节病变，出现跛行，影响仔鸡和蛋鸡的生产性能，免疫功能下降，增强其他传染病易感性。在临床上，mg与ms很难进行鉴别诊断。目前某些ms菌株因为在感染后呈隐性的呼吸道症状，控制不及时或不当，引起鸡的腱鞘炎、滑膜炎，影响鸡群生产性能，进而导致鸡群出现跛行，使蛋鸡产蛋量下降，肉鸡生长不良、胴体品质降低，对养禽业产生严重影响。

尽管禽支原体检测方法有病原分离、血清学检测方法、分子生物学检测方法等。但如何有效的快速检测和鉴别mg和ms，尤其如何快速有效地早期诊断ms是国内养鸡业所面临的亟需解决的重要问题。

使用疫苗免疫接种是防控支原体感染的重要举措，尽管由于近10年ms的危害日趋严重，国内还没有商品化疫苗，也尚未引进ms弱毒疫苗。而国内防治mg常应用商品化的弱毒疫苗或灭活油乳剂苗进行预防接种，其中弱毒疫苗的免疫效果优于灭活疫苗，但鸡群中使用弱毒疫苗，会导致鸡群长期受到疫苗株的污染，干扰mg的检测，影响鸡群mg的控制和净化。另外mg疫苗免疫不能阻止mg水平传播，因此存在部分鸡群会出现免疫后感染的情况。建立一种可以鉴别mg野毒株与mg弱毒疫苗株f(mg-f)，尤其是混合感染的检测方法，为及时准确地掌握鸡群内mg感染情况提供必要的技术支持。

在实际生产中，鸡毒支原体与滑液囊支原体在临床症状上较难区分。传统检测方法如分离鉴定法和血清学方法，不仅程序繁杂，工作量大，很难区分ms和mg，也根本无法区分鸡毒支原体野毒株与疫苗株f。尽管国内有学者曾报道mg强弱毒株的pcr诊断方法(多重聚合酶链反应快速检测鉴别鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株的研究[j].中国预防兽医学报,2003(06):77-80；鸡毒支原体强弱毒株荧光定量pcr鉴别检测方法的建立[j].中国兽医学报,2013,33(08):1206-1211.)，但不能区分强弱毒株混合感染的情况。目前虽有关于鸡毒支原体与滑液囊支原体双重pcr检测方法以及鸡毒支原体强弱毒株鉴别方法，如专利“鉴别鸡毒支原体强弱毒株的lamp检测试剂盒”(cn201210075432.x)，“一种检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重免疫荧光分析方法”(cn201610600687.1)，但是已公布的这些方法均无法实现同步检测mg与ms以及mg-f与mg野毒株。

目前，还没有采用多重pcr方法一次性检测出mg与ms，并同时区分疫苗株f株和mg野毒株。同时鉴别诊断ms与mg以及mg疫苗株f株与野毒株对鸡场支原体检测与净化具有重要意义。

本发明根据选取的靶基因保守区域设计合成了4对pcr引物，通过体系及反应条件优化，建立了一步反应同时检测滑液囊支原体和鸡毒支原体以及鸡毒支原体疫苗株f与野毒株的四重pcr检测方法。实践证明，本发明方法比常规的细菌分离鉴定灵敏度高且检测快速，可用于临床病例的快速诊断和流行病学调查，具有一定的实用性。本发明受国家重点研发计划项目“家禽重要疫病诊断与检测新技术研究”(项目编号：2016yfd0500800)资助。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种滑液囊支原体和鸡毒支原体的四重pcr检测试剂盒，在一次pcr反应中鉴定滑液囊支原体和鸡毒支原体的同时，还可进一步区分出鸡毒支原体弱毒疫苗株f株和野毒株。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

滑液囊支原体和鸡毒支原体的四重pcr检测试剂盒，包括4对引物：根据滑液囊支原体的热休克蛋白酶基因保守序列设计的ms的特异性引物(ms-s1/s2)，序列为seqidno.1-2；根据rlow株mga_0319基因保守区域设计的鸡毒支原体的通用引物(mg-t1/t2)，序列为seqidno.3-4；根据f株特有基因mgf_3486基因设计的鸡毒支原体弱毒疫苗株f株的特异引物(mg-f1/f2)，序列为seqidno.5-6；根据rlow株mga_0798基因保守序列设计的鸡毒支原体野毒株的特异引物(mg-q1/q2)，序列为seqidno.7-8。

滑液囊支原体和鸡毒支原体以及鸡毒支原体疫苗株f与野毒株的多重pcr检测方法，该方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总dna；

(2)以总dna为模板，并使用上述4对特异性引物进行多重pcr扩增；

(3)将扩增产物进行核酸电泳检测；

(4)结果判定：

若待测样本扩增出421bp的条带，则指示样本中含有滑液囊支原体(ms)；若待测样本扩增出279bp的条带，则指示所述待测样本中含有鸡毒支原体(mg)；进一步地，还可区分鸡毒支原体弱毒疫苗株f株和野毒株，扩增出585bp的条带则为含有鸡毒支原体野毒株的样本，扩增出750bp的条带则为含有鸡毒支原体弱毒疫苗株f株(mg-f)的样本。

