鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊特异性扩增引物SP4124及其PCR检测方法与流程

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊特异性扩增引物sp4124及其特异、灵敏、快速pcr检测方法。

二、

背景技术：

鸡球虫病是由一种或多种艾美耳球虫寄生于鸡肠上皮细胞内，造成肠道病变和损伤的寄生虫病，呈全球性分布，在鸡常见的7种球虫中，毒害艾美耳球虫是鸡小肠球虫病最主要的致病性球虫种类，主要危害8～18周龄的育成鸡，病鸡常出现下痢、血便等临床症状，严重感染后引起的死亡率可以超过25％，对育成鸡的养殖造成严重威胁。

目前，用于鸡球虫临床检测的方法主要包括形态学、免疫学以及分子生物学等方法。传统形态学观察操作简便，能够实现对样品的快速检测，但其检出率较低，不能准确鉴别鸡球虫种类，且需要检测人员具备一定的专业知识。免疫学与血清学方面，国内外学者建立了多种检测鸡球虫的血清抗体反应，包括色素试验法、间接血凝试验、免疫荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验(elisa)等。但由于鸡的特异性抗体效价一般很低，因而血清学诊断法在实际应用时效果有限，在生产实践中不如检查粪便中卵囊的方法简便可靠。分子生物学方法具有灵敏度高及特异性强的优点，可有效对鸡球虫种类进行鉴别，弥补了传统形态学和血清学检测的不足，已被广泛应用于鸡球虫的鉴别和诊断。鸡球虫的分子生物学检测法包括同工酶技术、随机扩增多态性dna(rapd)、常规pcr和多重pcr等。同工酶技术利用ldh和gpi酶的不同的种特异性迁移率进行虫种鉴别，但同一种内可能有亚带的变化。rapd技术利用大量随机引物对全基因组中差异位点进行分析鉴别，技术简单，灵敏度高，能呈现全基因组范围内的差异，但由于该技术重复性较差，导致其在实际应用上存在一定的局限性。

另外已有研究者建立了基于鸡球虫18srdna序列、its-1序列的pcr法，可有效鉴别鸡球虫种类。但由于在球虫生活史中，从裂殖子到子孢子经历的一系列变化是由基因的差异表达实现的，基因组本身并未发生变化，所以这些基于基因组dna建立的pcr方法不能对鸡球虫未孢子化和孢子化卵囊进行有效鉴别。

三、

技术实现要素：

本发明提供鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊特异性扩增引物sp4124及其pcr检测方法，其利用rna-seq技术，筛选出毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的一个特异表达基因(geneid:25471018)并设计特异性引物，建立用于检测毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的特异性pcr检测方法，为鸡毒害艾美耳球虫的临床检测应用和推广提供理论依据和技术支撑。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的特异性扩增引物，其特征在于：所述特异性引物序列如下：

sp4124-f：5’-actacacaagtcccgtcaaac-3’；

sp4124-r：5’-ctatgctgtcttcctctatccc-3’。

特异性扩增引物在检测鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊中的pcr检测方法，其特征在于：所述的检测方法为：首先富集纯化待测样本中的卵囊，提取卵囊总rna并通过反转录得到cdna，然后以cdna为模板，用特异性引物进行pcr扩增并对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现444bp的特异条带，提示待测样本中存在毒害艾美耳球虫孢子化卵囊。

所述的pcr检测方法的具体步骤为：

(1)卵囊富集与纯化：饱和盐水漂浮法收集待测样品中的毒害艾美耳球虫卵囊，再经蔗糖浓度梯度离心和次氯酸钠溶液处理获得纯化后的卵囊；

(2)总rna提取与cdna合成：加入trizol试剂和玻璃珠涡旋使卵囊破壁释放出子孢子，trizol法提取卵囊总rna，参照takara反转录试剂盒的方法合成cdna；

(3)pcr扩增：以卵囊cdna为模板，用特异性引物进行pcr扩增，所述pcr扩增体系为：模板cdna2μl，10×pcrbuffer(mg²⁺free)2.5μl，mgcl2(25mm)2μl，dntp(2.5mm)2μl，上游引物、下游引物均为10mm，各1μl，rtaq酶(5u/μl)0.125μl，ddh2o14.375μl。pcr反应条件经优化确定为：94℃预变性5min；94℃变性45s、56℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；