进一步地，滑液囊支原体的特异性引物(ms-s1/s2)浓度为3.3μm，鸡毒支原体的通用引物(mg-t1/t2)浓度为1.66μm，鸡毒支原体弱毒疫苗株的特异引物(mg-f1/f2)浓度为2.5μm，鸡毒支原体野毒株的特异引物(mg-q1/q2)浓度为1.66μm。

进一步地，pcr扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸50s，34个循环反应；72℃延伸7min。

通过上述技术方案，本发明建立mg弱毒疫苗株f株、mg野毒株以及ms的多重pcr检测试剂盒，能够将检测时间缩短到2小时，达到如下的检测效果：

(一)多重检测

本发明提供的检测试剂盒能够在一次pcr反应中鉴定滑液囊支原体ms和鸡毒支原体mg的同时，区分mg弱毒疫苗株f株和野毒株，两个小时内能快速获得检测结果，节省时间、人力和物力成本。

(二)特异性高

本发明提供的检测试剂盒的特异性主要体现在一整套引物的特异性，所有引物都经过blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时特异性试验表明本发明的引物能够很好的区分鸡毒支原体弱毒疫苗株f株与野毒株以及经常与支原体继发感染的大肠杆菌，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确区分开来。

(三)成本较低

本发明提供的多重pcr检测试剂盒采用普通pcr原理，减低了使用荧光探针的高成本，同时保证了检测效果，与普通单重pcr方法相比较，该多重检测方法同时节省了重复检测同一个样本的试剂消耗，最大可节约90％试剂成本；在操作性上一次反应检测四个目标基因，节省了人力成本和物力成本。

本发明为mg弱毒疫苗株f株、mg野毒株以及ms的同步检测提供了整体的解决方案，能快速鉴别诊断mg疫苗免疫鸡群、感染鸡群以及ms感染鸡群，为养殖场mg和ms的净化提供技术支持。

附图说明

图1为mg-f株单重pcr特异性验证。

图2为mg野毒株单重pcr特异性验证。

图3为mg通用单重pcr通用性验证。

图4为ms单重pcr特异性验证。

图5为mg、ms灵敏性检测。

图6为为四重pcr检测人工感染试验样品。

图7为四重pcr检测临床样品。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅适用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

实施例1引物设计及特异性验证

选择ms热休克蛋白酶基因(jf449893)、mga_0319基因(ae015450.2)、鸡毒支原体mgf_3486基因(nc_017503.1)、mga_0798基因(ae015450.2)为靶标基因，将靶标基因进行blat比对分析，分别选取靶基因序列的保守区设计合成了4对多重pcr引物，分别为滑液囊支原体pcr引物(ms-s1/s2)、mg通用pcr引物(mg-t1/t2)、mg-f株特异性pcr引物(mg-f1/f2)以及mg野毒株通用pcr引物(mfg-q1/q2)，在引物设计过程中要区分各引物设计目的，选择合适的靶标位点，同时注意引物扩增条带大小，以便于通过差异化条带区分目的菌株。然后对上述引物进行单重pcr验证，确定引物的可用性，包括特异性和敏感性评估。

表1引物信息

1、引物合成：将上述所设计引物合成，以物质的量为单位，将上述四组引物混合，构成本实施例的引物组。所述引物的最终使用浓度各自为0.1-0.8μm，在本实施例中ms引物(ms-s1/s2)最终使用浓度为0.33μm，mg通用引物(mg-t1/t2)最终使用浓度为0.166μm，mg-f引物(mg-f1/f2)最终使用浓度为0.25μm，mg野毒株(mg-q1/q2)引物最终使用浓度为0.166μm。

2、特异性验证

mg-f株、mg强毒株s6株(mg-s6)以及hs株(mg-hs)、沙门氏菌(cvcc542)、大肠杆菌(atcc25922)均由华中农业大学微生物与免疫学实验室提供,滑液囊支原体wvu1853(ms-1853)由甘肃农业大学预防兽医系提供，链球菌(sc19)由华中农业大学预防兽医系农业微生物国家重点实验室提供。

上述样本用于特异性评估，分别进行总核酸的提取，每种样本提取的总核酸溶解于te缓冲液中，浓度为1ng/μl。

使用上述得到的每种样本的总核酸作为模板，用上述得到的引物组进行单重pcr扩增，并设置阴性对照。

按照如下操作配制反应体系：2×tappcrmix10μl，上下游引物各1μl，dna模板1μl，超纯水补至20μl。

反应的条件包括如下a-f的步骤：a：95℃5min；b：95℃30s；c:53℃30s；d：72℃50s；b-d循环34个反应；e：72℃7min；f：4℃∞。

将扩增产物以核酸胶进行分析，结果显示，仅相对应的菌株可以扩增出相应条带，其他对照以及阴性对照均无条带，说明本实施例的引物难以被无关病原体所干扰，具有较高的特异性。