(4)pcr产物的电泳检测：若电泳结果出现444bp的特异条带，则待测样本中存在毒害艾美耳球虫孢子化卵囊。

一种包含鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的特异性扩增引物的试剂盒。

所述的试剂盒在检测鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

1)本发明提供一种鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的特异性检测方法，能够有效鉴别毒害艾美耳球虫未孢子化和孢子化卵囊，且灵敏度高、特异性强，仅需一些最基本的分子检测仪器(如pcr仪，电泳仪等)和相应试剂盒就可实现，检测结果也能通过电泳图直观地展现出来；

2)在实验操作程序方面，由于该检测方法主要在分子生物学检测仪器中进行，而对于检测涉及到的特异靶基因位点，特异引物等关键因素，本发明已经通过前期实验进行了筛选、验证和优化，因此，进行操作时，无需太多理论知识储备，只需按照说明进行相应操作和参数设定即可顺利完成检测；

3)本发明灵敏度试验结果显示，毒害艾美耳球虫孢子化卵囊cdna阳性样品稀释256倍(即浓度达到0.8ng/μl)后，也能够检出；

4)本发明特异性实验结果显示，通过前期实验，本发明所筛选确定靶基因位点(geneid:25471018)是鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊发育阶段特异表达的基因，因此，基于该基因cdna设计合成的特异性pcr扩增引物(sp4124-f：5’-actacacaagtcccgtcaaac-3’；sp4124-r：5’-ctatgctgtcttcctctatccc-3’)能够准确、特异性地检测出鸡毒害艾美耳球虫的孢子化卵囊，而对未孢子化卵囊检测则呈阴性；

5)本发明检测方法可以对不同来源临床样品中的鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊进行特异、快速、高效的检测；

6)本发明可为鸡毒害艾美耳球虫的临床检测应用和推广提供理论依据和技术支撑。

四、附图说明:

图1特异pcr引物扩增产物电泳图；

图2mg²⁺浓度优化图；

图3退火温度梯度图；

图4敏感性试验图；

图5特异性试验图。

五、具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定：

本发明通过rna-seq(转录组测序)技术筛选出孢子化卵囊的阶段特异性mrna以及特异表达基因，实现了从转录本层面鉴别未孢子化和孢子化卵囊。

本发明一种用于检测鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的特异性扩增引物(sp4124)序列如下：

sp4124-f：5’-actacacaagtcccgtcaaac-3’；

sp4124-r：5’-ctatgctgtcttcctctatccc-3’。

特异性扩增引物在检测鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊中的pcr检测方法为：首先富集纯化待测样本中的卵囊，提取卵囊总rna并通过反转录得到cdna，然后以cdna为模板，用特异性引物进行pcr扩增并对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现444bp的特异条带，提示待测样本中存在毒害艾美耳球虫孢子化卵囊。

pcr检测方法的具体步骤为：

(1)卵囊富集与纯化：饱和盐水漂浮法收集待测样品中的毒害艾美耳球虫卵囊，再经蔗糖浓度梯度离心和次氯酸钠溶液处理获得纯化后的卵囊；

(2)总rna提取与cdna合成：加入trizol试剂和玻璃珠涡旋使卵囊破壁释放出子孢子，trizol法提取卵囊总rna，参照takara反转录试剂盒的方法合成cdna；

(3)pcr扩增：以卵囊cdna为模板，用特异性引物进行pcr扩增，所述pcr扩增体系为：模板cdna2μl，10×pcrbuffer(mg²⁺free)2.5μl，mgcl2(25mm)2μl，dntp(2.5mm)2μl，上游引物、下游引物均为10mm，各1μl，rtaq酶(5u/μl)0.125μl，ddh2o14.375μl，pcr反应条件经优化确定为：94℃预变性5min；94℃变性45s、56℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；

(4)pcr产物的电泳检测：若电泳结果出现444bp的特异条带，则待测样本中存在毒害艾美耳球虫孢子化卵囊。

本发明还包括包含鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的特异性扩增引物的试剂盒，试剂盒用于检测鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊。

实施例：

1)首先根据genbank中的毒害艾美耳球虫基因位点(geneid:25471018)及其cdna参考序列设计跨内含子引物，参考序列如下：

靶基因位点(geneid:25471018)参考序列：

cdna参考序列：

2)毒害艾美耳球虫孢子化卵囊特异基因cdna的特异性引物筛选合成。引物序列如表1：

表1毒害艾美耳球虫pcr检测特异性引物

3)卵囊富集与纯化：

卵囊富集：将待检样品依次通过80目、200目的网筛，滤液转移至50ml离心管中，3500r/min离心5min，弃上清；加入蒸馏水重悬后重复离心操作至上清澄清；弃去上清后加入5倍沉淀体积的饱和盐水，1700r/min离心5min，用直径1cm的铁环在液面蘸取卵囊液至另一新离心管中，直至镜检未见卵囊；将剩余上清和沉淀混匀后离心，重复上步操作2～3次；卵囊液加入蒸馏水后3500r/min离心5min，弃上清洗去盐分，重复2～3次；

卵囊纯化：将128g蔗糖溶解于100ml水中制得a液，以a液为基础，制成b液(3倍a液+1倍水)、c液(3倍b液+1倍水)、d液(3倍c液+1倍水)；用50ml的离心管，从底部开始轻轻将等量a、b、c、d液分层依次加入管中，将卵囊混匀，取少量加于d液上部，厚度约为1cm，1000r/min离心3min；将d液上一层的液体吸掉，只将d液层(含卵囊)移入新的离心管中，用10倍蒸馏水稀释后，3500r/min离心8min，沉淀物即为卵囊；按与所得沉淀1∶1的比例加入次氯酸钠溶液，4℃放置18～20min，加满水后3500r/min离心10min，弃上清，重复3次获得纯化后的卵囊；

4)总rna提取与cdna合成：取出纯化后的卵囊，加入500μltrizol和等体积1㎜玻璃珠(无rna酶)冰上涡旋震荡破壁10min至子孢子逸出，用trizol法提取卵囊总rna，经完整性检测和纯度分析合格后参照takara反转录试剂盒的方法合成cdna，－20℃保存备用。上述rna相关操作均在无rna酶的条件下进行。

5)根据步骤2所合成的毒害艾美耳球虫孢子化卵囊特异性pcr扩增引物，对步骤4制得的待检测样品cdna进行pcr扩增，扩增产物的电泳检测结果如图1，m.dl2000marker；1.毒害艾美耳球虫孢子化卵囊cdna；2.阴性对照，目的条带大小为444bp；

6)将pcr阳性扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，通过blast比对验证其为目的扩增序列。

7)根据步骤2和步骤5的试验数据，确定毒害艾美耳球虫孢子化卵囊特异性引物，并进行反应条件的优化。

在pcr体系中分别加入1μl、1.5μl、2μl、2.5μl、3μl、3.5μl、4μlmgcl2进行pcr扩增，试验结果如图2，m.dl2000marker；1.1μlmgcl2；2.1.5μlmgcl2；3.2μlmgcl2；4.2.5μlmgcl2；5.3μlmgcl2；6.3.5μlmgcl2；7.4μlmgcl2，最终选择2μl作为最优mgcl2用量。分别在45℃、49℃、54℃、56℃、59℃、60℃的退火温度下进行pcr扩增，试验结果如图3，m.dl2000marker；1.45℃；2.49℃；3.54℃；4.56℃；5.59℃；6.60℃；7.阴性对照，最终选择56℃作为最适退火温度。优化后的pcr反应体系如表2，反应条件如下：

表2pcr反应体系(单位：μl)：

pcr反应条件：

8)对设计合成的特异性引物进行敏感性试验。

将毒害艾美耳球虫孢子化卵囊cdna阳性样品(起始浓度为200ng/μl)，用双蒸水依次作1:4、1:16、1:64、1:256、1:1024、1:4096稀释。稀释后不同浓度的样品在本研究中设定的反应体系和条件下进行试验。试验结果如图4，m.dl2000marker；1.cdna原液；2.1:4稀释液；3.1:16稀释液；4.1:64稀释液；5.1:256稀释液；6.1:1024稀释液；7.1:4096稀释液；8.阴性对照；

9)对设计合成的特异性引物进行特异性试验。

以毒害艾美耳球虫孢子化卵囊cdna阳性样品为对照，用本发明设计合成引物对毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊cdna进行扩增。试验结果如图5，m.dl2000marker；1～5.未孢子化卵囊cdna样品；6～9.孢子化卵囊cdna样品；10.阴性对照；

上述结果充分说明本发明是一种灵敏度高、检测时间短、特异性强、操作简单的毒害艾美耳球虫孢子化卵囊检测方法，可以对不同来源临床样品中的鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊进行特异、快速、高效的检测，具有一定的开发、利用和易于广泛推广的潜在价值，可为鸡毒害艾美耳球虫的临床检测应用和推广提供理论依据和技术支撑。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围，凡是利用本发明的说明书及附图内容所做的等同结构变化，均应包含在本发明的专利保护范围内。

sequencelisting

<110>西北农林科技大学

<120>鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊特异性扩增引物sp4124及其pcr检测方法

<130>2019

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1489

<212>dna

<213>人工合成

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