实施例2多重pcr检测试剂盒

1、多重pcr检测试剂盒的组建

该试剂盒由2×tappcrmix(生工生物)、10×引物混合物、阳性对照(mg-f株、mg-s6株以及ms-1853的基因组dna混合物，每种浓度为1ng/μl)、超纯水构成。

表2引物浓度

2、试剂盒检测的反应体系为30μl，其配制如下：2×tappcrmix15μl，10×引物混合物3μl，模板3μl，超纯水9μl。

3、反应体系的配制

取200μl的pcr管配制30μl的反应体系，其配制如下：2×tappcrmix15μl，10×引物混合物3μl，模板3μl，超纯水9μl。以mg-f株、mg-s6株以及ms-1853的基因组dna混合物(每种dna浓度各为1ng/μl)作为阳性对照模板进行验证。

4、pcr反应

将装有30μl反应体系的pcr管放入bio-rad型pcr仪中，开启热盖后，按照如下程序进行pcr反应：a：95℃5min；b：95℃30s；c:53℃30s；d：72℃50s；b-d循环34个反应；e：72℃7min；f：4℃∞。

5、结果判断

根据鸡毒支原体弱毒疫苗株f扩增条带750bp、鸡毒支原体野毒株扩增条带大小585bp、鸡毒支原体通用扩增条带279bp、ms扩增条带421bp。判定某菌株是否是ms或鸡毒支原体，并可以区分鸡毒支原体株型。

结果显示，以上述基因组混合作为模板进行pcr扩增，可以扩增出四条区分明显的条带，分别为750bp的mgf_3486基因的扩增条带；585bp的mga_0798基因的扩增条带；279bp的mga_0319基因的扩增条带；421bp的ms热休克蛋白酶基因条带。

实施例3试剂盒的最低检测限试验

评估用检测样本：选择mg弱毒疫苗株f、mg-s6株、ms-1853株的基因组dna。将各基因组dna混合，使各基因组dna浓度均为1ng/μl，制成综合模板。将综合模板按10倍比稀释至10⁶倍，用四重pcr进行检测，同时检测单个引物的检测敏感性。

表34个目标基因敏感性

注：“+”表示有特异性dna带；“－”表示无特异性dna带

从表3可以看出，试剂盒检测鸡毒支原体f株、s6株以及ms的敏感性均可以达到100fg/μl，试剂盒总体的检测敏感性为100fg/μl。

可见，采用本发明实施例提供的引物组及试剂盒的检测敏感性与普通pcr相当，但是可以通过一步反应检测mg弱毒疫苗株f、mg野毒株、以及区分mg与ms的混合感染。

实施例4人工感染试验样品检测

选取7日龄未进行任何免疫的aa肉鸡，采取滴鼻免疫mg弱毒疫苗株f36和s6株，3天后采集混合“感染”鸡的鼻咽拭子样品6份，采用煮沸法提取基因组dna。具体操作为：将拭子浸入加有1ml无菌pbs缓冲液的ep管内，37℃温箱中静置30min，再将棉拭子反复挤压后丢弃。ep管内的液体于13000r/min离心15min，弃上清，加100μl灭菌双蒸水溶解沉淀物制成菌体悬液，将菌体悬液13000r/min离心10min收集菌体沉淀物，然后用100μlpbs重悬2次，最后用100μl灭菌双蒸水重悬菌体，100℃水浴15min后，立即冰浴10min，以12000r/min离心10min，上清即为模板。分别取3-10μl上清作为模板，根据农业部发布标准检测方法(ny/t553-2015)和本发明的四重pcr进行检测。结果发现(图6)，利用四重pcr方法检测混合“感染”样品，核酸电泳胶结果呈现750bp，585bp和279bp三条dna带，未检测到421bp的dna片段，这说明本发明的四重pcr方法均可检测到样品中的mg-f株、mg野毒株，未检测到ms。该结果与ny/t553-2015方法的检测结果一致。

实施例5临床样品检测

1、合肥某养禽公司鸡鼻咽拭子15份(21日龄)，利用天根dna提取试剂盒提取样品的dna，取3μl进行四重pcr检测，并与参考检测方法(农业部发布标准检测方法ny/t553-2015)进行比较。结果15份样品经dna试剂盒提取基因组后进行四重pcr检测到3份含有mg(样品7/10/13)，其中2份含有mg-f株(样品7/10)，还检测到2份含有ms(样品7/13)(图7)；使用参考检测方法从15份样品基因组dna中检测到3份含有mg(样品7/10/13)和2份含有ms(样品7/13)。

2、多年受困于ms感染的湖北省某种鸡场的鸡鼻咽拭子312份(其中163份为1日龄幼鸡样品，149份为种鸡样品)分别进行煮沸法提取基因组dna后进行四重pcr检测和参考检测方法(农业部发布标准检测方法ny/t553-2015)。结果四重pcr从312份样品中检测到7份样品含有ms，其中1份样品未能被参考方法检出，其余6份检测的结果一致，同时2种方法均未检测到mg。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

序列表

<110>华中农业大学

<120>滑液囊支原体和鸡毒支原体的四重pcr检测试剂盒

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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